一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，所述检测应用方法包括如下步骤：S1.标准样品光谱集的建立：采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取感染柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；S2.定性分类判别模型的建立：将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后，分别提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS?DA定性分类判别模型；S3.未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS?DA定性分类判别模型于田间直接区分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病，单一植株仅需现场扫描3～5个叶片，耗时仅需1～2 min，便可实现快速实时确诊。本发明方法可进行柑桔黄龙病的田间快速诊断，操作简便，快速准确，对样本不产生任何损伤，并对环境友好。
【专利说明】
一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及果树病害田间的快速诊断技术领域，具体地，涉及一种柑桔黄龙病的 近红外光谱田间检测方法。
【背景技术】
[0002] 柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)，是柑桔上的一种毁灭性病害，自20世 纪初柑桔黄龙病在我国华南地区被首次报道以来，该病害已成为制约世界柑桔产业健康发 展的最重要因素之一。柑桔植株一旦感染柑桔黄龙病，轻者影响柑橘的产量和品质，重者则 造成柑桔植株的直接死亡，堪称柑桔产业上的"癌症"（Bove，2006; Gr叫a,2015)。
[0003] 黄龙病病树的正确诊断和鉴定是生产上正确防治柑桔黄龙病的前提，因此掌握快 速而有效的柑桔黄龙病诊断与检测技术，对及时发现柑桔黄龙病并采取相应的措施积极防 治柑桔黄龙病具有重要实践意义。PCR检测技术是目前最有效的诊断技术，但是其仅限于在 具备有一定设备条件的实验室内进行，而且需要熟练的技术人员，检测成本高昂，不适合进 行田间大规模的排查（张利平，2009)。目前已有的田间直接诊断方法有：田间症状诊断法 (张名福等，1998;田亚南等，1999)，碘染色法(张利平等，2009)，环介导等温扩增(LAMP)法 (黄丽等，2012)，近红外光谱法等(刘燕德等2016)。田间症状诊断虽然快速简便，但是黄龙 病的田间症状复杂多变，不同的生长季节在叶片、果实和植株上表现不同，且其症状易与柑 桔衰退病、缺素症、天牛为害和除草剂药害相互混淆，给病害的准确诊断鉴定造成困难 (Bove，2006);碘染色法则特异性较差，准确度低，同样不适合进行柑桔黄龙病的田间早期 诊断(张利平等，2009);环介导等温扩增(LAMP)法的原理基本与PCR检测方法相同，需要先 进行复杂的前处理，并需要熟练的技术人员（孔德英等，2013);而现有报道的近红外光谱法 是将柑桔叶片样本采集回到实验室内，再利用大型的傅里叶光谱仪进行分析，对不同类型 柑桔叶片的光谱特征解释有较大意义，并从理论上明确了近红外光谱应用于柑桔黄龙病的 诊断是可行的（刘燕德等，2016);但现有报道并没有涉及该方法的田间应用技术，特别是没 有涉及光谱数据的田间采集方法，难以适应于柑桔黄龙病的田间大规模快速诊断。因此，生 产上依然急需一种简单易行，果农可以快速掌握，适合于田间大规模应用的柑桔黄龙病快 速诊断技术。
【发明内容】
[0004] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检 测方法。
[0005] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
[0006] -种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，具体包括以下步骤：
[0007] S1.标准样品光谱集的建立:采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取 感染柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；
[0008] S2.定性分类判别模型的建立:将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后， 分别提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS-DA定性 分类判别模型；
[0009] S3.未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS-DA定性分类判别模型于田间直 接区分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。
