专利名称：：一种测定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法，更具体而言，涉及采用本申请所述的葡萄糖氧化酶-分光光度法测定低乳糖牛奶的乳糖水解率的方法。
背景技术：
：低乳糖牛奶是利用乳糖酶将牛奶中乳糖进行水解，水解产生葡萄糖和半乳糖，因此水解率是衡量低乳糖牛奶水解程度的一项重要的生产指标。目前文献资料报导中所介绍的测定低乳糖牛奶水解率的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)(甘宾宾，2001)、凝固点下降法(马夫霞，2002)、碘量法(秦立虎，2003)等几种。其中HPLC法是以色谱仪作为基础，其最大的优点就是乳糖水解率测定的准确度高，但不足之处是每次开机的费用很高，即使大型的乳品企业该方法也不能接受；而其他的几种方法也由于所需要有专用的仪器及其相关的配套试剂，或是由于其检测分析的周期过长以及所测定的结果的准确性差等原因，也使得这些方法目前很难在实际的检测分析中得到应用，并且这些检测低乳糖牛奶乳糖水解率的方法必须有对照样，即必须保留未水解的牛奶，以便在测定乳糖水解率时用来测定未水解时牛奶中乳糖的浓度，这对于成品检测是无法实现的。发明人通过研究发现，1分子的乳糖在乳糖酶的作用下水解生成1分子的葡萄糖和1分子的半乳糖，样品中的葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化生成葡萄糖酸及过氧化氢，后者在过氧化氢酶的作用下，将还原性4-氨醛按提比林与酚偶联缩合成可被分光光度计测定的红色醌类化合物。生成的醌类化合物颜色的深浅与葡萄糖含量成正比，分别测定标准管与样品管的吸光光度值，则可计算葡萄糖的含量，通过葡萄糖浓度可计算出水解的乳糖浓度，如果牛奶是完全水解的，则通过葡萄糖浓度可计算出水解以前牛奶中乳糖的浓度。发明人基于此而完成了本发明。
发明内容本发明解决了
背景技术：
提到的现有技术方案中的不足之处，从乳糖水解反应的本质出发，提供了一种测定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法—葡萄糖氧化酶-分光光度法，其采用葡萄糖氧化酶—分光光度法测定牛奶中乳糖的水解率，可降低检测成本，快速简便地测定低乳糖牛奶的乳糖水解率。本发明的葡萄糖氧化酶-分光光度法的技术方案如下(a).测定低乳糖牛奶水解后的乳糖浓度；(b).测定低乳糖牛奶水解前的乳糖浓度；(c).具体操作步骤如下(a).测定低乳糖牛奶水解后的乳糖浓度先给乳糖水解牛奶中加入混合试剂沉淀蛋白制备样品A；然后，吸取等体积的标准葡萄糖溶液和样品A，例如各取20μL，加入到酶试剂与酚试剂混合组成的工作液中；在30℃-40℃下反应一段时间，优选15-30分钟；于500-520nm，优选505nm的紫外可见分光光度计下测定其吸光度值，根据标准葡萄糖浓度，计算样品的葡萄糖浓度，再根据该浓度计算出水解的乳糖的浓度；(b).测定低乳糖牛奶水解前的乳糖浓度；步骤(b)中，首先制备乳糖完全水解牛奶每升低乳糖牛奶中加入5000-10000NLU(NeutralLactaseUnits，即中性乳糖酶单位)的乳糖酶，在30℃-40℃的水浴中反应一段时间，优选2-4小时，该量及反应时间确保低乳糖牛奶中未水解的乳糖完全水解——即乳糖水解率可达100％；然后，加入混合试剂，制备样品B；再吸取等体积的标准葡萄糖溶液和样品B，加入到酶试剂与酚试剂混合组成的工作液中；在30℃-40℃下反应一段时间，优选15-30分钟；于500-520nm，优选505nm的紫外可见分光光度计下测定其吸光度值，根据标准葡萄糖浓度，计算样品的葡萄糖浓度，再根据该浓度计算出水解前的乳糖的浓度；(c).