一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法。所述方法的具体步骤为：1)配制测活液；2)测定Trx标准曲线；3)测活步骤：取样品和测活液放入孔中，在37℃下反应1小时，并测定各孔样品在反应前后520nm处的荧光强度；样品中的Trx活性＝(反应后的荧光强度–反应前的荧光强度)×稀释倍数，根据标准曲线对比，计算出样品中活性Trx含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的Trx活力单位。与现有技术相比，本发明样本需求量少，特别适合血清、血浆检测，简化了检测操作步骤，降低了因检测程序复杂引入的检测结果的离散性、提高检测结果的准确性。
【专利说明】
一种荧光増效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法
技术领域
[0001]本发明属于分析检测技术领域，具体来说，涉及到一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法。
【背景技术】
[0002]硫氧还蛋白(Trx)存在于所有活细胞中，与细胞生长与存活密切相关。硫氧还蛋白也会分泌到细胞外，存在于血液及细胞外液中。该蛋白活性变化与许多疾病的发生发展有关。目前，硫氧还蛋白ELISA试剂盒，是以免疫学反应为基础，依靠抗原、抗体的特异性反应，检测硫氧还蛋白的蛋白水平。然而，硫氧还蛋白极易被体内的代谢物、中间产物修饰改变活性，组织和细胞中硫氧还蛋白的蛋白水平，不能确切地反映硫氧还蛋白的功能状态。此外，ELISA试剂盒有独特的组织特异性，实验中可能用到不同来源的样本，需要辨别哪种ELISA试剂盒能测手中的样本。至今，实验室研究中，硫氧还蛋白的测活方法主要有两种:胰岛素测活法(Luthman,B1chemistry 21:6628-6633 ； 1982.)、终点法(Arner ,Methods Enzymol300:226-239.； 1999.)及改良后的终点法(Wu，Y.Atherosclerosis 212:351-355;2010.)。胰岛素测活法，适合酶动力学研究，不适合大批量样本的测定。终点法及改良后的终点法，各实验室所用的条件及标准不尽相同，步骤较复杂，所测得的结果难以比较。
【发明内容】
[0003]为解决上述技术问题，本发明提供了一种高灵敏度、高效且简便的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法。
[0004]本发明所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、磷酸钾缓冲液;所述标准品为人硫氧还蛋白；所述酶溶液为牛硫氧还蛋白还原酶溶液;所述底物液为牛胰岛素溶液；
[0005]所述方法的具体步骤为:
[0006]I)配制测活液:现取检测缓冲液0.978ml、酶溶液0.09ml、底物液1.632ml，混合配制成测活液；
[0007]2)测定硫氧还蛋白标准曲线:取检测缓冲液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白质量浓度为0.1%，得标准品稀释液;将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成0、1、2、3、4、5yg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μ1，进行测活操作;计算每一个标准液样品在反应前后在520nm处的荧光强度值之差，并制作出Δ A52Qnm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线；
[0008]3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性人硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的人硫氧还蛋白活力单位。
[0009]所述的测活操作为:取多个酶标条，固定于酶标条专用架上，分别设置对照孔和实验孔，每份样品需要I个对照孔和2个实验孔，记录各孔位置;实验孔中，取样品20μ1和测活液30μ1放入孔中，在37 0C下反应I小时;对照孔中，放置样品20μ1，作为反应前样品；设定荧光酶标仪的激发光为480nm，发射光为520nm，测定各孔样品在反应前后520nm处的焚光强度;样品中的人硫氧还蛋白活性=(反应后的荧光强度-反应前的荧光强度)X稀释倍数。
[0010]本发明所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，所述血清白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。
[0011 ]将所述的检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品分别盛装入容量依次为2ml、ΙΟΟμ1、1.7ml及200μ1的塑料试剂瓶或EP管中，然后置于包装盒内得到荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测试剂盒。
[0012]与现有技术相比，本发明所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法的样本需求量少，仅需20μ1血清、血浆，特别适合血清、血浆检测，能非常专一地检测人血清或血浆硫氧还蛋白活性，标准曲线的线性范围在O?80ng;而且进一步简化了检测操作步骤，更好地满足自动检测设备基本流程配置的需要，进一步降低了因检测程序复杂引入的检测结果的离散性、提高检测结果的准确性。其解决了硫氧还蛋白活性检测试剂盒不适用于现行常用自动检测设备基本流程配置需要的问题，而且显著提高了检测灵敏度。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体的实施例对本发明所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。
[0014]实施例1
