一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法
【专利摘要】一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，属于化学检测的技术领域。该方法将标记了抗凝血酶的量子点和阳离子大分子加入到待测含有肝素的样品溶液中，随后以装配了光谱成像装置的荧光显微镜为检测平台，取样观察量子点团聚比例，以团聚比例与肝素浓度的关系作标准曲线，然后对未知样品中的肝素定量。本专利以抗凝血酶专一识别肝素，避免了以往通过非专一性的静电相互作用识别肝素带来的检测误差，同时检测的是肝素的活性组分，而非肝素总量。此外，以团聚比例而非荧光强度为定量基础，避免了荧光强度波动带来的误差。最后，此方法还具有检测灵敏度高的优点，可达到9.3×10?5 U/mL。
【专利说明】
一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，属于化学检测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 肝素是一种非均质的线性多聚糖，带有大量负电荷。在临床上用做抗凝血剂。手术 过程中需要即时监测血液中肝素浓度，防止肝素过量导致的内出血和肝素不足导致的凝 血。手术后也需要快速及时检测血液中肝素浓度，以便尽快中和掉肝素，防止出血。同时，准 确了解肝素浓度，有利于精确注射肝素中和剂(精蛋白）的量，防止中和剂过量引起的副作 用。现有临床上肝素的"定量"方法是通过监测凝血过程中血液粘度的变化时间来推测肝素 的量。通过凝血时间推测肝素含量的方法不是准确的直接定量法，而且由于凝血过程十分 复杂，个体与个体之间凝血时间的差异，导致这种方法测量的肝素含量并不准确。
[0003] 最近几年文献中报道了大量的肝素定量分析方法。归根结底是探针的选择，信号 的变化方式以及肝素的识别。简单来说，探针种类包括了有机荧光染料、金属有机化合物与 聚集染料的复合物、贵金属纳米粒子、量子点等。信号的变化方式包括了荧光信号的增强、 瑞利散射信号的增强、荧光信号的减小、最大吸收波长的移动、电信号的增强以及几种信号 的组合使用。在肝素的识别中则都利用了肝素带有负电荷的性质，通过静电吸引使肝素与 探针结合。这种静电识别的方式并不是专一的相互作用，血液中含有大量的正离子物质能 够与肝素结合使得测得信号不精确。另外，大约有60%左右的肝素没有抗凝血性，它们同样 带有负电荷。因此通过静电吸引测到的肝素量不能区分活性成分和非活性成分，导致测量 结果偏高。因此，发展一种快速、灵敏、准确的检测血液中肝素浓度的方法具有十分重要的 意义。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供一种通过计数量子点团聚比例定量 肝素的方法，该方法避免了使用光、电、磁、力等信号的强度变化进行定量分析，降低了信号 波动带来的误差，以便快速、灵敏、准确的检测血液中肝素浓度。
[0005] 本发明采用的技术方案是：一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，包括 以下步骤： (1) 将量子点(QD)表面修饰抗凝血酶(ΑΤ-ΠΟ; (2) 将修饰了抗凝血酶的量子点(ΑΤ-ΙΠ-QD)和阳离子大分子加入肝素样品中孵育10-40 min； (3) 取上述体系中溶液5yL滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像，荧光显微镜配置高 灵敏光谱成像装置； (4) 以QD的激发波长照射载玻片10 - 30min，在照射过程中记录QD的成像及其光谱蓝移 和漂白过程； (5) 在光谱蓝移和漂白的过程中发生光谱分裂的QD为团聚量子点，其余为单个量子点； (6) 计算团聚量子点与团聚量子点加单个量子点之和的比例，将此比例作为定量依据。
[0006] 所述阳离子大分子是结合多个量子点的分子或分子聚合体。
[0007] 所述多个量子点的分子或分子聚合体是阳离子表面活性剂、阳离子高分子聚合物 或阳尚子生物大分子。
[0008] 所述的通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，用于肝素的定量检测，在肝素 浓度为4.65ΧΠΓ4 U/mL - 0.023 U/mL范围内，所述肝素浓度与量子点的团聚比例的变化 呈线性关系，线性方程为y = 〇. 1189+0.01731x;相关系数0.995;最小可检测浓度9.3 X 10一5 U/mL;比现有肝素钠检测方法低至少1个数量级。
[0009] 本发明的有益效果是:这种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，将标记了 AT-ΠΙ- QD和阳离子大分子加入到待测含有肝素的样品溶液中，随后以装配了光谱成像装 置的荧光显微镜为检测平台，取样观察量子点团聚比例，以团聚比例与肝素浓度的关系作 标准曲线，然后对未知样品中的肝素定量。该方法以抗凝血酶专一识别肝素，避免了以往通 过非专一性的静电相互作用识别肝素带来的检测误差，同时检测的是肝素的活性组分，而 非肝素总量。此外，以团聚比例为定量基础，而非以光、电、磁、力等信号的强度变化进行定 量分析，降低了信号波动带来的误差，避免了荧光强度等波动带来的误差。最后，此方法在 单颗粒水平上成像定量，具有检测灵敏度高的优点，检测限可达到9.3 X 1(T5 U/mL。
【附图说明】
[0010]图1为检测方法原理示意图。
[0011] 图2为单个量子点的漂白过程。
[0012] 图3为团聚量子点的光谱分裂过程。
[0013] 图4为不同浓度肝素与团聚比例相关性。
【具体实施方式】
