专利名称：一种与miRNA相关的功能性分子标记的开发方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传技术领域，特别是涉及一种与miRNA相关的功能性分子标记的开发方法。
背景技术：
以PCR为基础的分子标记技术在种质资源评估、遗传多样性分析、遗传图谱构建、 基因定位和克隆以及分子标记辅助选择育种等方面都起着非常重要的作用。目前应用较多的标记是 simple sequence repeats (SSR) Λ Amplified fragment length polymorphism (AFLP)等标记，这些标记技术由于存在许多不足之处，因而限制了其应用，如SSR标记系统虽然具有较高的稳定性、准确性和可操作性，但多态性较差，一般在一个物种中设计的引物在本物种中扩增的多态性比例不超过30%，多数SSR引物扩增的标记数仅为1-2个，效率较低。AFLP标记技术的多态性和高效性比SSR高，但是其操作过程复杂，稳定性较差。所以有必要开发一种新的具有高稳定性、准确性、多态性和可操作性等特点的标记系统，使其同时具备SSR和AFLP技术的优点，提高标记系统的使用效率。目前进行了基因组测序的物种主要是模式生物、具有重要价值的部分微生物、植物和动物，绝大多数物种基因组序列还未知，在短期内较难获得。一个物种的标记系统的建立是开展该物种分子遗传学研究的基础，目前主要应用不需要序列信息的AFLP标记和 RAPD标记等传统的标记技术建立物种标记系统，或者用近缘种或模式生物引物信息进行移植开发，但这些方法较难满足研究的需要，因为前者稳定性较差，后者由于物种序列特异性较强而使物种之间序列可移植性较弱。因此有必要根据近缘种或模式生物的保守序列设计引物，然后将引物信息移植到被研究的物种中，加快研究进程。MicroRNAs(miRNAs)是一种生物体的内源性非编码RNA分子，是一类长度为20 25 nt的小分子序列，其典型特征是具有发卡结构。无论在低等的线虫还是在高等植物和哺乳动物中，miRNA都广泛存在。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而成，随后与特异蛋白质组装形成RNA诱导沉默复合体，再通过与碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的差异调控沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶 mRNA的翻译。miRNA通过各种途径对生物体进行调控，包括生长、发育、生物胁迫、病毒侵袭、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、表观遗传学调控和转座子活动等等。目前被鉴定的15172条(截止2010年9月)miRNAs均被由著名的Sanger研究所主办的miRBase公开网站(http //microrna. sanger. ac. uk/)所整理并加以注释。由于目前miRNA研究的历程较短，验证工作困难，所以每一物种最终的小RNA数目还未确定，但据估计miRNAs的数量约为生物体中编码基因数量的1%，并且同源拷贝数较多和数目庞大，这为标记的开发做好了铺垫。在不同的物种中，其成熟的miRNA具有较大的序列同源性，以及前体的茎环结构具有相当大的保守性。人们可以根据比较基因组学方法并结合生物信息软件对已知序列进行搜索比对，再根据同源性的程度进行RNA 二级结构预测和最小自由折叠能系数计算，将符合条件的候选miRNA与已经通过实验鉴定的miRNA分子进行比较分析，最终确定该物种 miRNA的分布及数量。miRNA所具有的较高的保守性也说明了它具有较好的移植性(一个物种的DNA序列片段在另外一个物种也可以被检测到)。miRNA对应的DNA片段，在本发明中被命名为miDNA，作为基因组的特殊组成部分，具有数目多，同源拷贝数多和可 移植性好的特点。miDNA作为新的功能性标记的开发目前还未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与miRNA相关的功能性分子标记的开发方法。该方法的技术方案如下
将miRNA数据库中已知的miRNA序列与被研究物种已公开的DNA序列进行BlastN比对，根据碱基错配的数目和相似程度确定miDNA候选序列，然后将其左右延伸一定距离达到150bp左右，再经过茎环二级结构预测和最小自由折叠能系数的计算确定前体miDNA位点；将筛选出的所有前体miDNA序列进行分类比对，根据保守序列设计引物，然后将设计好的引物在数据库中进行电子比对，确定其是否为miDNA特有序列；最后根据各引物的退火温度大小相互组合，开发出一种效率高和多态性好的功能性标记。本发明具体通过以下步骤实现
(1)从miRNA数据库(http://www.mirbase.org/)中下载所有的miRNA序列，以下载的序列为种子序列即query序列，然后与被研究物种的已知序列进行blastN (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)比对，符合以下条件的为miDNA候选序列
条件一若query序列为被研究物种序列，则匹配序列容忍存在3个以内碱基的错配； 若query序列为被研究物种之外的序列，则匹配序列容忍存在5个以内碱基的错配； 条件二 query序列与匹配序列相似性达到90%以上； 条件三query序列与匹配序列E值在0. 1以下；
(2)将miDNA候选序列向左右延伸大致相等的长度达到150bp左右，得到被称为可能的前体miDNA，简称为pre-miDNA ；
(3)禾I」MRNA structure 5. 1(http//www. softpedia. com/get/Science-CAD/ RNAstructure. shtml)对可能的pre-miDNA序列进行二级结构的预测，并计算最低自由折叠能系数
