一种基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法
【专利摘要】一种基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，包括如下步骤：采用能量不同的序列三维点扩散函数进行图像复原仿真实验，获得不同能量的三维点扩散函数与图像复原效果和复原时间之间的关系，以此计算复原效率，绘制复原效率曲线，计算二阶导数，获得曲线拐点，依据曲线拐点的坐标确定能量阈值，进而确定起点三维点扩散函数，并按照一般观察浏览和分析测量的不同需要，作出三维点扩散函数能量大小以及与之相应空间大小的选取。该方法能够根据观察浏览和分析测量的不同需要，综合考虑复原效果和处理时间，选取相应的三维点扩散函数，对采集的序列显微切片图像进行复原处理。
【专利说明】一种基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方 法 一、【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，该方法 是数字共焦显微技术中三维生物显微图像复原处理的一个重要环节，属于数字图像复原处 理【技术领域】。该方法的应用，可按照一般观察浏览和分析测量的不同需要，结合复原效果和 处理时间的综合权衡考虑，作出三维点扩散函数不同能量大小以及与之相应空间大小的选 取。
【背景技术】
[0002] 数字共焦显微技术以普通生物光学显微镜为基础，配置图像探测器、精密移动控 制机构和电脑，采用数字图像处理技术，对采集的生物样本显微图像进行复原处理，消除焦 面以外的散焦的影响，以提高细胞图像的分辨率。
[0003] 数字共焦显微技术中的复原处理，采用的是三维显微图像去卷积复原方法。表征 显微镜光学系统的三维点扩散函数，直接决定着去卷积复原处理的效果。三维点扩散函数 越准确地反映显微镜光学系统的能量分布，复原效果越好。在此基础上，三维点扩散函数的 空间大小选取越大，包含能量越大，复原效果越好，同时处理时间越长。包含全部能量的三 维点扩散函数最大空间大小为样本体积的2倍，这是一个十分巨大的空间。三维点扩散函 数为对顶双漏斗结构，绝大部分能量集中在中部的双漏斗对顶处的微小区域。因此，在进行 图像复原处理时，合理的选取是以该处为原点选取微小区域的一定空间大小的三维点扩散 函数进行图像复原处理。研究表明，随着空间大小的逐渐增大，复原效果提升逐步趋缓，而 处理时间却迅速增加，复原效率下降。因此，如何根据观察浏览和分析测量的不同需要，综 合和权衡考虑复原效果和处理时间，选取不同的能量大小、进而选取与之相应不同空间大 小三维点扩散函数进行复原处理，是数字共焦技术中三维显微图像去卷积复原处理需要解 决的重要问题。 三、
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方 法，该方法能够根据观察浏览和分析测量的不同需要，综合考虑复原效果和处理时间，选取 相应能量大小以及与之相应空间大小的三维点扩散函数，对采集的序列显微切片图像进行 复原处理。
[0005] 本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种基于能量分布的显微成像系统三维 点扩散函数选取方法，包括如下步骤：
[0006] (1)按照显微镜物镜放大倍数、数值孔径参数、光源波长、相机靶面大小和分辨率 参数，并设定一个光学切片层距，制作一个用于表示成像过程进行卷积运算的表征显微镜 光学系统的三维点扩散函数h n，并制作不同空间大小的用于图像复原的序列三维点扩散函 数1^，分别命名为h3、h 5、h7、…、hn_2;
[0007] (2)按式⑴计算步骤⑴中得到的各个不同空间大小三维点扩散函数匕和比的 能量值E，并进行归一化；
[0008] (3)用一幅清晰高信噪比细胞图像作为初始二维样本，制作相互关联的序列二维 图像，并用这些序列二维图像构建一个清晰仿真样本三维图像f ;
[0009] (4)用hn与f卷积得到模糊仿真三维成像图像g ;
[0010] (5)用步骤⑴中不同能量大小的三维点扩散函数比分别对三维图像g进行去卷 积复原处理，复原算法采用最大似然法，同时记录复原效果和处理时间；
[0011] (6)去卷积复原处理的复原效果的评价，采用式（2)的改善信噪比ISNR，处理时间 单位采用秒，计算不同能量三维点扩散函数h对三维成像图像g进行复原处理的复原效率 q ；
[0012] (7)对各三维点扩散函数的能量E及相应的复原效率q进行数据拟合，得到q-E关 系曲线；
