用于进行cvd风险评估的生物化学标志物的制作方法
【专利说明】
[00011 本申请是中国专利申请CN200880123912.0的分案申请，原申请是国际申请号PCT/ EP2008/064946于2010年7月2日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及检测对心血管疾病诊断目的和疾病发展预后有价值的生物化学标志 物的测定，其包括指示由发生动脉粥样硬化和斑块不稳定性所导致的心血管事件风险的生 物化学标志物。
【背景技术】
[0003] 心血管疾病（cardiovascular disease，CVD)是世界范围内致病及死亡的首要原 因。目前，尚没有允许诊断并将患者归类为不同风险组以及允许诊断低风险患者的有效且 非介入性的诊断方法。诊断和预后工具主要由简单标志物的多变量分析构成，例如年龄、吸 烟情况和多种脂质和脂蛋白的浓度。
[0004] CVD涵盖数种临床综合征，主要有心绞痛、心肌梗死(冠状动脉栓塞)和中风。所有 这些综合征通常都是复杂动脉粥样硬化的后遗症。
[0005] 动脉粥样硬化开始于童年阶段的内膜增厚，并发展成为动脉内膜中的脂肪条纹， 这些病变分别表征为I型和II型。脂肪条纹是动脉粥样硬化发展过程中最早的宏观可见病 变，其在所有种族和社会的几乎所有人类中发生。在非致病状态下，内皮细胞(endothelial cell，EC)对白细胞的粘附性相互作用有抗性。但是，动脉粥样化形成过程中动脉壁中促炎 症细胞因子以及积累的氧化脂蛋白的作用引发粘附分子的表达，例如主动脉EC表面上的细 胞间粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM)_1和血管细胞粘附分子 (vascular cell adhesion molecule，VCAM)_1。这使得白细胞能被内皮表面捕获并移行进 血管壁的内膜部分。斑块的发生包括发生移位和凋亡的平滑肌细胞(smooth muscle cell， SMC)个数的增加，其导致基质周转(turnover)增加。受损的胶原蛋白合成可导致纤维帽削 弱并产生更易于破裂的动脉粥样硬化斑块;但是，大多数研究者认为，蛋白水解酶例如基质 金属蛋白酶(matrix metallo_protease，MMP)及其它蛋白酶的作用对斑块破裂的风险有重 要的贡献(Clarkson和Kaplan 509-28)。
[0006] 斑块可分为两种不同类型："脆弱的"和"稳定的"斑块。但是，对于详细的组织学分 析和对分子的认识，经常使用更详细的分类。斑块的发生有三个主要阶段:起始、脂肪条纹 和复杂/晚期斑块(Stary H.C·)。
[0007] 动脉粥样硬化斑块在动脉内膜内发生，并可根据其组成和结构进行分类。这种分 类将病变分为8个类型(Stary H.C.):
[0008] I.内膜中载有脂滴并被其增大的巨噬细胞(巨噬细胞源性泡沫细胞)增多。
[0009] II.巨噬细胞源性泡沫细胞与内膜SMC内的脂滴一起在蛋白聚糖层深部积累。泡沫 细胞层以脂肪条纹的形式可见。在II型病变中，单核细胞通过单核细胞趋化蛋白（主要是 MCP-1)穿透内皮细胞层，所述趋化蛋白在人粥样斑中过表达。早期病变类型（I型和II型）可 以在婴儿期开始，但不一定导致斑块破裂。此外，动脉粥样硬化的发展可以在形成III型病 变之后结束，斑块的形成是无法预测的（stary H. C.)。
[0010] III. Ill型病变确定为处于脂肪条纹（II型）和粥样斑（IV型）之间的中间病变。这 些病变还含有胞外脂质的混合物，由此使得内膜深部肌肉弹性层中通常紧密相邻的SMC之 间的间距扩大。物质混合物可取代通常位于这里的蛋白聚糖和胶原纤维，但是这在动脉粥 样化形成的这一阶段造成的影响很小。