[0014] -种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，包括以下步骤： (1) 将量子点(QD)表面修饰抗凝血酶(ΑΤ-ΠΟ; (2) 将修饰了抗凝血酶的量子点(ΑΤ-ΙΠ-QD)和阳离子大分子加入肝素样品中孵育10-40 min； (3) 取上述体系中溶液5yL滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像，荧光显微镜配置高 灵敏光谱成像装置； (4) 以QD的激发波长照射载玻片10 - 30min，在照射过程中记录QD的成像及其光谱蓝移 和漂白过程； (5) 在光谱蓝移和漂白的过程中发生光谱分裂的QD为团聚量子点，其余为单个量子点； (6) 计算团聚量子点与团聚量子点加单个量子点之和的比例，将此比例作为定量依据。
[0015] -种通过计数量子点团聚比例肝素的方法，可用于肝素的定量检测，在肝素浓度 9.3ΧΠΓ 5 U/mL - 2.3ΧΠΓ2 U/mL范围内，肝素浓度与量子点的团聚比例的变化呈线性关 系，线性方程为y = 〇. 1189+0.01731x;相关系数0.995;最小可检测浓度9.3 X 10一5 U/mL;比 现有肝素钠检测方法低至少1个数量级。
[0016] 实施例1 a.取86.5 yL 硼酸缓冲溶液（50 mM，ρΗ8·3)，加入2.5 yL ΑΤ-ΙΠ-QD (20nM)，混匀， 将一定浓度的肝素钠标准液1 yL加入上述溶液，混匀，放入38 °C的水浴锅恒温35 min，取 出。
[0017] b.向上述溶液中加入10 yL CTAB (2mM)，混匀，静止2 min,待用。
[0018] c.取上述溶液1.5 yL，滴于载玻片，上荧光显微镜成像，观察，拍摄。
[0019] d.定量实验:重复步骤a-c，得到不同浓度肝素标准液的荧光成像图，对拍摄得到 的数据用image J进行处理，计算不同浓度下QDs的聚合比例。以肝素浓度为横坐标，团聚比 例为纵坐标作图，在9.30 XUT5 - 2.33 Χ10-2 U/mL范围内呈线性关系，线性相关系数 0.99545.(参见图 4)。
[0020] 实施例2 1. 血浆空白溶液团聚比例测定： a.取血浆原液0.5，1.0，2.0, 4.0，10.0 yL分别加入硼酸缓冲液，混匀，再依次加入 2.5 yL AT-m-QD溶液，最后以硼酸缓冲溶液定容，使终体积为100 yL，血浆的最终稀释倍 数分别为200,100,50,25,10。混匀后放入38 °C的水浴锅恒温35 min,取出。
[0021] b.向上述溶液中加入10 yL CTAB (2mM)，混匀，静止2 min,待用。
[0022] c.取上述溶液1.5 yL，滴于载玻片，上荧光显微镜成像，观察，拍摄。
[0023] d.定量实验:重复步骤a-c，得到不同浓度肝素标准液的荧光成像图，对拍摄得到 的数据用image J进行处理，计算不同浓度下QDs的聚合比例。团聚比例见表1。
[0024] 表1不含肝素血浆中量子点团聚比例测定 2. 血浆中加标肝素的检测 a.取一系列血浆溶液100 yL，分别加入2.5 μΜ的肝素钠溶液40、20、10、5、2 yL，混匀， 待用。上述溶液依次取0.7、1.2、2.2、4.2、10.2以1^分别加入2.5以1^八1'-111-0〇溶液中，再加 入一定量的硼酸缓冲溶液，使终体积为90 yL。混匀后放入38 °C的水浴锅恒温35 min,取 出。
[0025] b.向上述溶液中加入10 yL CTAB (2mM)，混匀，静止2 min,待用。
[0026] c.取上述溶液1.5 yL，滴于载玻片，上荧光显微镜成像，观察，拍摄。
[0027] d.定量实验:重复步骤a-c，得到不同浓度肝素标准液的荧光成像图，对拍摄得到 的数据用image J进行处理，计算不同浓度下QDs的聚合比例。定量结果见表2。
[0028]表2加标肝素定量结果
【主权项】
1. 一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 将量子点表面修饰抗凝血酶； (2) 将修饰了抗凝血酶的量子点和阳离子大分子加入肝素样品中孵育10 - 40 min; (3) 取上述体系中溶液5 yL滴于载玻片上，置于荧光显微镜下成像，荧光显微镜配置高 灵敏光谱成像装置； (4) 以量子点的激发波长照射载玻片10 - 30 min，在照射过程中记录量子点的成像 及其光谱蓝移和漂白过程； (5) 在光谱蓝移和漂白的过程中发生光谱分裂的量子点为团聚量子点，其余为单个量 子点； (6) 计算团聚量子点与团聚量子点加单个量子点之和的比例，将此比例作为定量依据。2. 根据权利要求1所述的一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，其特征在于： 所述阳离子大分子是结合多个量子点的分子或分子聚合体。3. 根据权利要求2所述的一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，其特征在于： 所述多个量子点的分子或分子聚合体是阳离子表面活性剂、阳离子高分子聚合物或阳离子 生物大分子。4. 根据权利要求1所述的一种通过计数量子点团聚比例定量肝素的方法，其特征在于： 用于肝素的定量检测，在肝素浓度为4.65ΧΚΓ 4 U/mL - 0.023 U/mL范围内，所述肝素浓度 与量子点的团聚比例的变化呈线性关系，检测限达到9.3Xl(T5U/mL。
【文档编号】G01N21/64GK106092989SQ201610418201
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610418201.2, CN 106092989 A, CN 106092989A, CN 201610418201, CN-A-106092989, CN106092989 A, CN106092989A, CN201610418201, CN201610418201.2
【发明人】盖宏伟, 董苏利, 宗成华, 赵文峰, 张清泉, 刘晓君, 黄华, 李险峰
【申请人】江苏师范大学