计算乳糖水解率在上述方案中，所述的混合试剂为试剂carrez甲和carrez乙组成，czrrez甲由质量百分比浓度为1.5％-3.0％，优选2.0％的K4Fe(CN)6·3H2O水溶液组成；carrez乙由质量百分比浓度为3.0％-6.0％，优选4.0％的ZnSO4·7H2O水溶液组成，优选地，所述的混合试剂为等体积的carrez甲和carrez乙组成。其中，在样品A和样品B的制备中，优选地，还加入能将牛奶稀释至10-100倍，例如20倍体积的蒸馏水，之后再振荡后静置一段时间，优选10-20分钟，然后过滤。其中，所用的工作液由酶试剂和酚试剂组成，优选地，由等体积的酶试剂和等体积的酚试剂组成；酶试剂由≥10500U/L的葡萄糖氧化酶、≥8000U/L的过氧化物酶和≥0.1g/L4-氨基安替吡啉组成，酚试剂由≥0.5g/L的苯酚组成。其中，样品中葡萄糖浓度为0-4.5g/L，随着葡萄糖的增加，测定管的吸光度值与浓度呈线性相关，r2≥0.995。其中，样品葡萄糖的浓度(g/L)为1为标准葡萄糖的浓度(g/L)；水解的乳糖浓度(g/L)为葡萄糖浓度(g/L)×2×(10-100)，其中2表示1个单位质量的乳糖可水解成2个单位质量的葡萄糖，10-100代表制备样品A和B时所取原始牛奶的稀释倍数，下同。其中，乳糖完全水解牛奶是通过下述方法制备的给低乳糖牛奶中再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶，水解2-4小时，例如加入10000NLU/L的乳糖酶水解2小时，将未水解的乳糖完全水解；如果是奶粉，将奶粉还原后，再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶，水解2-4小时，例如加入5000NLU/L的乳糖酶水解4小时，将未水解的乳糖完全水解。在本发明中，所述的低乳糖牛奶是指牛奶中添加乳糖酶，使牛奶中的乳糖部分水解，乳糖的水解率≥70％。一般牛奶中的乳糖水解率达到70％，就能解决乳糖不耐受症(马夫霞，2002)。与目前现有技术中的其他检测方法相比，本发明的检测方法速度快、费用低、准确度高，并且检测成品低乳糖乳制品的水解率不需要对照样品，所述的对照样品为必须用没加乳糖酶的相同批次的牛奶，并且本发明的方法尤其适于检测成品中的乳糖水解率。具体实施例方式实施例1A.测定低乳糖液态奶乳糖水解量(1)制备样品A取1ml乳糖水解牛奶加1mlcarrez试剂甲和1mlcarrez试剂乙沉淀蛋白，再加7ml蒸馏水稀释到10倍，振荡后静置约10分钟，然后过滤，过滤液称为样品A；(2)分别吸取20μL1g/L的葡萄糖标准溶液和20μL样品A加入到酶试剂与酚试剂等体积混合的工作液中；(3)之后，将其置于30℃恒温水浴中，反应30分钟，在500nm波长处分别测定葡萄糖标准液和样品的吸光度值，计算滤液中葡萄糖的浓度此葡萄糖的浓度就是水解了的乳糖释放的葡萄糖的浓度，所以通过葡萄糖的浓度就可计算出水解的乳糖的浓度。(4)计算水解的乳糖浓度(g/L)＝葡萄糖浓度(g/L)×2×10。B.