自动化“指纹”鉴定法和鉴定产品真实性及监视的化学物的制作方法

专利名称：自动化“指纹”鉴定法和鉴定产品真实性及监视的化学物的制作方法
技术领域：
本发明的相关技术本发明涉及监视样品组成和真实性的方法、试剂和设备。
有众多的理由说明对产品和非常相似的混合物之间进行鉴定和监视是非常有用的。首先，为了保持品牌产品的一致性，需要检测那些仿冒品(例如，由竞争对手仿冒的或由被许可人及连锁店生产的不真实物品)。
产品本身的特性可以用来确定其生产的比号。类似的方法可以用于质量管理检测。此外，仿冒的产品会造成严重的健康和安全问题。在1995年，有报道说，仿冒名牌的婴儿食品在美国大陆的15个州内被销售。仿冒的葡萄酒、烈酒、香水、婴儿食品、软饮料、化妆品、以及药品造成的美国经济损失为每年2000亿美圆(“The Boston Phoenix”,Section One,December 2,1994)。
因此，重要的是找到迅速、经济和可以执行的方法来鉴定仿冒的和伪劣产品。另外，使用自动化方法鉴定生产是否遵循了规范可以节省花费在签定次品上面的时间也是非常重要的。理想的是减少那些资深的研究人员和熟练的技术员对在线、非在线、非在货价上的产品的真实性和是否符合检验条件而进行的试验和记录的时间。
曾经有人利用蛋白质电泳对产品(例如，婴儿食品)的真实性进行过鉴定，这种方法需要花费比较长的时间(而且费用高)。在另外的行业中，例如，在造酒业，曾经使用过富利艾变换的红外分析、气相色谱、pH、喇曼光谱和其它的分析方法来对产品的真实性进行过鉴定(Constant et al.,Differentiation of AlcoholicBeverages FT-IR Spectra.An Original Multivariate Approach,ACS Abstract Presented at 208thACS National Meeting,August 25,1994,published in the Issue of Chemical and Engineering News,101994)。
Biocode有限公司曾经使用荧光标记的抗体来鉴定产品成分。
美国专利第5,429,952号揭示了向产品中加入发光化学物，作为产品的外源标记并一般不作为产品成分的分析方法。
使用常规的分析方法对每次或每批产品、竞争对手的产品等的真实性和是否满足生产要求等进行监视经常是昂贵的。
本发明概述我们发现了一种自动化地对产品建立“指纹”型分析数据储存的数据库的方法(甚至可以针对产品的批次和批号)。这种自动化的分析方法是一种对产品进行评价和区分的方法，甚至在很窄的领域或行业内，来竞争或如确定产品的产地或真实性。本发明涉及确定产品中被分析物如关键成分和/或关键成分的含量的方法。该方法使用发光现象对产品的真实性、仿冒、和对产品的监视以及产品质量控制等进行鉴定。本发明还涉及发光化合物(例如，包括一个或一个以上的发光化合物)，这些发光化合物可以被用来鉴定产品中的被分析物以及其相对数量。
在一个方面，本发明提供了鉴定样品对已知的真实性标准或真实产品中至少一个选择的特征比较它们的相关性的方法。该方法包括(a)提供样品的混合物和至少一种发光化合物(“LEC”)；(b)用激发波长的光对该样品混合物进行激发；(c)对至少一种波长的发出的光进行监视(激发后发出的光)来建立样品的发光强度；以及(d)提供标准混合物的标准指纹特征；并且(e)将样品的发光强度与标准指纹特征相比较来确定该产品是否为真实的。标准混合物包括标准物和发光化合物。标准的指纹是通过对数个标准混合物用激发波长的光激发后监视其发出的光波长来确定的。
在优选实施方案中，使用两种，优选三种或更多种发光化合物，将数个发光化合物的指纹与样品的相应的发光强度相比较。最优选的是发光化合物发出的光在波长上是不重叠的，这样，就可以将多种化合物同时加入到样品和/或标准物中。
在优选的实施方案中，该方法还进一步包括提供背景对照混合物，该混合物中包括发光化合物，但是没有样品或标准物；用激发波长的光激发该混合物，监视其反应的光波长，建立背景发光数值；在背景对照混合物与样品混合物发光的至少一个差异的基础上确定样品的发光强度。优选的是，标准物是真实物质的预先确定数量的组合物。样品的指纹是在比较背景发光值和样品混合物发光值时发光的第一改变的基础上确定的。标准物的指纹是在比较背景发光和标准发光的每一次测量所确定的第二发光变化的基础上确定的。比较步骤包括将发光的第一变化与被调节的背景指纹的比较，例如，对样品组分的相对量的定量。
