跨越很多位置的区域进 行成像，然后改变epi滤波器并且访问区域中的每个位置，以这种方式继续直至用所有的 印i滤波器对整个样本进行了成像为止。Epi滤波器改变较少的次数，因此可以快得多地进 行扫描。然而，因为机械载玻片处置系统的可重复性不好，所以实际的位置通常在相同样本 点的相继扫描之间以一定程度进行移位。因此，对于所有的光谱带，在最终的图像中的指定 的像素通常不恰好对应于相同的样本点（其中每个对应于不同的epi滤波器）。这降低了 图像质量并且限制了可以进行的图像分析的种类。前述限制的结果是全视野载玻片成像系 统一般执行很慢和/或产生在不同的光谱带中的信号之间具有误配准的图像。
[0037] 本公开提供用于对生物学样本（包括但不限于组织切片、从血液得到的样本以及 细胞学样本）进行快速全视野载玻片成像的系统和方法。所述方法和系统产生全视野载波 片多光谱图像，其中样本中的每个点通过包含五个以上的波长带的信号光谱来描述，并且 在对应于不同带的图像之间没有空间位移。另外，在一些实施例中，获得样本的全视野载玻 片多光谱荧光图像，其中样本自体荧光效果显著降低或消除。
[0038] 在本文中公开的系统和方法提供用于快速全视野载玻片成像，其中对多个荧光种 类进行光谱去混合以降低或消除光谱重叠的荧光种类之间的串扰。在存在自体荧光的情况 下，其对图像和定量测量的影响可以减小或消除。通过使用光谱去混合技术，在本文中公开 的系统和方法提供用于全视野载玻片图像获取和分析，以基于多光谱样本图像来提高信号 级别的定量和/或改进的分类。基于多光谱图像的光谱去混合、图像分析和分类的方法和 系统例如在美国专利第7, 321，791号和第7, 953, 264中公开，通过引用将其全部内容并入 本文。
[0039] 为了提高扫描速度和对应于不同波长带的图像之间的图像配准，在本文中公开的 方法和系统被配置为使用M个信号带（例如，以M个不同的光谱带）来进行样本的扫描，然 后使用N个信号带再次对其进行扫描，其中第一组M个信号带和第二组N个信号带具有共 享的光谱带。共享光谱带不需要其光谱属性方面是一致的，但是应当是足够相似的，使得该 带中的信号充分地响应样本中的相同的染色剂或结构。
[0040] 每次扫描使用本领域中已知的高速技术来进行，诸如使用三带印i滤波器立方体 和彩色数字相机获取第一次扫描中的对应于M = 3个带的一组图像以及第二次扫描中的对 应于N = 3个带的一组图像。替代地，可以使用M带或N带epi滤波器立方体以及对不同 的光谱带循环的敏捷激发源来扫描样本，同时用单色数字相机获取图像。虽然在上面的示 例中M和N两者的值均为3,但是更一般地，M和N中的任一个或两者也可以超过3。例如， 在一些实施例中，M和/或N可以是4以上。在一些实施例中，用于组合以形成多光谱图像 栈的图像数量可以是3或以上（例如，4或以上、5或以上、6或以上、7或以上、8或以上、9 或以上、10或以上）。
[0041 ] 在一些实施例中，当对某些荧光样本进行成像时，两组扫描可以包括与来自细胞 核染色剂DAPI的放射相对应的图像。因此，例如，第一组图像可以包括与来自DAPI的放 射（在第一波长带中）相对应的图像，并且还包括例如与来自两个或三个其他波长带中的 样本放射相对应的两个或三个其他图像。类似地，第二组图像可以包括与来自DAPI的放射 (在第一波长带中）相对应的图像，并且还包括例如与来自两个或三个其他波长带中的样 本放射相对应的两个或三个其他图像。在一些实施例中，将第一组图像中的两个或三个其 他波长带与第二组图像中的两个或三个其他波长带完全区分开是有利的。