[0011] IV.粥样斑是动脉粥样硬化的第一个临床体征。细胞外脂质混合物的积累所导致 的动脉内膜中SMC的移位以及内膜结构的破坏是IV型病变的标志。脂质核心的形成是这种 SMC移位的最终结果。脂质核心的形成导致壁增厚加剧。脂质核心是内膜深处大且界限明确 的区域，在此处动脉壁这一部分的正常结构成分已经被致密堆积的泡沫细胞残留物、游离 脂滴、胆固醇晶体和钙颗粒所取代。在动脉粥样硬化发展的这一阶段，在正常情况下位于该 区域中的SMC减少或者完全失去。任何残留的SMC开始广泛分散，产生长形细胞体，并且常常 具有异常厚的基底膜。在此阶段，开始形成覆盖在脂质核心上的层。该层由富含胶原蛋白和 蛋白聚糖的细胞间基质、含和不含脂滴的SMC、巨噬细胞和泡沫细胞组成。
[0012] V.对IV型病变的应答是形成修复性纤维组织基质，形成纤维"帽"。通常，这些病变 会由彼此不规则堆叠的脂质核心和修复性组织的层组成。另外，诸如血肿和血栓形成等事 件可额外并发这些病变类型。如果不致命，则这些病变并发症整合到病变中，其上长出修复 性基质组织的薄层，其由胶原蛋白和蛋白聚糖组成。在形成所述帽的过程中，动脉粥样硬化 斑块中细胞外基质蛋白胶原和蛋白聚糖的含量增加。
[0013] VI.内皮的缺损例如裂隙、磨蚀、溃疡、血肿、血栓、出血在并发情况下可导致更复 杂的病变类型，称为VI型病变。
[0014] VII.该病变经常称为钙化病变，其中病变中超过50 %由矿物质组成。除了钙化之 外，这些病变还含有丰富的修复性纤维结缔组织。当滞留于此的SMC发生凋亡和崩解时，它 们的矿化细胞器变成钙化的一部分。
[0015] VIII.钙化病变之后是纤维化病变。纤维化病变可完全由胶原蛋白组成，不含脂 质。（Stary H.C.)
[0016] 心血管事件经常是斑块破裂的结果，其中炎症与蛋白酶的释放减弱了纤维帽的肩 部区域，使得斑块中的脂肪物质与血液相接触，沉淀形成附壁血栓(Clarkson和Kaplan)。蛋 白酶活性增加连同基质产生的减少导致纤维帽变薄，这被认为是斑块不稳定的标志，其增 加了破裂的风险。斑块的脆弱性及其破裂的风险是临床上关注的领域。脆弱斑块 (vulnerable plaque，VP)的没有标准定义，但是一般认可与稳定斑块相比存在三种组织学 标志：
[0017] 1)更大的脂质核心（> 全部病变的40%)。
[0018] 2)更薄的纤维帽(65-150微米）。
[0019] 3、）大量急性炎性细胞。
[0020]定义VP的主要标准包括:活跃的炎症(存在单核细胞、巨噬细胞和T细胞）、具有大 脂质核心的薄帽、伴随表面血小板凝集的内皮剥蚀、有裂隙的斑块以及>90%的动脉狭窄。 其它次要标准包括：表面钙化结节、斑块内出血、内皮功能障碍以及向外的重塑（Shin， Edelberg和Hong)。
[0021] 斑块复杂性、不稳定性和破裂可以通过医学治疗和/或生活方式的改变来抑制。但 是，在一些情况下，可能需要更为介入性的方法，即血管成形术或旁路手术。
[0022] 目前，诊断工具是基于仍处于开发之中的静态图象分析，或者基于低技术的方法 例如与CVD风险相关的心脏收缩压和舒张压水平。该领域一直致力于开发可更好地鉴别高 风险患者的多变量分析。一个这样的模型是SCORE模型（系统性冠状动脉风险评价 (Systematic Coronary Risk Evaluation)模型）。1994年，欧洲动脉粥样硬化学会、欧洲心 脏病学学会和欧洲高血压学会发表了有关预防冠状动脉心脏疾病的一组建议，并于2003年 进行了修订。此指南是基于几种评价技术，其已开发用于评估无症状对象中的CVD风险，即 鉴定无症状的高风险患者。SCORE模型整合了性别、年龄、吸烟情况、收缩压和总胆固醇或胆 固醇/HDL比值作为风险因素(Graham等）。
[0023]为了作出更详细的诊断，S⑶RE模型是不够的，因此使用了成像技术。因此，主要对 高风险组中的患者或者在研究期间使用成像方法。
【发明内容】
[0024] 成像技术
[0025] 冠状动脉血管造影术(Coronary angiography，CAG)是目前用于确定狭窄程度的 金标准成像技术。CAG在两个维度上对血管腔成像，但是其仅限于腔，而非管壁，因此CAG不 能区分有稳定斑块的动脉和有脆弱斑块的动脉。CAG常用于确定患者是否需要手术、血管成 形术或旁路手术。为了确定腔狭窄位点是否是晚期斑块，需要其它技术，即血管内冠状动脉 超声（intravascular coronary ultrasound，IVUS)或血管镜。
