一种检测吉非替尼耐药机理的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，特别是涉及一种检测吉非尼替耐药机理的方法。
【背景技术】
[0002] 肺癌在我国及全球范围内都是是发病率最高、死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌中有 80%为非小细胞肺癌，吉非替尼(Gefitinib)是治疗晚期非小细胞肺癌的有效药物。研究显 示，与化疗相比，吉非替尼具有以下优势：口服给药;治疗毒副作用小；可以与化疗取得相 似，甚至好于化疗的疗效。但是，晚期非小细胞肺癌患者在服用吉非替尼10-12月后会出现 耐药，导致患者服用药物药效降低的后果。尽管目前已对吉非替尼的耐药机制有一定的了 解，但是，并没有发现导致耐药性的原因，特别是还没有一个检测耐药性的方法，通过该检 测数据研究发现新的吉非替尼的耐药机制，从而为开发延缓或克服吉非替尼耐药性提供新 的治疗策略。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对目前尚无检测吉非尼替耐药机理有效方法，找出耐药机理原 因这一状况，提出一种检测吉非尼替耐药机理有效方法，为进一步研究抗耐药物或方法提 供参考依据。
[0004] -种检测吉非尼替耐药性机理方法，该技术方案包括： ?!)采用iTRAQ定量（同位素标记相对或绝对定量)蛋白组学技术对参与吉非替尼耐药 的蛋白信号分子进行高通量筛选； 采用western blot(蛋白质免疫印迹试验)技术验证，筛选获得的吉非替尼敏感肺 癌细胞株和吉非替尼耐药细胞株的差异表达蛋白信号分子； 龜采用MTT(四甲基偶氮唑蓝比色)法，证明干扰发现的蛋白信号分子的表达，可以增 加吉非替尼的敏感性，从而证明新发现的蛋白信号分子表达水平改变是吉非替尼耐药的一 种机制。
[0005] 本发明具有如下显著效果:通过本发明技术方案的实施，有助于检测到新的参与 吉非替尼耐药的蛋白信号分子，阐述了吉非替尼耐药新机制，通过检测到的新的蛋白信号 分子来设计抗耐性药物，达到逆转吉非替尼耐药基础的目的。
【附图说明】
[0006] 图1为iTRAQ定量蛋白组学分析技术流程图。
[0007] 图2为western blot技术检测结果显示图。
[0008]图3为MTT技术检测结果显示图。
【具体实施方式】
[0009]本发明的【具体实施方式】如下： 1、参与吉非替尼耐药蛋白信号分子筛选。
[0010]采用目前国际上公认的iTRAQ定量蛋白组学技术对参与吉非替尼耐药的蛋白信号 分子进行筛选。具体步骤包括：以人肺癌细胞株PC-9(正常肺癌细胞，对吉非替尼治疗敏感） 为对照组，以人肺癌细胞株PC-9R(将PC-9细胞株采用长时间低剂量吉非替尼治疗，获得的 吉非替尼耐药细胞株)为实验组，采用iTRAQ定量蛋白组学技术筛选PC-9与PC-9R细胞株差 异表达的蛋白信号分子。iTRAQ定量蛋白组学技术具体技术流程见图1。
[0011] 2、新发现的蛋白信号分子在PC-9和PC-9R中是否存在差异表达的验证。
[0012] 对筛选发现的，与PC-9相比，在PC-9R中表达上调的蛋白信号分子，采用western blot技术对其实际表达水平进行验证。western blot技术的主要步骤包括:蛋白提取，蛋白 浓度测定，凝胶电泳，蛋白转膜，抗体孵育和蛋白表达水平检测等。
[0013] 3、新发现蛋白信号分子参与吉非替尼耐药的验证。
[0014] 对干扰新发现蛋白信号分子表达的PC-9R和PC-9R本身，进行吉非替尼治疗，采用 MTT法比较干扰新发现蛋白信号分子与否，吉非替尼对PC-9R增殖率的影响，从而证实干扰 新发现蛋白信号分子表达，可以增加 PC-9R对吉非替尼的敏感性，进而说明，新发现的蛋白 信号分子介导吉非替尼耐药，具有作为药物设计靶点的潜在价值。
[0015] 如图1所示：iTRAQ定量蛋白组学分析技术流程为:第一步，分别从PC-9和PC-9R细 胞样品中提取蛋白；第二步，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后 续步骤充分酶解蛋白；第三步，用考马斯亮蓝法(Brandford)法进行蛋白的浓度测定，聚丙 烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)检测，每个样品取等量蛋白，进行胰蛋白酶酶解;第四步，用 iTRAQ试剂标记肽段;第五步，将标记后的肽段进行等量混合;第六步，对混合后的肽段使用 强阳离子交换色谱（Strong Cation Exchange chromatography，SCX)进行预分离；第七 步，进行液相串联质谱（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析;第八步，数据分析:首先对于质谱下机的原始文件，进行峰 识别，得到峰列表。其次建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定。最后比较各蛋白在各 样品之间的相对含量的关系，从而获得目标蛋白。
