一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于维生素检测的技术领域，具体涉及一种同时检测血液样品中多种水溶 性维生素的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素是生物生长和代谢所必需的微量营养物质，分为脂溶性和水溶性维生素两 类，缺乏时生物不能正常生长，并导致维生素缺乏症的发生。维生素Bl、B2、B6、B12、维生 素C、叶酸、泛酸、生物素、烟酰胺均属于水溶性维生素，人体缺乏该九种维生素时会表现出 不同的症状：维生素B1缺乏会导致脚气病、神经炎等；维生素B2缺乏会导致舌炎、口角溃 疡、白内障等；维生素B6缺乏会导致头皮肩增多、唇干裂、舌炎等；维生素B12缺乏会导致 恶性贫血、神经退化等；维生素C缺乏会导致坏血病等；叶酸缺乏会导致孕妇流产或胎儿先 天畸形等；泛酸缺乏会导致机体代谢受损等；生物素缺乏会导致毛发变细、失去光泽、皮炎 等；烟酰胺缺乏会导致食欲不振、记忆力减退、痴呆等。
[0003] 在国外，维生素是最主要的营养保健品，维生素对维持人体健康的作用有充分的 科学依据，深入人心。根据统计，维生素在美国保健品市场占有主要份额。随着国际维生素 市场对中国乃至亚洲市场的不断冲击，以及国内科研单位和企业在维生素行业取得的科研 成果和技术突破，我国公民自身的保健意识不断增强。但是，由于缺乏科学的指导，维生素 产品的使用现状很混乱，一些人群为了提高身体各项技能，不惜花重金在保健品上，盲目补 充维生素，补充过量对身体也是一种伤害。如何了解人体是否需要补充所必需的四类水溶 性维生素，只有通过检测体内各种维生素的真实状态，根据检测结果有针对性的调整需要 的维生素，检测是科学评估和个性化使用维生素唯一的依据。
[0004] 目前，常用的维生素检测方法主要包括酶联免疫分析法、化学免疫发光法、高效液 相色谱法（HPLC)和超高效液相色谱-质谱法（LC-MS/MS)等。免疫法检测时所用的抗体， 也可识别其它维生素衍生物，且抗体抗原反应通常不足100%，因此结果差异较大，特异性 较差，应用于临床检测可靠性不高，尤其是对于检测含量较低的维生素。液相色谱法由于检 出限有限，主要用于维生素含量较高的样品测定，一般只能进行单组份或含量较高的几个 组分的同时测定。目前的液相色谱-质谱法只能对一种或两种维生素做定性分析，由于血 浆/血清成分复杂，且维生素含量较低，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的准确 性，所以为了降低检测时的基质效应，使用者都是对不同的维生素逐个检测分析，这样存在 以下的缺点：检测成本较高，而且操作复杂，耗费的时间较长，检测需要的血量较多。目前还 没有一种能够同时检测血清/血浆中多种水溶性维生素的有效方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种同时检测血液样品中多种水溶性 维生素的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种同时检测血液样品中三种以上水溶性维生素的方法，采用LC-MS方法。
[0008] 优选所述血液样品是血浆或血清，更优选为血清。
[0009] 优选所述的三种以上水溶性维生素为维生素Bl、B2、B6、B12、维生素C、叶酸、泛 酸、生物素或烟酰胺中的任意三种以上。
[0010] 更优选所述的多种水溶性维生素为维生素Bl、B2、B6、B12、维生素C、叶酸、泛酸、 生物素和烟酰胺。
[0011] 本发明中LC-MS的条件为：
[0012] 色谱条件：流动相为A:含甲酸铵的甲醇，B:含甲酸铵的水；梯度洗脱。优点：在流 动相中加入甲酸铵有利于提高分离度，使各种维生素能够较好的分离。
[0013]质谱条件：正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。优点：优于其他的质谱条件。
[0014]优选色谱条件：色谱柱lie柱（LunaHilie100X2. 0mm，3. 0μπιχ)，柱温： 45°C;流动相A:含体积分数为0. 1%甲酸铵的甲醇，流动相B:含体积分数为0. 1%甲酸铵的 水；梯度洗脱条件（如表 1) :〇 ~2min，30%A，2 ~3min，75%A，3 ~3. 5min，98%A，3. 5 ~ 4.Omin，98%A，4 ~5min，30%A，流速 0· 5mL/min，进样量，20μL。
[0015] 表1梯度洗脱条件
[0016]
[0017] 优选质谱条件:采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气: 60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：5000V，去溶剂温度：550°C。
[0018] MRM质谱参数如表2 :
[0019] 表2MRM质谱参数
[0020]
[0021] 优点：通过具体实验，优化出通用的流动相和流速梯度，从而可以同时检测出九种 维生素。另外，每种维生素选择特定的母离子、子离子、去簇电压及入口电压，从而提高各个 维生素的信号强度，降低基质效应的影响，有利于检测维生素含量，尤其是含量较低的维生 素测定。
[0022] 同时检测血清中九种水溶性维生素的方法，步骤如下：