测定水解前液态奶中乳糖含量(1)制备乳糖完全水解牛奶在1000mL的乳糖水解牛奶中再加入5000个单位的乳糖酶，即最终浓度为5000NLU/L的乳糖酶，在30℃的水浴中放置4小时，确保乳糖水解牛奶中未水解的乳糖全部水解，即得乳糖完全水解牛奶；(2)制备样品B取1mL乳糖完全水解牛奶加1mLcarrez试剂甲和1mLcarrez试剂乙沉淀蛋白，再加7mL蒸馏水稀释到10倍，振荡后静置约10分钟，然后过滤；(3)分别吸取20μL1g/L的葡萄糖标准溶液和20μL样品B，加入到由等体积的酶试剂与酚试剂混合组成的工作液中；(4)然后，将其置于30℃恒温水浴中，反应30分钟，在500nm波长处分别测定葡萄糖标准液和样品的吸光度值，然后计算滤液中葡萄糖的浓度此葡萄糖浓度就是乳糖完全水解后产生的葡萄糖的量，所以通过葡萄糖的浓度可推算出水解前牛奶中乳糖的浓度(5).计算水解前牛奶中乳糖浓度乳糖浓度(g/L)＝葡萄糖浓度(g/L)×2×10。C.计算乳糖水解率实施例2A.测定低乳糖液态奶乳糖水解量(1)制备样品A取10ml乳糖水解牛奶加10mlcarrez试剂甲和10mlcarrez试剂乙沉淀蛋白，再加970ml蒸馏水稀释到100倍，振荡后静置约20分钟，然后过滤，过滤液称为样品A；(2)分别吸取50μL1g/L的葡萄糖标准溶液和50μL样品A加入到由酶试剂与酚试剂等体积混合的工作液中；(3)之后，将其置于40℃恒温水浴中，反应15分钟，在520nm波长处分别测定葡萄糖标准液和样品的吸光度值，计算滤液中葡萄糖的浓度此葡萄糖的浓度就是水解了的乳糖释放的葡萄糖的浓度，所以通过葡萄糖的浓度就可计算出水解的乳糖的浓度。(4)计算水解的乳糖浓度(g/L)＝葡萄糖浓度(g/L)×2×100。B.测定水解前液态奶中乳糖含量(1)制备乳糖完全水解牛奶在1000mL的乳糖水解牛奶中再加入10000个单位的乳糖酶，即最终浓度为10000NLU/L的乳糖酶，在40℃的水浴中放置2小时，确保乳糖水解牛奶中未水解的乳糖全部水解，即得乳糖完全水解牛奶；(2)制备样品B取10mL乳糖完全水解牛奶加10mLcarrez试剂甲和10mLcarrez试剂乙沉淀蛋白，再加970mL蒸馏水稀释到100倍，振荡后静置约20分钟，然后过滤；(3)分别吸取50μL1g/L的葡萄糖标准溶液和50μL样品B，加入到由等体积的酶试剂与酚试剂混合组成的工作液中；(4)然后，将其置于40℃恒温水浴中，反应15分钟，在520nm波长处分别测定葡萄糖标准液和样品的吸光度值，然后计算滤液中葡萄糖的浓度此葡萄糖浓度就是乳糖完全水解后产生的葡萄糖的量，所以通过葡萄糖的浓度可推算出水解前牛奶中乳糖的浓度(5).计算水解前牛奶中乳糖浓度乳糖浓度(g/L)＝葡萄糖浓度(g/L)×2×100。C.计算乳糖水解率实施例3A.低乳糖奶粉水解后乳糖水解量的测定(1)制备样品A取10g奶粉定容到100mL的容量瓶，制成还原奶粉，然后取5mL还原奶粉加5mLcarrez试剂甲和5mLcarrez试剂乙沉淀蛋白，再加235mL蒸馏水稀释到50倍，振荡后静置约15分钟，然后过滤，过滤液即为样品A；(2)分别吸取30μL1g/L的葡萄糖标准溶液和30μL样品A加入到酶试剂与酚试剂等体积混合工作液中；(3)之后，将其置于35℃恒温水浴中，反应20分钟，在510nm波长处分别测定葡萄糖标准液和样品的吸光度值，计算滤液中葡萄糖的浓度此葡萄糖的浓度就是还原奶粉中水解了的乳糖释放的葡萄糖的浓度，所以通过葡萄糖的浓度就可计算出还原奶粉中水解的乳糖的浓度。(4)计算水解的乳糖浓度乳糖浓度(g/L)＝葡萄糖浓度(g/L)×2×50。B.