在另一个方面，本发明提供了鉴定产品真实性的方法。得到受试产品的液体样品后，将发光化合物加入其中，形成测试样品。发光化合物与产品的被分析物相互作用。激发测试样品，确定测试样品在一定波长的发光强度。将测试样品在该波长的发光强度与由发光化合物和真实产品液体标准物组成的混合物被激发时同一波长下发光强度相比较，发光强度的相似性和不相似性对确定样品的真实性和非真实性是有决定作用的。在一个重要的实施方案中，测试样品发出的光强度与多个混合物的发光强度相比较，其中，真实性要求测试样品的发光强度处于从数个所述的混合物的发光强度计算出来的预先确定的强度范围之内。所说的多个混合物是至少4个标准物，含有发光化合物和产品的真实液体标准物的混合物，优选这4个混合物。
在上述的一些实施方案中，产品的化学组成是未知的。在另一些实施方案中，与发光化合物结合的被分析物的化学结构是未知的。在又一些实施方案中，被分析物不是外源性产品标记物。在一个特别重要的实施方案中，产品是液体的消费品。
如上所述，可以使用多个发光化合物。在这样的实施方案中，优选每个发光化合物与产品中不同的被分析物相结合。最优选的是，发光化合物是荧光染料。
在另外的优选的实施方案中，发光化合物被自动化移液器加入到样品中。优选的是，这些样品混合物通过自动化移液器释放到多井盘中。
在另外的优选的实施方案中，标准物、样品、或它们两者本身带有荧光、磷光、或冷光化合物。在某些产品中，该化合物是咖啡因。
在又一些优选的实施方案中，发光化合物是荧光物、磷光物、或冷光物，由于产品被分析物的数量和质量不同，发出的光也不同。优选的是，发光化合物与产品的组分、标准物、或它们两者发生相互作用，得到至少一种荧光、磷光、或冷光组分。
在另一些优选的实施方案中，标准物是含有预先确定的相对数量的对真实物质为特征性的被分析物，而且比较步骤包括对样品中被分析物的相对数量进行定量。
在优选的实施方案中，该方法包括进行上述的步骤(b)-(c)至少两次，优选三次。进行步骤(b)-(c)时，使用相同的或不同的发光化合物，进行相同或不同的激发，在每一个步骤中，监视发出的波长。
在一个重要的实施方案中，标准物是含有咖啡因的饮料，发光化合物是a)5-(2-碳肼甲基硫代乙酰)氨基荧光素；b)5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素；c)氟代-3戊铵盐(Minta et al.,J.Biol.Chem.264:8171,1989 and U.S.Patent No.5,049,673)；d)4-氨基荧光素；e)5-氨基荧光素；f)蓝香豆素硫化物；g)香豆素二酸穴状配体(CD222)(Costlei et al.,J.of Chem.Society Perkins translation 2,p.1615)；或h)曙红Y。
在另一个重要的实施方案中，标准物是婴儿食品，发光化合物选自5-(2-碳肼甲基硫代乙酰)氨基荧光素、5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素、氟代-3戊铵盐、香豆素苯并噻唑四钾盐(BTC5N)(Cell Calcium,p.190,1994)。在另外的优选的实施方案中，标准物含有玉米糖浆，发光化合物选自5-(2-碳肼甲基硫代乙酰)氨基荧光素、5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素、氟代-3戊铵盐、4-氨基荧光素、5-氨基荧光素、蓝香豆素硫化物、香豆素二酸穴状配体(CD222)、曙红Y。在另外的优选的实施方案中，标准物是含乙醇的饮料，发光化合物选自5-(2-碳肼甲基硫代乙酰)氨基荧光素、5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素、氟代-3戊铵盐、硫酸原黄素半硫酸盐、四(四甲铵)盐、吖啶橙盐酸化物水合物、BTC-5N、吖啶黄素、4-氨基荧光素、5-氨基荧光素。化合物11是蓝香豆素硫化物，化合物12是香豆素二酸穴状配体(CD222)，化合物13是曙红Y。在另外一些优选的实施方案中，标准物是水性混合物，发光化合物是与重金属反应或相互作用的化合物，选自氟代-3戊铵盐、BTC-5N。
另一方面，本发明提供了确定第一样品与第二样品的相对性的方法，这两种样品都不是已知的标准物。该方法包括(a)提供第一样品混合物，包括第一样品和至少一种发光化合物；(b)用激发波长的光对多份第一样品混合物进行激发；(c)监视对激发起反应的至少一种波长的光，建立具有第一样品混合物特征的第一样品的指纹；(d)提供第二样品混合物特征的第二样品指纹，第二样品混合物包括第二样品和发光化合物；第二样品的指纹的产生是，用激发波长的光对多份第二样品混合物进行激发，监视反应的发出光波长；以及(e)将第一样品的指纹与第二样品的指纹进行比较，确定两种样品的相关性。