[0010] 本发明的方案，针对单一植株仅需现场扫描3~5个叶片，耗时仅需1~2min，便可 实现快速实时确诊。
[0011] 作为优选实施方式，微型便携式近红外光谱仪探测读数的部位为叶片背面的主叶 脉，叶龄为当年生或上年生的秋稍成熟叶片。
[0012] 为了让该模型很好的将感染柑桔黄龙病柑桔叶片样本与不带菌柑桔叶片样本进 行正确归类。PLS-DA模型评价参数包括:决定系数(R 2)、预测误差均方根(RMSEP)和交互验 证均方根(RMSECV)。建立PLS-DA定性分类判别模型的评价标准为：（1)决定系数R 2值越接近 于1，表示所建立模型的预测值与真实值之间的相关性越好；⑵预测误差均方根(RMSEP)值 越小，则能够表明试验结果和真实值越接近，并说明所建模型的预测精度越高；（3)交互验 证均方根(RMSECV)作为主成分选择的主要依据，一般选在RMSECV值最低处对应的主成分数 作为最佳主成分数；（4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，预测精度越高。
[0013] 优选地，步骤S1所述的微型便携式近红外光谱仪采用的图谱采集软件为 MicroNIRl.5.7,测量时间（典型值)为0.5s，测量波长范围为950~1650nm，采集背景为钢 板，光源采集直径为16mm。
[0014] 优选地，步骤S2并利用移动窗口拟和多项式平滑法（Sav i t zky-Go 1 ay，SG)消除噪 声对光谱信号的影响，同时进行一阶求导以消除基线漂移和背景影响，采用随机样本划分 法(RS)划分出为训练集和验证集。
[0015] 优选的，所述训练集和验证集中的柑桔叶片光谱学数据样本均从标准样品光谱集 中选取。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0017] 本发明以田间采集的柑桔叶片近红外光谱学数据为基础，建立能对柑桔黄龙病进 行定性分类判别的判别模型，建立一种柑桔黄龙病的近红外光谱学快速无损检测方法，以 实现柑桔黄龙病的田间早期、准确以及快速无损诊断。相比目前常用的PCR检测技术，本发 明不需要在具备有一定设备条件的实验室内进行，可以直接在田间进行，每个样本的相对 检测成本低廉，而且还可以极大缩短生产上柑桔黄龙病的检测周期，单一植株仅需现场扫 描3~5个叶片，耗时仅需1~2min，便可实现快速实时确诊，有利于进行柑桔黄龙病的田间 大规模排查。另外，本发明采用物理光谱学实现柑桔黄龙病的田间快速诊断，还可以对样本 不产生任何损伤，并对环境友好。
【附图说明】
[0018] 图1为不同柑桔叶片样本的MicroNIR原始光谱。
[0019] 图2为最优PLS-DA模型的预测结果。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0021] 实施例1
[0022]本实施例采用MicroNIR微型便携式近红外光谱仪直接于田间直接探测读取待测 砂糖桔叶片的光谱学数据，并同时应用偏最小二乘判别(PLS-DA)模型进行定性分类判别， 以区分待测砂糖桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。
[0023] 1、砂糖桔叶片标准样品光谱集的建立:不带菌砂糖桔叶片样本与感染柑桔黄龙病 砂糖桔叶片样本的近红外光谱学数据均通过微型近红外光谱仪（Mi croNIR 17003?6〇让〇1116七6〇进行采集，图谱采集软件为听(^(^11?1.5.7，测量时间（典型值）为 〇. 5s，测量波长范围为950~1650nm，将吸收率低、折射率和反射率相对较好的钢板作为采 集背景。每个样本取3点进行扫描，并取其平均值作为砂糖桔叶片标准样品光谱集中每个样 本的原始近红外光谱学数据。
[0024] 2、柑桔黄龙病定性分类判别模型的建立:利用The Unscrambler 9.8分析软件，结 合偏最小二乘判别(PLS-DA)法建立柑桔黄龙病病叶定性分类判别模型，并利用移动窗口拟 和多项式平滑法(Savitzky-G〇lay，SG)消除噪声对光谱信号的影响，同时进行一阶求导以 消除基线漂移和背景影响。采用随机样本划分法(RS)将分别将感染柑桔黄龙病柑桔叶片样 本与不带菌柑桔叶片样本的原始近红外光谱学数据划分出为训练集和验证集，染病柑桔叶 片样本121个，其中训练集101个，验证集20个;不带菌柑桔叶片样本176个，其中训练集133 个，验证集43个。PLS-DA定性分类判别模型的评价标准为：（1)决定系数R 2值越接近于1，表 示所建立模型的预测值与真实值之间的相关性越好；（2)预测误差均方根(RMSEP)值越小， 则能够表明试验结果和真实值越接近，并说明所建模型的预测精度越高；（3)交互验证均方 根(RMSECV)作为主成分选择的主要依据，一般选在RMSECV值最低处对应的主成分数作为最 佳主成分数；（4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，预测精度越高。