测定水解前奶粉乳糖含量(1)制备乳糖完全水解奶粉取10g奶粉定容到100mL的容量瓶制成还原奶粉，然后加入750个单位的乳糖酶，即最终为7500NLU/L的乳糖酶，在35℃的水浴中放置3小时，确保乳糖水解奶粉中未水解的乳糖全部水解，即为乳糖完全水解奶粉；(2)制备样品B取5mL乳糖完全水解牛奶加5mLcarrez试剂甲和5mLcarrez试剂乙沉淀蛋白，再加235mL蒸馏水稀释到50倍，振荡后静置约15分钟，然后过滤，过滤液即为样品B；(3)分别吸取30μL1g/L的葡萄糖标准溶液和30μL样品B，加入到酶试剂与酚试剂等体积混合的工作液中；(4)之后，将其置于35℃恒温水浴中，反应20分钟，在510nm波长处分别测定葡萄糖标准液和样品的吸光度值，让后计算滤液中葡萄糖的浓度此葡萄糖浓度就是还原奶粉中乳糖完全水解后产生的葡萄糖的量，所以通过葡萄糖的浓度可推算出还原奶粉水解前乳糖的含量。(5)计算水解前乳糖浓度乳糖浓度(g/L)＝葡萄糖浓度(g/L)×2×50。C.计算奶粉乳糖水解率试验1葡萄糖氧化酶—分光光度法测定葡萄糖的回收率试验对葡萄糖氧化酶—分光光度法测定葡萄糖含量的准确度进行试验，分别取0.1018、0.1504、0.2021、0.2507、0.3016g葡萄糖加入到100mL牛奶中，按照本申请说明书中实施例1的方法处理样品后测定葡萄糖的值，将所测结果在表1中列出表1葡萄糖氧化酶—分光光度法测定葡萄糖的回收率试验结果<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="835">12345</table></tables>从表1可以看出，葡萄糖的回收率在97％-101％之间，从而表明本申请的方法测定的葡萄糖含量的准确度很高。试验2葡萄糖氧化酶—分光光度法测定牛奶中乳糖水解率的精密度试验对葡萄糖氧化酶—分光光度法测定牛奶中乳糖水解的精密度进行试验，给牛奶中加入2000NLU/L的乳糖酶在37℃的条件下水解1小时，水解后在沸水中将乳糖酶灭活，按照本申请所述的实施例1或实施例2的方法处理样品后测定乳糖水解前后的乳糖的量，所测结果如表2所示表2葡萄糖氧化酶—分光光度法测定牛奶中乳糖水解率的精密度试验注标准管的吸光度值为0.250。从表2可看出，测定结果的变异系数分别为1.7％和2.1％，从而表明，本申请的方法测定的牛奶中乳糖水解率的精密度很好。本发明在本文中所述的和要求的不受本文公开的特定实施方案的限制，因为实施方案旨在阐述本发明的某些方面。任意同等的实施方案也包括在本发明内。实际上，除了本文中显示的和描述的，对本领域技术人员而言，本发明对上述描述的各种改变都是显而易见的。这些改变也落入附加权利要求的范围内。权利要求1.一种低乳糖牛奶中乳糖水解率的测定方法，其特征在于，该方法包括(a).测定低乳糖牛奶水解后的乳糖浓度；(b).测定低乳糖牛奶水解前的乳糖浓度；(c).计算乳糖水解率其中，步骤(a)中，首先给乳糖水解牛奶中加入混合试剂沉淀蛋白制备样品A；然后，吸取等体积的标准葡萄糖溶液和样品A，加入到由酶试剂与酚试剂混合组成的工作液中；在30℃-40℃下反应一段时间；于500-520nm的紫外可见分光光度计下测定其吸光度值，根据标准葡萄糖浓度，计算样品的葡萄糖浓度，再根据该浓度计算出水解的乳糖浓度；步骤(b)中，首先制备乳糖完全水解牛奶每升低乳糖牛奶中加入5000-10000NLU的乳糖酶，在30℃-40℃的水浴中反应一段时间，该量及反应时间确保低乳糖牛奶中未水解的乳糖完全水解；然后，加入混合试剂，制备样品B；再吸取等体积的标准葡萄糖溶液和样品B，加入到酶试剂与酚试剂混合组成的工作液中；在30℃-40℃下反应一段时间；于500-520nm的紫外可见分光光度计下测定其吸光度值，根据标准葡萄糖浓度，计算样品的葡萄糖浓度，再根据该浓度计算出水解前的乳糖的浓度。