若miDNA候选序列在可能的pre-miDNA序列茎环结构的茎上，同时miDNA中A + U含量在30% 70%之间、miDNA与其在另一臂上的互补链之间的错配不超过6个碱基、并且自由折叠能系数(MFEI)为-85 kcal/mol以上，则此序列为miDNA序列；
(4)将miDNA序列所对应的前体序列pre-miDNA，进行all-by-allBlastN比对分析， 然后根据比对的E值将pre-miDNA分成不同的亚类，E值小于e,为符合，然后再将每个亚类利用本地化的 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)软件进行序列提取，将提取的序列进行 ClustalW(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)比对， 寻找出保守序列；
(5)禾丨J 用 Primer Premier 6. 0 (http://primer-premier. downloadaces. com/)软件对保守序列进行单条引物的设计，引物设计的原则为退火温度为55-60°C，引物长度在 18-25之间，最佳长度为22个碱基，然后将设计的引物与在miRNA (http://www. mirbase.org/)数据库中下载的序列和被研究物种的基因组序列进行比对，确定设计的引物不能与 pre-miDNA之外的序列匹配上；
(6)将设计好的引物按退火温度相近的引物放在一组组合的原则进行随机相互组合， 或者将设计的引物与ISSR引物进行组合；
(7)将组合的引物对在被研究物种有代表性的材料中进行引物筛选，挑选出带型清楚、多态性好和稳定性好的引物组合作为该物种的参考引物组合。 上述方法得到的参考引物组合可以被应用于近缘种或其它物种中，增加近缘种或其它物种标记开发能力。
图1为甘蓝型油菜中与MicroRNAs相关的功能性分子标记优良引物组合筛选结果，实验材料从左向右分别为中双11号、华双3号、油研9号、油研11号、浠水油菜白、黄岩宁波种、五峰红杆子、余井花籽、三都黄油菜和德清金菜籽。所使用的引物组合分别为附表 3 中的 miBNl- miBN5。本发明的有益效果
(1)小RNA有关的标记以PCR扩增为基础，具有较高的稳定性和多态性，结合了SSR标记和AFLP标记的优点；
(2)由于小RNA具有较高的保守性，所以小RNA有关的标记具有较高的可移植性，尤其适合没有基因组测序、信息量较少的物种的标记开发研究；
(3)该方法开发的标记为功能性标记，能够知道标记对应的序列作用的靶位点。不同材料的多态性差异可以显示该标记序列所调控的基因表达模式的差异。
具体实施例方式
以甘蓝型油菜为例，开发功能性的与miRNA有关的分子标记。(1)从 miRNA 数据库(http://www.mirbase. org/)中下载所有的 miRNA 序列，同时下载甘蓝型油菜公开的基因组部分序列(目前未测序完)(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)；以从miRNA下载的序列为种子序列(query序列)，然后与甘蓝型油菜公开的序列进行 BlastN (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)比对，符合以下参数条件的为 miDNA 候选序列
参数设置如下
条件一 query序列中有25条序列为甘蓝型油菜miRNA序列，在比对时则匹配序列容忍存在3个以内碱基的错配；query序列中的其它序列，在比对时匹配序列容忍存在5个以内碱基的错配；
条件二 query序列与匹配序列相似性达到90%以上； 条件三query序列与匹配序列E值在0. 1以下；
(2)将符合条件的miDNA候选序列2354条，向左右延伸大致相等的长度达到150bp左右，得到被称为可能的前体miDNA，简称为pre-miDNA ；
3 禾I」M RNA structure 5. 1 $a # (http //www. softpedia. com/get/Science-CAD/ RNAstructure. shtml)对可能的pre-miDNA序列进行二级结构的预测，并计算最低自由折叠能系数；若miDNA候选序列在可能的pre-miDNA序列茎环结构的茎上，同时miDNA中A + U含量在30% 70%之间、miDNA与其在另一臂上的互补链之间的错配不超过6个碱基、并且自由折叠能系数(MFEI)为-85 kcal/mol以上，则判断此序列为miDNA序列，得到711条序列(第一次与NCBI中Brassica数据库DNA比对处理后，最终得到132个；第二次与华农白菜数据比对处理后得到579个)；
(4)将miDNA序列所对应的前体序列pre-miDNA，进行all-by-allBlastN比对分析， 然后根据比对的E值(小于e_1(l为符合)将pre-miDNA分成不同的亚类，共分成15个亚类， 然后再将每个亚类利用本地化的 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi) 软件进行序列提取，将提取的序列进行ClustalW(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/ clustalw2/)比对，寻找出保守序列；
(5)禾丨J用 Primer Premier 6· 0 (http://primer-premier, downloadaces. com/)软件对保守序列进行单条引物的设计，引物的退火温度都为60°C左右，引物长度在18-25之间，最佳长度为为22个碱基，共设计了 35条引物，然后将设计的引物与在miRNA (http://www. mirbase. org/)数据库中下载的序列和被研究物种的基因组序列进行比对，确定设计的引物不能与pre-miDNA之外的序列匹配上，最终确定的引物为25条(引物序列在附表1中)。(6)将设计好的引物按退火温度相近的引物放在一组组合的原则进行随机相互组合，或者将设计的引物与ISSR引物进行组合(ISSR引物序列在附表2中)；