[0013] (8)求q对E的二阶导数d2q/dE2,找出二阶导数为零的曲线拐点 Y，将直角坐标 横轴上与拐点对应的能量设定为阈值能量Εγ，以此确定"起点三维点扩散函数"；
[0014] (9)三维点扩散函数的选取，如果复原图像用于一般观察浏览，选取"起点三维点 扩散函数"或稍大的空间大小的三维点扩散函数进行图像复原。如果复原图像用于研究、分 析测量，选取更大空间的三维点扩散函数。对复原图像的效果要求越高，选取越大空间大小 的三维点扩散函数。
[0015] 所述的用于表示成像过程进行卷积运算的表征显微镜光学系统的三维点扩散函 数hn，是一个空间大小为ηΧηΧη的η阶三维矩阵，η为两位数的奇数。
[0016] 所述制作不同空间大小的用于图像复原的序列三维点扩散函数hi，是以 hn的空间中心点为原点，向四周由小到大分别按3X3X3、5X5X5、7X7X7、…、 (n-2) X (n-2) X (n-2)截取的三维矩阵。
[0017] 所述的用于图像复原的序列三维点扩散函数hi，它们的归一化能量值是以hn的能 量值为基准进行归一化处理得到。
[0018] 所述的复原效率q，由本发明提出的定义q = ISNR/t计算得到，其中t为以最小空 间大小三维点扩散函数h3的处理时间为基数进行归一化的归一化复原处理时间。
[0019] 所述的"起点三维点扩散函数"，是指能量值E大于阈值能量Ε γ的最小空间的三 维点扩散函数。
[0020] 本发明的突出效果在于：
[0021] 三维点扩散函数的能量大小的不同选取以及相应空间大小的不同选取，直接决定 着数字共焦显微技术中三维显微图像去卷积复原效果和处理时间。如何选取，一直是数字 共焦显微技术待解决的问题。本发明基于三维点扩散函数能量分布的研究，提出了通过图 像复原仿真实验和复原效率及其曲线拐点的计算，确定能量阈值，进而确定起点三维点扩 散函数，根据观察浏览和分析测量的不同需要，选取不同能量大小和与之相应的不同空间 大小三维点扩散函数的方法。该方法的提出，为数字共焦显微技术的三维显微图像去卷积 复原处理提供了一种有效的三维点扩散函数选取方法。 四、【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1仿真图像。
[0023] 图2q_E拟合曲线。
[0024] 图3仿真图复原结果。
[0025] 图4实际细胞图复原结果。 五、【具体实施方式】
[0026] 以下通过实例对本发明的技术方案作进一步详细描述。
[0027] 本发明所述的基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，包括以下 步骤：
[0028] 1.三维点扩散函数制作
[0029] 设置参数：显微镜机械镜筒长度为160mm ;光源波长为550nm ;C⑶参数：1/3英寸， 像素值640X480。
[0030] 显微镜光学系统放大倍数Μ和数字孔径NA取以下设置：
[0031] 放大倍数Μ = 40倍；数值孔径ΝΑ = 0· 6 ;
[0032] 三维点扩散函数层距L取0. 3125 μ m，制作空间大小为21X21X21的3D-PSF，其 径向大小为21X21，轴向大小为21，以h21表示。
[0033] 以h21的空间中心点（11，11，11)为中心，分别向四周依次截取空间大小为 3X3X3、5X5X5、7X7X7、...、19X19X19 等 9 个、以及本身 21X21X21 共 10 个三维点 扩散函数，命名Sh3、h5、h7、"*、h 19。
[0034] 2.三维点扩散函数能量计算
[0035] 根据式（1)分别计算步骤1得到的10个三维点扩散函数的能量值E。各三维点扩 散函数的能量值均以h 21能量值为基准进行归一化处理。
[0036] 3.三维样本仿真图像f制作
[0037] 以图1(a)中二维原始清晰图像作为初始样本，大小为151X151，通过微量旋转叠 加制作含21幅二维图像的三维仿真样本图像f，大小为151X151X21。
[0038] 4.模糊仿真三维成像图像g4Q生成
[0039] 用h21与图像f进行卷积运算，生成得到三维模糊图像g4(l，图1 (b)所示为g4(l取中 心层的二维图像。
[0040] 5.三维仿真图像复原
[0041] 分别用步骤1得到的10个三维点扩散函数对模糊仿真图像g?进行去卷积复原处 理，复原方法采用最大似然法，迭代次数为600次。同时记录处理时间，处理时间单位为秒。
[0042] 6.复原实验的计算