[0016] 如图2所示:Annexin A1在PC-9R中表达高于PC-9(颜色越黑，表达水平越高）β-actin是内参，用于标定蛋白表达的基准。Annexin Α1的分子量为38.5 kDa，0-actin的分子 量为45 kDa。
[0017] 如图3所示:研究对象采用对吉非替尼耐药的PC-9R细胞，由于其对吉非替尼耐药， 所以，随着吉非替尼浓度的增加，PC-9R的增值率有降低，但是不明显。如果先对PC-9R细胞 的Annexin A1表达水平进行干扰，然后再采用吉非替尼治疗，随着吉非替尼浓度的增加， PC-9R细胞的增殖率会受到明显的抑制。说明，Annexin A1参与了吉非替尼的耐药，是一种 吉非替尼耐药的新机制。同时，也预示着，Annexin A1可以作为逆转吉非替尼耐药药物的革巴 点。
[0018] 表1经筛选获得的PC-9与PC-9R差异表达蛋白信号分子
注:按照上调率排名，Annexin A1位于第三位。鉴于上调率前两位的蛋白信号分子已有 文献报道，本方案选择Annexin A1作为新的参与吉非替尼耐药的信号分子进行申报。
[0019] 上调率：iTRAQ定量蛋白组学结果的一部分，认为Annexin A1在PC-9R中的表达高 于PC-9中的表达，且上调了 1.96366667倍。
[0020] 上述【附图说明】和表1中：PC-9为人肺腺癌PC-9细胞;PC-9R为人肺腺癌PC-9细胞耐 吉非替尼细胞;SCX强阳离子交换为;nM为纳摩尔每升吉非替尼浓度;Annexin A1为膜联蛋 白A1，在PC-9R中表达高于PC-9 (颜色越黑，表达水平越高）。
【主权项】
1. 一种检测吉非替尼耐药机理的方法，其特征在于:该方法包括:雷采用iTRAQ定量(同 位素标记相对或绝对定量)蛋白组学技术对参与吉非替尼耐药的蛋白信号分子进行高通量 筛选； 這;采用western blot(蛋白质免疫印迹试验)技术验证，筛选获得的吉非替尼敏感肺癌 细胞株和吉非替尼耐药细胞株的差异表达蛋白信号分子； :凄采用MTT(四甲基偶氮挫蓝比色)法，证明干扰发现的蛋白信号分子的表达，可W增加 吉非替尼的敏感性，从而证明新发现的蛋白信号分子表达水平改变是吉非替尼耐药的一种 机制。2. 根据权利要求1所述检测吉非替尼耐药机理的方法，其特征在于:蛋白信号分子进行 高通量筛选的具体步骤包括：W人肺癌细胞株PC-9(正常肺癌细胞，对吉非替尼治疗敏感） 为对照组，W人肺癌细胞株PC-9R(将PC-9细胞株采用长时间低剂量吉非替尼治疗，获得的 吉非替尼耐药细胞株)为实验组，采用iTRAQ定量蛋白组学技术筛选PC-9与PC-9R细胞株差 异表达的蛋白信号分子。3. 根据权利要求1所述检测吉非替尼耐药机理的方法，其特征在于:western blot技术 验证的主要步骤包括:蛋白提取，蛋白浓度测定，凝胶电泳，蛋白转膜，抗体解育和蛋白表达 水平检测。4. 根据权利要求1或2所述检测吉非替尼耐药机理的方法，其特征在于：iTRAQ定量蛋白 组学分析技术流程为:第一步，分别从PC-9和PC-9R细胞样品中提取蛋白；第二步，对提取后 的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键W便后续步骤充分酶解蛋白；第=步，用考马 斯亮蓝法(Bran壯ord)法进行蛋白的浓度测定，聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，每个 样品取等量蛋白，进行膜蛋白酶酶解;第四步，用iTRAQ试剂标记肤段;第五步，将标记后的 肤段进行等量混合；第六步，对混合后的肤段使用强阳离子交换色谱（Strong Cation Exchange chromatography，sex)进行预分离；第屯步，进行液相串联质谱（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析；第八步，数 据分析:首先对于质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表。
【专利摘要】一种检测吉非替尼耐药机理的方法，属于医药领域。该方法包括：①采用iTRAQ定量（同位素标记相对或绝对定量）蛋白组学技术对参与吉非替尼耐药的蛋白信号分子进行高通量筛选；②采用western？blot（蛋白质免疫印迹试验）技术验证，筛选获得的吉非替尼敏感肺癌细胞株和吉非替尼耐药细胞株的差异表达蛋白信号分子；③采用MTT（四甲基偶氮唑蓝比色）法，证明干扰发现的蛋白信号分子的表达，可以增加吉非替尼的敏感性，从而证明新发现的蛋白信号分子表达水平改变是吉非替尼耐药的一种机制。该方法有助于检测到新的参与吉非替尼耐药的蛋白信号分子，通过检测到的新的蛋白信号分子来设计抗耐性药物。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105510603
【申请号】CN201610068206
【发明人】王艳阳, 赵仁, 折虹
【申请人】宁夏医科大学总医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月1日