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中所述的混合试剂为试剂carrez甲和carrez乙组成，czrrez甲由质量百分比浓度为1.5-3.0％的K4Fe(CN)6·3H2O水溶液组成；carrez乙由质量百分比浓度为3.0％-6.0％的ZnSO4·7H2O水溶液组成。3.根据权利要求1或2的测定方法，其特征在于，其中在步骤(a)和(b)中，与工作液反应时间为15-30分钟，在步骤(b)中，与乳糖酶反应时间为2-4小时，czrrez甲由质量百分比浓度为2.0％的K4Fe(CN)6·3H2O水溶液组成；carrez乙由质量百分比浓度为4.0％的ZnSO4·7H2O水溶液组成。4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，其中在样品A和样品B的制备中，在加入混合试剂后，还可加入能将牛奶稀释至10-100倍体积的蒸馏水，之后再振荡后静置10-20分钟，然后过滤。5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，其中标准葡萄糖溶液的浓度为1g/L，所述的混合试剂为等体积的carrez甲和carrez乙组成，其中吸光度值是在500-520nm的紫外可见分光光度计下测定。6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，其中所用的工作液由等体积的酶试剂和等体积的酚试剂组成。7.根据权利要求书6所述的测定方法，其特征在于，其中酶试剂由≥10500U/L的葡萄糖氧化酶、≥8000U/L的过氧化物酶和≥0.1g/L4-氨基安替吡啉组成，其中酚试剂由≥0.5g/L的苯酚组成。8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，其中样品中葡萄糖浓度为数值为0-4.5g/L，随着葡萄糖浓度的增加，测定管的吸光度值与浓度呈线性相关，r2≥0.995。9.根据权利要求1中所述的测定方法，其特征在于，其中水解的乳糖浓度(g/L)为葡萄糖浓度(g/L)×2×(10-100)。10.根据权利要求1或7所述的测定方法，其特征在于，其中乳糖完全水解牛奶是通过下述方法制备的给低乳糖牛奶中再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶，将未水解的乳糖完全水解，如果是奶粉，将奶粉还原后，再加入5000-10000NLU/L的乳糖酶水解。全文摘要本申请公开了一种测定低乳糖牛奶中乳糖水解率的方法，更具体而言，涉及采用本申请所述的葡萄糖氧化酶－分光光度法测定低乳糖牛奶的乳糖水解率的方法；该方法包括(a)测定牛奶水解后的乳糖浓度；(b)测定牛奶水解前的乳糖浓度；(c)计算乳糖水解率，水解率=(水解后的乳糖浓度/水解前的乳糖浓度)×100%。本发明的检测方法速度快、费用低、准确度高。文档编号G06F19/00GK101034066SQ20071000714公开日2007年9月12日申请日期2007年2月3日优先权日2007年2月3日发明者卜建斌,云战友申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司