[0042] 虽然在第一扫描期间获取的M个带在它们之间配准并且在第二扫描期间获取的N 个带在它们之间配准，但是第一扫描的图像和第二扫描的图像一般由于扫描仪的有限的机 械可重复性而位移。
[0043] 为了校正该问题，可以使用对应于在第一和第二扫描之间共享的波长带的图像 (例如，上面示例中的与来自DAPI的放射相对应的图像）将来自两个扫描的图像对齐到公 共配准。在该共享带中生成最佳对齐的相同移位或图像变换应用于扫描中的所有图像，之 后，可以将两个扫描组合成图像立方体。通过将第二扫描与第一扫描对齐或者反过来、然 后组合所有图像，获得组合多光谱图像，其表征N+N个图像，其中每一个对应于不同的光谱 带，并且全部是完美配准的。然后，组合多光谱图像适用于光谱去混合。
[0044] 选取哪个带用作共享带取决于样本以及其是如何制备的。在很多感兴趣的生物学 样本中，应用诸如DAPI或Hoechst这样的细胞核复染剂，捕捉该放射的带可以是好的选择。 这是因为在很多情况下，感兴趣的图像将包含一些细胞核，因此在该带中将有足够的信息 来执行良好的图像配准。更一般地，选择共享带使得至少一些相同的结构存在于两个扫描 的共享带图像中，并且通常被选取为使得一些感兴趣的结构存在于包含样本材料的大部分 区域中，因此获得跨越全样本的良好的图像配准。
[0045] 因为共享带对应于样本中的基本相同的染色剂或结构，所以在一些实施例中，组 合多光谱图像可以包括来自于仅一次扫描（例如，针对全部M+N-1个图像）的共享带。这 可以在承认两个共享带图像包含类似信息的情况下进行，由此减小与多光谱图像立方体相 关联的存储器大小或盘大小。然而，在一些实施例中，来自两次扫描的共享带图像包括在组 合多光谱图像中。在一些实施例中，两个共享带图像可以被平均，并且只将一个经平均的图 像包括在组合多光谱图像中。保留两个共享带图像、仅一个这样的图像或者将共享带图像 合并成单一图像的选择可以基于从保留两个共享带图像所期待的附加信息的程度、对盘或 存储器空间使用的关注或者被判断为在指定情形下很重要的任何因素来做出。当保留两个 共享带图像时，结果是具有M+N个图像的多光谱图像立方体，并且当只保留一个共享带图 像时，得到的多光谱图像立方体具有M+N-1个图像。
[0046] 相比于对样本中的每个位置处的多个定位（setting)循环印i滤波器的全视野 载玻片扫描系统，在本文中公开的方法和系统提供机械运动和总的获取时间方面的大量减 少。例如，使用传统的全视野载玻片扫描系统，典型的样本可能需要1000个单个域来成像， 这意味着获取7带多光谱图像涉及改变印i滤波器立方体7000次。即使使用可以在0. 5 秒内改变滤波器的高速机构，针对每个载玻片，除了用于曝光、相机读出、聚焦等所需的时 间之外，仅是用于滤波器循环，这也需要接近1个小时。
[0047] 为了获得相同类型的多光谱信息，在本文中公开的系统和方法只改变epi滤波器 一次，这通常花费大约1秒。因此，实现了在扫描速度上的显著提高。另外，因为涉及少得 多的机械操作（例如，改变epi滤波器），所以提高了成像系统的寿命和可靠性。
[0048] 替代地，扫描样本的区域、然后改变印i滤波器的全视野载玻片扫描系统将具有 对应于不同光谱带的图像之间的位移，因为机械扫描仪一般不能够在每次获得新的图像时 将样本返回到完全相同的位置。因此，对应于不同光谱带的图像将一般不会完美地排齐。因 为访问全视野载玻片扫描仪来产生具有〇. 5微米或更小的像素大小的图像，因此在与此相 当或更大的标度上的不可重复性将使不同光谱带中的图像从另一个图像歪斜。实际上，观 察到传统的扫描仪具有达1微米或更多的歪斜，因此指定像素的不同带中的信号级别可能 实际上对应于样本中的不同位置（离开达2个像素或者更多）。一组这样的光谱图像（例 如，每个都对应于单一光谱带的图像）无法精确地去混合，因此基于成分强度的图像分析 将生成不精确的结果。类似地，尝试去除由荧光影像中的自体荧光造成的贡献将不会与在 不同带中的信号对应于样本中的相同位置的情况下同样可靠地达成目标。
