二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的定量检测方法

二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学分析技术领域，尤其涉及二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成 分的定量检测方法。
【背景技术】
[0002] (N- (3-氯代-4- (3-氟代苄氧基）苯基）-6- (3- (4-甲基-4-氧基-1-氮-4-磷杂 环己烷-1-基）丙-1-炔基）喹唑啉-4-胺，双4-甲基苯磺酸盐），又名二对甲苯磺酸缘 生替尼，是近年来研发出的I型受体蛋白激酶抑制剂的包含磷取代的新喹唑啉衍生物，可 用于治疗哺乳动物中与蛋白激酶活性异常相关的疾病，如癌症或炎症。其结构式如式I所 示：
[0003]
[0004] 二对甲苯磺酸缘生替尼作为一种新研发出的药物，为了保证其质量及用药的安全 性，在生产和使用的过程中，都需要对原料药中的有效成分含量、有关物质种类及含量、残 留溶剂、微生物情况进行检测和分析。目前采用中国药典附录收载的通用方法对上述指标 进行检测。然而，中国药典中记载的方法为通用方法，其专属性不强，容易造成精密度和灵 敏性的降低。因此，进一步开发精密度、灵敏度、专属性强的二对甲苯磺酸缘生替尼原料药 中二对甲苯磺酸缘生替尼的含量测定方法十分必要。

