一种lc-ms/ms检测唾液中尼古丁及其代谢物的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的试剂盒，属于分析检测
技术领域。
【背景技术】
[0002] 尼古丁是烟草中的重要成分，主动吸烟和被动吸烟都会对身体产生不利影响，如 心血管疾病、慢性阻塞性肺病甚至癌症，吸烟上瘾已成为当今社会危害公众健康的一大突 出现状。尼古丁在人体内的主要代谢物有可替宁和3-羟基可替宁等多种物质，其中可替宁 就占所有代谢物的70 %-80 %。据报道，尼古丁及其代谢物在不同体液(血液、尿液和唾液） 中的浓度水平与烟气暴露量密切相关，其含量水平可评估吸烟、戒烟行为以及环境烟气暴 露程度。因此，建立一种快速准确的方法同时检测尼古丁及其代谢物至关重要。
[0003] 同样，标本的选择也很关键。目前已有方法用于血浆、尿液、唾液等样本的尼古丁 代谢物的分析。尿液的采集较血液无创伤性，且尿液中的可替宁比血液中的含量高，但是尿 样会受尿量的影响造成测定误差。研究数据显示，唾液可替宁和血液可替宁的相关性很高。 因此，选择唾液标本作为尼古丁代谢物的测定是最简单可行的。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物 的试剂盒。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的试剂盒，其中，所述的代谢物为可 替宁和3-羟基可替宁;所述的试剂盒包括如下试剂：
[0007] (1)洗脱液：
[0008] 洗脱液A: 0.1 %v/v甲酸水溶液；
[0009 ] 洗脱液B: 0.1 %v/v甲酸甲醇溶液；
[0010] (2)混合标准液A:含尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的甲醇溶液；
[0011] (3)内标液B:含氘代可替宁的甲醇溶液；
[0012] ⑷稀释液：
[0013] 稀释液1:非吸烟者唾液;本发明所述的非吸烟者唾液是非主动吸烟者且非被动吸 烟者的唾液，该非吸烟者唾液未经前处理，购买试剂盒后可自行按照说明与待测唾液样本 同步进行前处理；
[0014] 稀释液2:甲醇；
[0015] (5)有机溶剂：乙腈
[0016] (6)质控品：含有尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的非吸烟者唾液，分高中低三个 浓度度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H);
[0017] 其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的对应浓度见表1;
[0018] 表1尼古丁及其代谢物质控品对应浓度单位ng/mL
[0019]
[0020] 其中，所述的混合标准液A中，尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的浓度均为1 .Oyg/ mL〇
[0021] 其中，所述的内标液B中，氖代可替宁的浓度为1.Oyg/mL。
[0022] 上述LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的试剂盒的制备方法如下：
[0023] (1)洗脱液：
[0024] 洗脱液A: 0 · 1 %v/v甲酸水溶液；
[0025] 洗脱液B: 0 · 1 %v/v甲酸甲醇溶液；
[0026] (2)混合标准液A:
[0027] 分别准确称取10.Omg尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁，分别加入lmL甲醇溶解，配 制成浓度均为10. 〇mg/mL标准品母液；分别从以上标准品母液中移取100yL用甲醇定容至 1mL，稀释到浓度为1.Omg/mL，然后再用甲醇将这3种标准品的浓度由1.Omg/mL逐级稀释至 10yg/mL;接着分别取lmL浓度为10yg/mL的尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁加入到15mL离心 管中，再加去离子水定容到10mL，得到尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的浓度均为l.Oyg/ mL的混合标准液A;
[0028] (3)内标液8:
[0029] 准确称取10 .Omg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.Omg/mL的 内标溶液;然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.Omg/mL稀释至1.Oyg/mL，得到内标液B;
[0030] (4)稀释液：
[00311 稀释液1:非吸烟者唾液；
[0032] 稀释液2:甲醇；
[0033] (5)有机溶剂：乙腈
[0034] (6)质控品：取混合标准液A20yL、100yL、500yL分别用稀释液1定容至10mL得到QC (L)、QC(M)、QC(H)。
[0035] 上述LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的试剂盒在检测唾液中尼古丁及其 代谢物中的应用也在本发明的保护范围之内；其中，所述的代谢物为可替宁和3-羟基可替 宁。
[0036] -种LC-MS/MS检测唾液中尼古丁及其代谢物的方法，其中，所述的代谢物为可替 宁和3-羟基可替宁；
[0037]利用LC-MS/MS分别检测标准品溶液和经过预处理的唾液样品，利用同位素内标定 量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线， 并计算出唾液中尼古丁及其代谢物的浓度，具体色谱条件为：
[0038] (1)色谱条件：