根据以上 评价标准，发现SG -阶导数7点平滑时，其R2 = 0.970317，RMSEP = 0.080198，SEP = 0.074656,相对其它组合的预测结果更能满足模型评价标准。所以将经过SG-阶导数7点平 滑预处理后所建的模型作为最优PLS-DA预测模型，主成分15为最佳参数。PLS-DA模型建立 过程中，为了决定样本种类归属，通常需要对训练集赋予分类变量(Y)，Y矩阵必须描述特定 种类的样品，一般可以用"Γ和"〇"来表示样本属于某一类或者不属于某一类，然后通过设 定一个临界值来判定归属。图2为最优PLS-DA模型的预测结果，从图中可以看出，该模型很 好的将感染柑桔黄龙病柑桔叶片样本与不带菌柑桔叶片样本进行了正确归类。经计算，其 验证集分类准确率高达100%，表明该模型的预测准确度足以满足后期田间待测样本的定 性分类判别要求。
[0025]决定系数(R2):
①
[0027]交互验证均方根（root-mean-squares error of cross_validation，RMSCEV)
②
[0029]预测误差均方根（root-mean-squares error of prediction，RMSEP)
[0031 ]公式①、②和②中：Yi为传统分析技术得到的参考值;Ym为Yi的均值;?ξ为利用近红 外分析得到的预测值;η为建模样品数;m为主成分数;ρ为验证集样品数;1^为交叉验证得到 的预测值;&.为验证集得到的预测值。
[0032] 3、柑桔黄龙病定性分类判别模型的适用性验证:为对所建模型进行适用性验证， 重新采集了两个砂糖桔果园（1号果园与2号果园）的田间样本，每个果园按五点随机取样法 进行采样，每点采样33个，每个柑桔园共采样165个，两个柑桔园共采样330个。实时荧光定 量PCR(RT-qPCR)检测结果显示，本批次田间样品中带菌样本共297个，不带菌样本共33个， 其中1号果园带菌样本150个，不带菌样本10个，2号果园带菌样本147个，不带菌样本13个。 两个不同柑桔园样本MicroNIR光谱按照最佳参数进行预处理后，分别输入最优PLS-DA定性 分类判别模型中进行分类预测，并用卡方检验(X 2)判断模型预测值与理论值之间是否有差 异。两个不同砂糖桔果园的田间验证结果表明，PLS-DA模型的正确识别率均在99%以上，最 高达到100%，再一次验证了该模型的精确预测能力。将理论预测值与RT-qPCR的检测实际 值进行卡方检验发现，其卡方(X 2)值为〇. 357，P值为0.592，表明该模型的理论预测值与RT-qPCR所检测的实际值之间无显著差异，能精确的对待测柑桔叶片样本进行定性分类判别， 可以进一步利用该模型进行柑桔黄龙病的田间快速诊断应用。
[0033] 正确识别率（Correct recognition rate) =Nr/NiX 100%
[0034] 式中:Nr为正确识别样品本身来源的样本数;Ni为同一来源的样本个数。
【主权项】
1. 一种柑桔黄龙病的近红外光谱田间检测方法，其特征在于，包括如下步骤：51. 标准样品光谱集的建立:采用微型便携式近红外光谱仪于田间直接探测读取感染 柑桔黄龙病病菌和不带黄龙病病菌柑桔植株叶片的近红外光谱学数据；52. 定性分类判别模型的建立:将S1中的近红外光谱学数据进行校正和预处理后，分别 提取其近红外光谱学的特征值，经训练集训练和验证集验证后得到最优的PLS-DA定性分类 判别t吴型； S3 .未知样品的定性判别：用S2建立的最优的PLS-DA定性分类判别模型于田间直接区 分待测柑桔叶片样本是否已感染柑桔黄龙病。2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，光谱仪探测读数的部位为叶片背面的主叶 脉，叶龄为当年生或上年生的秋稍成熟叶片。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1所述微型便携式近红外光谱仪使用 的图谱采集软件为MicroNIR 1.5.7,测量时间为0.5 s，测量波长范围为950~1650 nm，采 集背景为钢板，光源采集直径为16 mm。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述最优PLS-DA模型评价的参数包括： 决定系数、预测误差均方根和交互验证均方根。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，决定系数值越接近于1，表示所建立模型的 预测值与真实值之间的相关性越好;预测误差均方根值越小，则能够表明试验结果和真实 值越接近，说明所建模型的预测精度越高;交互验证均方根选在其值最低处对应的主成分 数作为最佳主成分数;预测误差均方根和预测误差值越接近且越小代表模型性能越佳，预 测精度越高。
【文档编号】G01N21/359GK106018332SQ201610581372
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】曾鑫年, 陈冬梅, 王华堂
【申请人】华南农业大学