[0026] IVUS提供了斑块和血管壁的二维截面图，被认为是适合表征血管壁以及钙化的形 态和程度的方法，但是不适于评估病变中的脂质。但是，IVUS是介入性的，需要专业技术和 一定的费用，因此其使用并不广泛。血管镜检是另一种了解和鉴定动脉粥样硬化的有用方 法。血管镜直接观察斑块表面，并且能够检测斑块颜色和血栓形成。但是，血管镜检是介入 性的并且在技术上十分困难，目前为止尚不能检测斑块延伸的程度。目前受到许多关注的 另一种成像技术是磁共振成象(MRIhMRI是非介入性的，并且能够鉴定具有高中风风险的 颈动脉斑块。另一方面，由于斑块尺寸小和冠状动脉的位置，MRI不是用于对冠状动脉成像 的最佳技术。其它成像技术正在开发之中，即弹性成像术（elastography)、热成像术 (thermography)和光学相干断层成像术(Schaar等）。
[0027] 所提到的成像技术都处于开发之中，并且均无法单独地鉴定脆弱斑块，但是它们 可用于了解破裂之前的分子事件和斑块周转。目前，在早期阶段诊断CVD的唯一机会是利用 目的患者以及患者近亲中产生冠心病、外周动脉疾病和脑血管动脉粥样硬化疾病的一组风 险因素。
[0028] 现有生物化学标志物
[0029] 目前，已知有几种生物化学标志物是动脉粥样硬化的风险因素。最近，人们致力于 测量血清中的生物化学标志物浓度;脂质例如总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高 密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和炎性标志物例如C反应蛋白（C-reactive protein，CRP)、白细 胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-〇〇即€〇、〇040、0)40配体(0)40〇 等。
[0030]在脂蛋白标志物中，有至少两个重要的进展。LDL颗粒的大小似乎预示了动脉粥样 硬化发展的程度。相比于大颗粒浓度的增加，小LDL颗粒浓度的增加与CVD风险更加相关 (Gardner，Fortmann，and Krauss)。
[0031 ] HDL-C水平与甘油三酯强相关，高甘油三酯水平与CHD高风险相关。Jeppesen等的 群体研究（2003)发现高TG/低HDL-C是IHD(ischemic heart disease，缺血性心脏病）最强 的风险因素 (Jeppesen等）。
[0032] 脂质谱对于风险因素的评价来说非常重要，但是无法了解和测量与斑块周转相关 的分子事件。已经有建议将许多生物化学标志物作为CVD的风险因素，尽管这不是该疾病的 特异性产物。它们包括CRP和骨钠尿肽(Bone natriuretic peptide，BNP)(参见表1)。表1总 结了一些已知的CVD标志物。
[0033]
[0034」
[0035]
[0036] 表1:目前CVD中生物化学标志物的选择
[0037] 因此，已经提出将一组不同生物化学标志物作为心血管事件的标志物。W a n g等 (2006)测定了参与Framingham研究的3200位患者的10种不同生物化学标志物，其记载于表 1。结论是，对10种生物化学标志物的测量仅对高于标准风险因素的诊断有一定贡献。在10 种生物化学标志物中，B型钠尿肽水平、C反应蛋白水平和尿白蛋白/肌酐比值显示出标志物 与死亡/心血管事件之间的最高相关性(Wang等）。
[0038] C反应蛋白
[0039] C反应蛋白（CRP)是肝脏应答于不同临床状况例如炎症、感染或外伤而产生的急性 期血清蛋白（Gabay&Kushner 1999) XRP的产生是由受损或病变组织释放的细胞因子例如 IL-6诱导的。CRP的生理作用仍然未知，对其促炎症或抗炎症作用的讨论一直在进行。
[0040] 有越来越多的证据证明，CRP是人类CVD的风险因素。在Ridker等(2002)的研究中， 在由28000位健康妇女组成的大群体中对急性心肌梗死、中风、冠状动脉血运重建或者CVD 所致死亡的发生进行了八年随访，显示CRP是比LDL胆固醇更好的未来心血管事件的预测 物。许多其它研究也报道，基线CRP水平构成了心血管事件的独立风险因素（Thompson等 1995，Mendall等1996，Kuller等1996，Ridker等1997，Tracy等1997，Ridker等2000)〇