(7)将组合的引物对在被研究物种有代表性的材料中进行引物筛选(附图1)，挑选出带型清楚、多态性好和稳定性好的引物组合作为该物种的参考引物组合，有25个(引物序列在附表3中)。将上述方法得到的参考引物组合应用于白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中，表现出了比较好的扩增效果，将33对miDNA引物在甘蓝型油菜自然群体中进行了验证，其中编号为 miBN5的组合(miRNA7-miRNA28)与控制开花的性状有关，根据测序发现该片段与预期序列相符，其产生的miRNA能够控制与AT3G04910. 1同源的生物节律基因。附表1甘蓝型油菜中与MicroRNAs相关的优良引物，靶位点和靶位点功能
权利要求
1.一种与miRNA相关的功能性分子标记的开发方法，其特征在于，将miRNA数据库中已知的miRNA序列与被研究物种已公开的DNA序列进行BlastN比对，根据碱基错配的数目和相似程度确定miDNA候选序列，然后将其左右延伸一定距离达到150bp左右，再经过茎环二级结构预测和最小自由折叠能系数的计算确定前体miDNA位点；将筛选出的所有前体 miDNA序列进行分类比对，根据保守序列设计引物，然后将设计好的引物在数据库中进行电子比对，确定其是否为miDNA特有序列；最后根据各引物的退火温度大小相互组合，开发出一种效率高和多态性好的功能性标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体通过以下步骤实现(1)从miRNA数据库(http://www.mirbase.org/)中下载所有的miRNA序列，以下载的序列为种子序列即query序列，然后与被研究物种的已知序列进行blastN (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)比对，符合以下条件的为miDNA候选序列条件一若query序列为被研究物种序列，则匹配序列容忍存在3个以内碱基的错配； 若query序列为被研究物种之外的序列，则匹配序列容忍存在5个以内碱基的错配；条件二 query序列与匹配序列相似性达到90%以上；条件三query序列与匹配序列E值在0. 1以下；(2)将miDNA候选序列向左右延伸大致相等的长度达到150bp左右，得到被称为可能的前体miDNA，简称为pre-miDNA ；(3)禾I」MRNA structure 5. 1(http//www. softpedia. com/get/Science-CAD/ RNAstructure. shtml)对可能的pre-miDNA序列进行二级结构的预测，并计算最低自由折叠能系数若miDNA候选序列在可能的pre-miDNA序列茎环结构的茎上，同时miDNA中A + U含量在30% 70%之间、miDNA与其在另一臂上的互补链之间的错配不超过6个碱基、并且自由折叠能系数(MFEI)为-85 kcal/mol以上，则此序列为miDNA序列；(4)将miDNA序列所对应的前体序列pre-miDNA，进行all-by-allBlastN比对分析， 然后根据比对的E值将pre-miDNA分成不同的亚类，E值小于e,为符合，然后再将每个亚类利用本地化的 Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)软件进行序列提取，将提取的序列进行 ClustalW(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)比对， 寻找出保守序列；(5)禾丨J 用 Primer Premier 6. 0 (http://primer-premier, downloadaces. com/)软件对保守序列进行单条引物的设计，引物设计的原则为退火温度为55-60°C，引物长度在 18-25之间，最佳长度为22个碱基，然后将设计的引物与在miRNA (http://www. mirbase. org/)数据库中下载的序列和被研究物种的基因组序列进行比对，确定设计的引物不能与 pre-miDNA之外的序列匹配上；(6)将设计好的引物按退火温度相近的引物放在一组组合的原则进行随机相互组合， 或者将设计的引物与ISSR引物进行组合；(7)将组合的引物对在被研究物种有代表性的材料中进行引物筛选，挑选出带型清楚、多态性好和稳定性好的引物组合作为该物种的参考引物组合。
全文摘要
本发明公开了一种与MicroRNA(简称miRNA)相关的功能性标记的开发方法。该方法将miRNA数据库中已知的miRNA序列与被研究的物种已公开的DNA序列进行BlastN比对，根据碱基错配的数目和相似程度确定miRNA对应的DNA(简称miDNA)序列，然后将其左右延伸一定距离，使总长约150bp，再通过茎环二级结构的预测和最小自由折叠能系数的计算确定前体miDNA位点。将筛选出的所有前体miDNA序列进行分类比对，根据保守序列设计引物，将设计好的引物在数据库中进行电子比对，确定其为miDNA特有序列，最后根据各引物的退火温度大小相互组合，开发出一种效率高和多态性好的功能性标记。该标记系统结合了SSR和AFLP等传统标记的优点，具有较高的移植性、低成本性、多态性和稳定性等优良特点。
文档编号G06F19/16GK102222175SQ20111011675
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者付东辉, 周庆红, 李加纳, 沈亮余, 魏丽娟 申请人:西南大学