[0043] 根据式（2)分别计算10个三维点扩散函数对图像复原实验得到的改善信噪比 ISNR。并以最小的空间大小三维点扩散函数1!3的处理时间为基准进行时间归一化，计算各 三维点扩散函数对三维图像g进行复原处理的复原效率q :q = ISNR/t，t为归一化复原处 理时间。
[0044] 10个三维点扩散函数的空间大小size、能量值E、复原效果ISNR以及复原效率q 等复原实验计算结果列于表1。其中空间大小size用像素数表示。表1中，3D-PSF为三维 点扩散函数的英文缩写。
[0045] 表1三组三维点扩散函数复原实验和计算结果
[0046]
【权利要求】
1. 一种基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 按照显微镜物镜放大倍数、数值孔径参数、光源波长、相机靶面大小和分辨率参数， 并设定一个光学切片层距，制作一个用于表示成像过程卷积运算的表征显微镜光学系统的 三维点扩散函数匕，并制作不同空间大小的用于图像复原的序列三维点扩散函数hi，分别 叩名为 h3、h5、h7、…、hn_2 ; (2) 按式（1)计算步骤（1)中得到的各个不同空间大小三维点扩散函数匕和h的能 量值E，并进行归一化，
(1) 式中，r表示三维点扩散函数元素的空间坐标（x，y，z)，f(r)为三维点扩散函数在坐标 r (X，y, z)上的灰度值； (3) 用一幅清晰高信噪比细胞图像作为初始二维样本，制作相互关联的序列二维图像， 并用这些序列二维图像构建一个清晰仿真样本三维图像f ; (4) 用hn与f卷积得到模糊仿真三维成像图像g ; (5) 用步骤（1)中不同空间大小即相应不同能量大小的三维点扩散函数分别对三维图 像g进行去卷积复原处理，复原算法采用最大似然法，同时记录复原效果和处理时间； (6) 去卷积复原处理的复原效果的评价，采用式（2)的改善信噪比ISNR:
(2) 式中，/为三维复原结果图像，处理时间单位采用秒，计算不同空间大小三维点扩散函 数比对三维成像图像g进行复原处理的复原效率q ; (7) 对各三维点扩散函数的能量E及相应的复原效率q进行数据拟合，得到q-E关系曲 线. (8) 求q对E的二阶导数d2q/dE2,找出二阶导数为零的曲线拐点Y，将直角坐标横轴 上与拐点对应的能量设定为阈值能量E Y，以此确定"起点三维点扩散函数"； (9) 三维点扩散函数的选取，如果复原图像用于一般观察浏览，选取"起点三维点扩散 函数"或稍大的空间大小的三维点扩散函数进行图像复原，如果复原图像用于研究、分析测 量，选取更大空间的三维点扩散函数，对复原图像的效果要求越高，选取越大空间大小的三 维点扩散函数。
2. 根据权利要求1所述的基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，其 特征在于，步骤（1)所述的用于表示成像过程进行卷积运算的表征显微镜光学系统的三维 点扩散函数h n，是一个空间大小为ηΧηΧη的η阶三维矩阵，η为两位数的奇数。
3. 根据权利要求1所述的基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法， 其特征在于，步骤（1)所述制作不同空间大小的用于图像复原的序列三维点扩散函数4， 是以h n的空间中心点为原点，向四周由小到大分别按3X3X3、5X5X5、7X7X7、···、 (n-2) X (n-2) X (n-2)截取的三维矩阵。
4. 根据权利要求1所述的基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，其 特征在于，步骤（1)所述的用于图像复原的序列三维点扩散函数匕，它们的归一化能量值是 以hn的能量值为基准进行归一化处理得到。
5. 根据权利要求1所述的基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，其 特征在于，步骤（6)所述的复原效率q，由q = ISNR/t计算得到，其中t为以最小空间大小 三维点扩散函数h3的处理时间为基数进行归一化的归一化复原处理时间。
6. 根据权利要求1所述的基于能量分布的显微成像系统三维点扩散函数选取方法，其 特征在于，步骤（8)所述的"起点三维点扩散函数"，是指能量值E大于阈值能量Ε γ的最小 空间的三维点扩散函数。
【文档编号】G06T5/00GK104123704SQ201410348095
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月21日 优先权日:2014年7月21日
【发明者】陈华, 蔡熠, 杨凤娟, 梁日柳, 何双燕 申请人:广西大学