[0049] 在一些实施例中，对应于共享光谱带的图像（例如，"共享带图像"）还用于选择扫 描中的聚焦设置（例如，在样本中的每个成像位置处的样本之上的物镜的高度的设置）。即 使在诸如3-4微米的组织切片这样的较薄的样本中，根据焦点被设置到样本的顶部、底部 或者之间的某个点来对不同的结构成像。这可能妨碍配准处理，或者产生降级的配准，因为 可能无法完美地配准图像。使用共享带图像来选择焦点定位的好处不仅在于提高被保留的 横向配准的容易性或质量。例如，当被合并的两组图像（例如，对应于第一和第二扫描）对 应于样本内的相同深度时一般是有益的。如果它们不是这样，则对应于不同光谱带的图像 中的信号级别不对应于相同位置。因为信号不对应于图像中的相同位置，所以不可能精确 地将它们去混合为成分图像。通过使用第一和第二扫描两者的共享带图像和相同的自动对 焦机构和规则，样本内的焦点移位的程度被降低，并且图像配准被增强。如上所述，共享带 的光学属性不需要对两次扫描是相同的。即，共享带不需要在两次扫描中恰好对应于波长 的相同集合、以完全相同的方式加权。替代地，在每次扫描中，共享带对应于观看到基本相 同的荧光种类的波长带，使得足够相似的结构存在于足够相似的均衡亮度中，从而可以获 得良好的配准。
[0050] 在一些实施例中，用于第一扫描的焦点定位可以重新用于第二扫描。这消除了对 重新确定焦点定位的需要，并且在扫描装置的可再现性的限制内，确保将使用完全相同的 定位。
[0051] 在本文中公开的系统中可以使用各种不同的组件。在一些实施例中，例如，用于 获得样本图像的检测器可以是具有单个色彩通道的彩色相机。这样的相机的一个示例 是 Hamamatsu C7780-10 0rca_3CCD 彩色相机（可从 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City，Japan得到），其单个色彩通道具有在图3中被示为301、302和303的光谱响应。该相 机被用于对样本进行成像，该样本是通过利用Texas Red针对雌激素受体（ER)的第一免疫 荧光（IF)标签、利用Alexa Fluor 488针对Ki-67的第二IF标签和4'，6' -二脒基-2-苯 基（DAPI)的复染剂制备的乳腺癌活组织检查取得的组织的福尔马林固定的、石腊包埋的 块中的4微米组织切片。对样本的第一扫描使用在图1中示出的光谱表示的epi滤波器组 来取得（其中，激发滤波器响应101包括主要光谱带l〇4a、104b和104c，放射滤波器响应 102包括主要光谱带105a、105b和105c，并且分色反射器传送由曲线103指示），并且对样 本的第二扫描使用在图2中示出的光谱表示的epi滤波器组来取得（其中，激发滤波器响 应111包括主要光谱带114a、114b和114c，放射滤波器响应112包括主要光谱带115a、115b 和115c，并且分色反射器传送由曲线113指不）。对于第一扫描和第二扫描两者，相机的蓝 色通道被用于确定焦点位置。另外，相机的伽马被设置为1，并且白点校正被禁用或被设置 为手动。
[0052] 在一些实施例中，来自相机内的传感器的原始信号被记录并且直接用于形成光谱 图像和用于图像分析。在很多RGB相机中，对来自单个传感器或像素的原始信号级别进行 处理以产生相机提供的RGB图像。典型地，相机的处理涉及将来自传感器的红色、绿色和蓝 色