[0041] 已有推测认为，循环CRP仅反映动脉粥样硬化过程中发生的一般性炎症，而不是疾 病发病的活性组分。但是，也有一些证据支持这种观点，即CRP在动脉粥样化形成中有作用。 首先，产生CRP的慢性感染也与CVD风险增加相关(Leinonen&Saikku 2002)。其次，我们和其 他人在不同程度的动脉粥样硬化病变中鉴定到01^(1^711〇1(18&\^11〇6 1987，!^七31^1^等 1995)。最后，CRP已显示出在体外具有促动脉粥样化特性:CRP可活化内皮细胞产生粘附分 子(Pasceri等2000)。其还可降低内皮细胞中eNOS的产生(Venugopal等2002)并增加巨噬细 胞对LDL的摄取(Zwaka等2001)。
[0042] 脑钠尿肽
[0043] 脑(B型）钠尿肽(BNP)是由心室应答于心室中心肌细胞过度拉伸而分泌的肽类激 素。在切割proBNP后，T-proBNP (无活性的N端片段)与活性激素(BNP) -起被释放到血流中。 BNP和NT-proBNP都已被建议用作潜在的心血管事件生物化学标志物(Wang等）。
[0044] 趋化因子
[0045] 趋化因子也是潜在的CVD标志物;趋化因子是在炎症中产生的低分子量细胞因子。 与CVD相关的一种主要趋化因子是单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1) iCP-1似乎在将单核细胞募 集到动脉粥样硬化病变中起到早期且重要的作用。在使用猴动脉粥样硬化模型的研究中， MCP-1的血浆浓度与斑块大小和斑块并发症高度相关(Register等）。
[0046]包括胆固醇的脂质
[0047]最近，许多人着眼于测定血清中的胆固醇浓度；总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固 醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的浓度。在脂蛋白标志物中，至少有两个重要的 进展。首先，LDL颗粒的大小似乎预测了动脉粥样硬化发展的程度。相比于大颗粒浓度的增 加，小LDL颗粒浓度的增加与CVD风险更加相关(Gardner等）。其次，LDL颗粒的胆固醇油酸酯 含量可能是CVD风险特别重要的标志物。在猴中，含有胆固醇油酸酯的脂蛋白颗粒核心的富 集与更严重的冠状动脉动脉粥样硬化强烈正相关(Rudel等），并且对LDL和HDL胆固醇浓度 的贡献有加合性。另外，这些实验动物中的发现也得到了更早的人类研究(Lawrie等）的支 持了，其显示与正常对照相比，具有低比例胆固醇亚油酸酯的血浆脂蛋白（相反，具有高比 例的胆固醇油酸酯)常见于具有CHD(coronary heart disease，冠心病)并发症的患者。 [0048] HDL-C水平与甘油三酯强相关，高甘油三酯水平与更高的CHD风险相关。Jeppesen 等的群体研究发现高TG低HDL-C是IHD (缺血性心脏病)最强的风险因素。
[0049] 这些脂质谱对于风险因素的评价来说非常重要，但是不能了解和测量与斑块周转 相关的分子事件。已经提出将许多生物化学标志物作为CVD的风险因素，尽管不是该疾病的 特异性产物。它们包括CRP和ApoE。
[0050] 脂蛋白
[0051] 最常用于预测CVD的生物标志物是胆固醇浓度（总胆固醇和胆固醇/HDL比值）。它 们与其它风险因素(例如血压和LDL水平)一起使用。在之前提到的SCORE模型中同时使用了 这两种因素。LDL水平是重要的，因为LDL在血液中运输胆固醇，氧化LDL的积累可促进动脉 粥样硬化(Graham等）。另外，发现CHD与甘油三酯(TG)水平显著相关，其中CHD风险的提高与 TG水平提高相关，而不论LDL-C和HDL-C水平如何，但胆固醇水平仍被视为CVD主要风险因素 之一(Jeppeson等）。
[0052] ΑΡ0-Ε
[0053]载脂蛋白E可