【发明内容】

[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种精密度、灵敏度、专属性强的二 对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的定量检测方法。
[0006] 本发明提供的二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的定量检测方法为，将二 对甲苯磺酸缘生替尼原料药溶解，以甲醇水溶液为流动相，以高效液相色谱检测获得色谱 图，根据色谱图获得二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的含量。
[0007] 利用高效液相色谱（HPLC)对物质进行定量检测是目前常用的检测方法，在面对 需要对二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的含量进行定量分析时，采用高效液相色 谱是一种快速有效的方式。但是，现有技术中，并没有报道如何采用HPLC对二对甲苯磺酸 缘生替尼进行定量检测，而当采用HPLC对一种新的物质进行检测时需要对该方法进行系 统适用性、专属性、精密度、耐用性等多方面的鉴定，具体标准为：
[0008] 系统适用性：二对甲苯磺酸缘生替尼标准溶液连续进样6针主峰面积 RSD^ 2. 0%；
[0009] 专属性：在酸、碱、氧化、高温、光照降解试验的图谱中，主峰的纯度因子应大于阈 值。
[0010] 耐用性：主要考虑溶液稳定性：供试品溶液在24h内稳定，并且要求检测条件的微 小变化对主峰含量的测定影响不大，分离度、理论塔板数均符合要求。
[0011] 重复性：配制6个供试品溶液，每个溶液进2针，用对照品溶液计算主成份含量，要 求6个结果的RSD不得大于2. 0%。
[0012] 中间精密度：由不同分析员，使用不同的仪器，在不同日期对同一批样品进行检 测。要求6份样品的测定结果RSD不得大于2.0%。
[0013] 另外，要求样品线性及范围回归系数r多0.999;检测范围至少在进样浓度的 80%~120%的范围内。
[0014] 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要 求流动相对样品具有一定的溶解能力且与样品不产生化学反应，其黏度要尽量小，以便得 到好的分离效果；且流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用紫外检测器，则应 使用对紫外吸收较低的溶剂配制。其沸点不可以太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进 行。对于二对甲苯磺酸缘生替尼而言，以甲醇水溶液作为流动相能够保证更好的检测效果， 优于其他流动相的检测结果。
[0015] 在一些实施例中，甲醇水溶液中甲醇的体积分数为69 %~76 %。
[0016] 在一些实施例中，甲醇水溶液中甲醇的体积分数为72 %~76 %。
[0017] 在一些实施例中，甲醇水溶液中甲醇的体积分数为72 %。
[0018] 流动相的流速过高会降低塔板数，而塔板数的降低会导致样品分离度的降低。
[0019] 在一些实施例中，流动相的流速为0·8mL/min~1. 2mL/min。
[0020] 在一些实施例中，流动相的流速为lmL/min。
[0021] 对本发明提供的方法而言，二对甲苯磺酸缘生替尼的极性，选择C18色谱柱。色谱 柱的尺寸会对分离结果产生影响，其内径会对流动相的流速产生影响，长度较短的色谱柱 运行时间短，柱压较低；长度较长的色谱柱分辨率稿，但运行时间增长。
[0022] 在一些实施例中，高效液相色谱检测的色谱柱为WatersSymmetryC18柱。
[0023] 在一些实施例中，色谱柱的尺寸为250mmX4. 6mm，5μm。
[0024] 对柱温的选择需考虑待分离物质本身的特性，柱温影响流动相对待测物质的溶解 度也会影响柱压。一般情况下，提高柱温有利于提高分离度，但温度过高会导致柱压过低， 不利于物质的检出。
[0025] 在一些实施例中，高效液相色谱检测的柱温为35°C~45°C。
[0026] 在一些实施例中，高效液相色谱检测的柱温为40°C。
[0027] 在一些实施例中，溶解的溶剂为体积分数为70%的甲醇水溶液。
[0028] 在一些实施例中，高效液相色谱检测的运行时间为25min。
[0029] 在一些实施例中，溶解至二对甲苯磺酸缘生替尼原药的浓度为100μg/mL。
[0030] 根据二对甲苯磺酸缘生替尼的紫外吸收图谱，设置高效液相色谱检测的波长为 240nm〇
[0031] 在一些实施例中，高效液相色谱检测的进样量为10μL。
[0032] 在一些实施例中，获得二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的含量的方法 为：根据二对甲苯磺酸缘生替尼样品浓度与高效液相色谱检测所得峰面积绘制标准曲线， 根据标准曲线获得二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的含量。
[0033] 在一些实施例中，标准曲线的绘制方法为：以二对甲苯磺酸缘生替尼样品的浓度 为横坐标，以HPLC检测色谱图中二对甲苯磺酸缘生替尼的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
[0034] 本发明提供了二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的定量检测方法，该方法 将二对甲苯磺酸缘生替尼原料药溶解，以甲醇水溶液为流动相，以高效液相色谱检测获得 色谱图，根据色谱图获得二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的含量。采用本发明提 供的方法，二对甲苯磺酸缘生替尼标准溶液连续进样6针主峰面积RSD为0. 22%;二对甲苯 磺酸缘生替尼杂质峰不影响二对甲苯磺酸缘生替尼原料的检查，在酸、碱、氧化、高温、光照 降解试验的图谱中，主峰的纯度因子均大于阈值；主要考虑溶液稳定性：供试品溶液在24h 内稳定，并且流速范围在0. 8ml/min~1. 2ml/min之内、柱温范围在35°C~45°C之内、流动 相中甲醇的质量分数在72%~76%范围内皆可获得良好的分离度。并且，检测结果表明， 采用本发明提供的方法重复性RSD为0. 96%，中间精密度RSD为1. 23%，原料药线性及范 围回归系数为r= 0.9997。
【附图说明】
[0035] 图1示本发明提供方法检测二对甲苯磺酸缘生替尼标品的标准曲线。
【具体实施方式】
[0036] 本发明提供了二对甲苯磺酸缘生替尼原料药中有效成分的定量检测方法，本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范 围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0037] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0038] 其中，二对甲苯磺酸缘生替尼原料药的制备方法为：
[0039] 将301g3-氯代-4- (3-氟代-苄氧基）-苯胺和3. 28g4-氯代-6-碘代-喹唑啉 溶解在50mL异丙醇中，将反应混合物回流12小时，通过过滤手机固体产物，用10mL冷异丙 醇和20mL乙醚洗涤，晾干得到3. 8g[3-氯代-4- (3-氟代-苄氧基）-苯基]-(6-碘代-喹 唑啉-4-基）-胺盐酸盐；
[0040] 在parr振荡器中在60psi下将1-苄基-4-甲基-1，4-氮杂膦-4-氧化物（5g) 的甲醇溶液（5〇mL)和3mol/LHC1 (10mL)与碳载钯（10%，1.Og) -起氢化24小时，混合物 经硅藻土过滤，在减压下去除所有溶剂以得到白色晶体固体4-甲基-1，4-氮杂膦-4-氧化 物盐酸盐，其使用无需进一步纯化；
[0041]向Cs2C03 (1. 3g，4.Ommol)、丙酮（5.OmL)和 4-甲基-1，4-氮杂膦-4-氧化物盐酸 盐（0. 338mg，2.Ommol)的混合物中添加炔丙基氯（150mg，2.Ommol)。在50°C下搅拌混合物 过夜，过滤并浓缩，得到浅棕色固体：4-甲基-1-(丙-2-炔基）-1，4-氮杂膦，4-氧化物， 进行下一步骤无需进一步纯化；
[0042] 在队气氛下将胺、4-甲基-1-(丙-2-炔基）-1，4_氮杂膦，4-氧化物（205mg， 1. 2mmol)、碘、[3-氯代-4- (3-氟代-苄氧基）-苯基]-(6-碘代-喹唑啉-4-基）-胺盐 酸盐（505mg，1.Ommol)、PdCl2 (PPh3) 2 (35mg，5%mol)、Et3N(l.OmL)和Cul(64mg，20%mol) 在lOmLDMF中的混合物加热过夜。浓缩并通过硅胶上的快速柱层析（5%MeOH，DCM中）纯 化，得到作为棕色粉末的期望产物，即N- (3-氯代-4- (3-氟代苄氧基）苯基）-6- (3- (4-甲 基-1，4-氮杂膦-1-基）丙-1-炔基）喹唑啉-4-胺。LCMSESI⑴m/z:550(M+1)。
[0043] 虫匪1?(0)3(? 300MHz)δ7. 96(d，J= 2. 4Hz，1H)，7· 83(dd，Jl= 3. 6Hz，J2 = 8. 1Hz，1H)，7. 71 (d，J= 8. 4Hz，1H)，7. 60 (dd，J1 = 2. 7Hz，J2 = 9. 3Hz，1H)，7. 39 (td，J1 =0· 7Hz，J2 = 7. 5Hz，1H)，7. 29(d，J= 7. 5Hz，1H)，7. 24(d，J= 9. 9Hz，1H)，7. 13(d，J= 9. 0Hz，1H)，7. 05 (td，J1 = 1. 8Hz，J2 = 8. 1Hz，1H)，5. 21 (s，2H)，3. 73 (s，2H)，3. 35 (s，1H)， 3. 20(m，2H)，3. 00(m，2H)，2. 00(m，4H)，1. 62(d，J= 13. 2Hz，3H)。
[0044] 将得到的N- (3-氯代-4- (3-氟代苄氧基）苯基）-6- (3- (4-甲基-1，4-氮杂 膦-1-基）丙-1-炔基）喹唑啉-4-胺（即缘生替尼）和对甲苯磺酸溶于溶剂（异丙醇： 水=10:1)，其中，缘生替尼和对甲苯磺酸的摩尔比为1:2。加热回流反应10小时后冷却结 晶，以甲醇打浆lh抽滤得到得到二对甲苯磺酸缘生替尼原料药，作为样品。
[0045] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0046] 实施例1