[0015]—种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、磷酸钾缓冲液;所述标准品为人硫氧还蛋白(hTrxl);所述的检测缓冲液中NADPH的浓度为2mM，磷酸钾浓度为250mM;所述酶溶液为浓度5μΜ的牛硫氧还蛋白还原酶溶液;所述底物液为10mg/mL的牛胰岛素溶液；
[0016]所述方法的具体步骤为:I)配制测活液:现取检测缓冲液0.978ml、酶溶液0.09ml、底物液1.632ml，混合配制成测活液；
[0017]2)测定硫氧还蛋白标准曲线:取检测缓冲液，在其中加入人血清白蛋白，使人血清白蛋白质量浓度为0.1%,得标准品稀释液;将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成O、1、2、
3、4、5yg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μ1，进行测活操作;计算每一个标准液样品在反应前后在520nm处的焚光强度值之差，并制作出△ A52Qnm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线；
[0018]所述的测活操作为:取多个酶标条，固定于酶标条专用架上，分别设置对照孔和实验孔，每份样品需要I个对照孔和2个实验孔，记录各孔位置;实验孔中，取样品20μ1和测活液30μ1放入孔中，在37 0C下反应I小时;对照孔中，放置样品20μ1，作为反应前样品；设定荧光酶标仪的激发光为480nm，发射光为520nm，测定各孔样品在反应前后520nm处的焚光强度;样品中的人硫氧还蛋白活性=(反应后的荧光强度-反应前的荧光强度)X稀释倍数；
[0019]3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性人硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的人硫氧还蛋白活力单位。
[0020]将上述检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品分别盛装入容量依次为2ml、ΙΟΟμΙ、1.7ml及200μ1的塑料试剂瓶中，然后置于包装盒内得到荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测试剂盒。
[0021]与现有技术相比，本发明所述的荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测的样本需求量少，仅需20μ1血清、血浆，特别适合血清、血浆检测，能非常专一地检测人血清或血浆硫氧还蛋白活性，标准曲线的线性范围在O?80ng;而且进一步简化了检测操作步骤，更好地满足自动检测设备基本流程配置的需要，进一步降低了因检测程序复杂引入的检测结果的离散性、提高检测结果的准确性。其解决了硫氧还蛋白活性检测试剂盒不适用于现行常用自动检测设备基本流程配置需要的问题，而且显著提高了检测灵敏度。
【主权项】
1.一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，其特征在于，所述检测方法采用四种试剂，分别为检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品；所述检测缓冲液为NADPH、磷酸钾缓冲液;所述标准品为人硫氧还蛋白；所述酶溶液为牛硫氧还蛋白还原酶溶液;所述底物液为牛胰岛素溶液； 所述方法的具体步骤为: .1)配制测活液:现取检测缓冲液0.978ml、酶溶液0.09ml、底物液1.632ml，混合配制成测活液； .2)测定硫氧还蛋白标准曲线:取检测缓冲液，在其中加入血清白蛋白，使血清白蛋白质量浓度为0.1%，得标准品稀释液;将人硫氧还蛋白用标准品稀释液配制成0、l、2、3、4、5yg/ml六个浓度，作为标准液样品；每个浓度标准液样品取20μ1，进行测活操作;计算每一个标准液样品在反应前后在520nm处的荧光强度值之差，并制作出A A52Qnm对人硫氧还蛋白浓度的标准曲线； .3)根据标准曲线对比，计算出样品中活性人硫氧还蛋白含量；用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度，计算出一个样品单位重量蛋白中所含的人硫氧还蛋白活力单位。2.根据权利要求1所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，其特征在于，所述的测活操作为:取多个酶标条，固定于酶标条专用架上，分别设置对照孔和实验孔，每份样品需要I个对照孔和2个实验孔，记录各孔位置;实验孔中，取样品20μ1和测活液30μ1放入孔中，在37°C下反应I小时;对照孔中，放置样品20μ1，作为反应前样品；设定荧光酶标仪的激发光为480nm，发射光为520nm，测定各孔样品在反应前后520nm处的荧光强度;样品中的人硫氧还蛋白活性=(反应后的荧光强度-反应前的荧光强度)X稀释倍数。3.根据权利要求1所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，其特征在于，所述血清白蛋白为人血清白蛋白或牛血清白蛋白。4.根据权利要求1所述的一种荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测方法，其特征在于，将所述的检测缓冲液、酶溶液、底物液和标准品分别盛装入容量依次为2ml、ΙΟΟμΙ、1.7ml及200μ1的塑料试剂瓶或EP管中，然后置于包装盒内得到荧光增效的高通量硫氧还蛋白活性检测试剂盒。
【文档编号】G01N21/64GK106092998SQ201610683460
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月17日 公开号201610683460.8, CN 106092998 A, CN 106092998A, CN 201610683460, CN-A-106092998, CN106092998 A, CN106092998A, CN201610683460, CN201610683460.8
【发明人】梁巍, 刘军, 杜澄
【申请人】北京中科研源科技发展有限公司