[0039] 流动相A:0 · 1 %v/v甲酸水溶液；
[0040] 流动相B:0.1 %v/v甲酸的甲醇溶液；
[0041]色谱柱型号：UltimateSi02,2.IX100mm，3ym;
[0042]流速为 〇.2mL/min;
[0043]柱温为 35°C;
[0044] 进样体积为10yL;
[0045] 采用梯度洗脱的方式，见表2;
[0046]表2流动相梯度洗脱参数
[0047]
[0048] (2)质谱条件：
[0049]在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾电压为 5500V;碰撞气为Medium;气帘气为40kPa;离子源雾化气和加热辅助气均为60kPa;去溶剂温 度为550°C。
[0050]其中，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到：
[0051]分别准确称取10.Omg尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁，分别加入lmL甲醇溶解，配 制成浓度均为10.Omg/mL标准品母液；分别从以上标准品母液中移取100yL用甲醇定容至 1mL，稀释到浓度为1.Omg/mL，然后再用甲醇将这3种标准品的浓度由1.Omg/mL逐级稀释至 10yg/mL;接着分别取lmL浓度为10yg/mL的尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁加入到15mL离心 管中，再加去离子水定容到10mL，得到尼古丁、可替宁和3-羟基可替宁的浓度均为1.0yg/mL 的混合标准液A;
[0052] 准确称取10.Omg氘代可替宁内标品，加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.Omg/mL的 内标溶液;然后再用甲醇将内标溶液的浓度由1.Omg/mL稀释至1.Oyg/mL，得到内标液B; [0053] 移取100yL混合标准液A于1.5mL离心管中，向其中加入100yL空白唾液基质作为第 一个高值浓度点；移取20此混合标准液A用空白唾液基质定容至200yL得到第二个浓度点； 接着，移取l〇yL混合标准液A用空白唾液基质定容至500yL，取200yL作为第三个浓度点；分 别取50、25、5yL的第三个浓度点分别定容至200yL，得到其它3个校准浓度点，这六个浓度点 体积均为200yL;接着向其中各加入10yLlyg/mL同位素内标液B，再加入400yL乙腈，然后涡 旋数秒后振荡lOmin，14000r/min离心5min后取50yL上清液，再加入50yL去离子水，混勾后 即得标准品溶液。
[0054]其中，所述的空白唾液基质为非吸烟者（指非主动吸烟者且非被动吸烟者）的唾液 基质。
[0055] 其中，所述的唾液样品按如下方法预处理得到:取200yL唾液于1.5mL离心管中，向 其中加入10yLlyg/mL内标液B，再加入400yL乙腈，然后涡旋数秒后振荡lOmin，14000r/min 离心5min后取50yL上清液，再加入50yL去离子水，混匀后即得唾液样品。
[0056] 其中，所述的内标液B按如下方法制备得到:准确称取10.Omg氘代可替宁内标品， 加入10mL甲醇溶解，得到浓度为1.0mg/mL的内标溶液;然后再用甲醇将内标溶液的浓度由 1 ·Omg/mL稀释至1 ·Oyg/mL，得到内标液B。
[0057] 有益效果:本发明试剂盒灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内 可完成分离和检测，精密度和稳定性满足要求，而且唾液样本采集方便且无创伤性，可用于 评估吸烟、戒烟行为以及环境烟气暴露程度研究。
【附图说明】
[0058]图1.尼古丁及其代谢物标准品的选择离子流图。
[0059] 图2.非吸烟者空白唾液中尼古丁及其代谢物的选择离子流图。
[0060] 图3.吸烟者唾液中尼古丁及其代谢物的选择离子流图。
【具体实施方式】
[0061] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0062] 实施例1:
[0063] 1.材料
[0064] 方法学研究实验的样本来自于上海迪安医学检验所员工的唾液样本。
[0065] (1)仪器:API4000+三重四级杆质谱仪(ABSCIEX公司）；ekspert'ultraLC100液 相色谱系统(配自动进样器）；医用高速冷冻离心机(北京白洋医疗器械有限公司）；超纯水 仪(成都优普超纯科技有限公司）；多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司）；快速混匀器 (姜堪市康泰医疗器材厂）；可调移液器(ThermoScientific0·5~10yL，10~100yL，100~ lOOOyL);玻璃仪器、烧杯、量筒等。
[0066] (2)试剂耗材：色谱纯甲醇、乙臆(TediaHighPuritySolventCompany.Inc);上 海月旭科技色谱柱UltimateSi02(2.1X100mm，3ym); 1.5mL离心管(AXYGEN，美国）。
[0067] (3)标准品：尼古丁、可替宁、3-羟基可替宁和稳定同位素内标可替宁_d3购自于加 拿大TorontoResearchChemicalInc.公司，纯度均 2 98%。
[0068] (4)质控品：含有尼古丁、可替宁、3-羟基可替宁的空白唾液基质溶液，分高中低三 个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表1所示。
[0069] 2.方法
[0070] (1)色谱条件:流动相A: 0.1 %v/v甲酸水溶液;流动相B: 0.1 %v/v甲酸的甲醇溶 液。色谱柱型号:UltimateSi02(2.1X100mm，3