[0023] (1)样品处理：向血清样本中加入甲醇：乙腈（体积比为1:1)溶液，涡旋震荡后离 心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于70%v/v甲醇水溶液中，0.2μπι滤膜过 滤，获得待测样本；所述的血清、甲醇、乙腈体积比为2:1: 1，血清与70%甲醇水溶液的体积 比为2:1 ;
[0024] 优点：通过该处理，有效的分离沉淀蛋白，去除杂质，减少离子干扰，降低基质效 应，同时可以最大程度的保留维生素，避免其分解或氧化，从而检测出最真实的维生素含 量。
[0025] (2)标准工作液的配制：以水配制100μg/mL各维生素标准品储备液，然后用5% m/vBSA(牛血清白蛋白）甲醇溶液制备6个梯度（维生素Bl:l、3、5、7、9、llng/mLj|^ 素B2 :l、5、10、15、20、25ng/mL;维生素B6 :l、5、10、20、40、60ng/mL;维生素B12 :0· 1、0· 5、 1. 0、1· 5、2· 0、2· 5ng/mL;维生素C:1、5、10、15、20、25yg/mL;叶酸：0· 4、0· 8、1· 6、2· 4、3· 2、 4·Ong/mL;泛酸：l、50、100、300、600、900ng/mL;生物素：0· 1、0· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5ng/mL; 烟酰胺：〇. 5、1、3、5、7、9μg/mL)的混合标准溶液分装于1. 5mL棕色瓶中，-20°C保存备用；
[0026] (3)LC-MS检测：将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电 喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测。
[0027] 所述水溶性维生素为：维生素81、82』6、812、维生素(：、叶酸、泛酸、生物素和烟酰 胺。
[0028] -种同时检测血液样品中三种以上水溶性维生素试剂盒，具有6个梯度（维生素 B1 :l、3、5、7、9、llng/mL;维生素B2 :l、5、10、15、20、25ng/mL;维生素B6 :1、5、10、20、40、 60ng/mL;维生素B12 :0· 1、0· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5ng/mL;维生素C :1、5、10、15、20、25 yg/ mL ;叶酸：0· 4、0· 8、1· 6、2· 4、3· 2、4· Ong/mL ;泛酸：l、50、100、300、600、900ng/mL ;生物素： 0· 1、0· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5ng/mL ;烟酰胺：0· 5、l、3、5、7、9yg/mL)的混合标准溶液，甲醇， 乙腈，70%甲醇水溶液，体积分数0.1%甲酸铵的甲醇，体积分数0.1%甲酸铵的水、质控 品。
[0029] 所述试剂盒在血清中同时检测维生素Bl、B2、B6、B12、维生素C、叶酸、泛酸、生物 素和烟酰胺中的应用。
[0030] 应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线 性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中九 种水溶性维生素的浓度。
[0031] 上述方法中包括质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工 血清添加混合维生素标准物质制得，并通过检测确定靶值。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] 本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种 同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法，特别是同时测定血清中维生素Bl、B2、B6、 B12、维生素C、叶酸、泛酸、生物素、烟酰胺的方法。采用本发明可以同时检测人血清中九种 水溶性维生素Bl、B2、B6、B12、维生素C、叶酸、泛酸、生物素、烟酰胺的含量，并进行精确的 定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
[0034] 本发明中使用的提取方法，可以较多的去除杂质，降低检测时的基质效应，且操作 简单快捷，可以灵敏的检测出各种维生素的含量，尤其是人体内含量较低的叶酸和维生素 B12〇
[0035] 维生素Bl、B2、B6、B12、维生素C、叶酸、泛酸、生物素、烟酰胺是人体内重要的水溶 性维生素，任何一种维生素的缺乏都会导致相应的疾病。本发明可以同时检测这九种维生 素，一是降低了检测成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以对多种 维生素的补充提供依据。
[0036] 本发明用超高效液相色谱-质谱法检测血清中九种水溶性维生素，特异性强，灵 敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法的试剂盒不仅可 以对营养性疾病患者进行病因诊断，还可以对潜在的维生素缺乏者进行用药指导，减少盲 目补充维生素的现象发生。
[0037] 本发明的方法针对每