在优选的实施方案中，将第一样品的发光情况与产品组成或生产批号是已知的样品的指纹库比较，从而确定该样品是否属于某产品的同一批或为特定的产品。
在另外的优选实施方案中，该方法进一步包括提供一个或一个以上额外的指纹来产生对至少两个额外发光化合物中的每一个化合物的指纹情况，比较第一样品混合物的指纹与第二样品或标准物的指纹的情况。
在优选的实施方案中，该方法用于确定产品的真实性，产品的防伪性或产品生产的标准。在另外的优选的实施方案中，样品是香水、香料、调味品、食品、饮料。
本发明的另一个方面提供了为确定产品真实性而对染料的选择方法。后选的染料被加入到多份真实标准产品的液体样品的后选稀释液中，如果该后选染料与液体样品的被分析物相互作用，则在激发时，该后选染料在某一波长是发光的。然后，选择测试稀释液，当所述的后选染料加入到所述的液体样品的测试稀释物中时，后选的染料以选定的强度发光。对由所述的后选染料和所述的处于所述的稀释度的样品组成的混合物的多份样品在不连续波长的发光强度范围进行确定。对所述的后选染料和在测试稀释度的非真实产品的液体样品的混合物，确定其在不连续波长的试验性发光强度。最后，将在不连续波长的试验性发光强度与在不连续波长的发光强度相比较，如果该试验性发光强度落在所述的不连续波长的所述的发光范围之外，则该后选染料就可以被选择来确定所述的产品的真实性。在一个实施方案中，后选的染料是多种后选染料，每种染料在不同的波长发光，其中的被分析物是多种被分析物，每种染料结合不同的被分析物。在一个重要的实施方案中，产品的化学组成是未知的和/或被分析物的化学结构是未知的。在另外的重要的实施方案中，产品是液体消费品。
本发明的另一方面，提供了由计算机辅助的鉴定液体产品真实性的方法。该方法包括将一种成分加入到液体产品测试样品中，测定其发光并接收所产生的发光数据。该方法还包括对由真实液体产品和该成分组成的混合物的样品的发光进行测定并接收产生的发光数据。因此，就要比较测试样品的发光强度与多种混合物的样品的发光强度，真实性就要求测试样品的发光强度处于预先选择的置信限之内，该置信限定义的是在不连续波长的发光强度的范围，是由多种混合物在不连续波长的发光强度计算出来的。
在一个重要的实施方案中，使用了计算机数据库来储存真实产品的发光数据和提供这些数据。该数据库包括计算机可读的介质并存储有计算机可读的逻辑，其中，计算机可读的逻辑包括众多的真实产品的记录，表明真实产品与所述组分的混合物的众多样品的发光强度测定值。该数据库中还包括各种成分的指示，其中的记录可以通过成分和/或真实产品的指示来查找，其中接收真实产品的发光数据的步骤包括利用成分和/或产品的指示从计算机可读介质中提取有关的记录。
本发明的另一个方面提供了用于储存和提供有关真实产品的发光信息的计算机数据库。该数据库包括存储了计算机可读逻辑的计算机可读介质，其中的计算机可读的逻辑包括众多的真实产品的记录，表明真实产品与所述组分的混合物的众多样品的发光强度的记录，以及成分的指示。还包括使用成分和/或真实产品的指示从计算机可读介质中提取记录。
本发明的另一个特点是，当根据本文描述的方法将发光化合物加入到样品中时，样品可以与标准物分开。这就不同于使用产品标记物的情况，在那些产品中，标记物被加入到真实产品中，形成标记的混合物，其中，标记物加入到样品中是无法与把标记物加入到标准物中分开的。
发光化合物参与用不同波长激发所产生的发光中。有意义的发光可以是磷光、化学冷光的结果，更为优选的是荧光或偏振荧光。具体地讲，术语“发光化合物”在本文中指的是具有如下性质的化合物1)它们是荧光、磷光、或冷光；2)与样品或标准物或它们两者的成分相互作用得到至少一种荧光、磷光、或冷光化合物；或3)与样品或标准物或它们两者的荧光、磷光、或冷光化合物中的至少一种相互作用并改变在发光波长的发光。
术语“指纹”指的是从发光化合物与产品的液体样品结合后测定三次，或三种这样的结合测定一次，或两种都进行的一套发光强度数据。相应地，每种产品都可以具有独特的指纹。术语“指纹特征表”指的是产品结合一系列不同发光化合物的液体样品的指纹的集合。
术语“被分析物”在本文中指的是产品的关键成分或痕迹化合物。本地被分析物是一般都发现在未掺杂的产品中的物质，不是作为异源产品标记物加入的。本发明依赖的是发光化合物与这些被分析物之间的相互作用，从而可以检测到被改变的产品，包括(1)对被分析物的稀释，(2)用另外的成分替代被分析物，(3)加入了改变发光化合物与被分析物的相互作用的化合物，以及(4)加入了抑制发光化合物与被分析物相互作用产生的发光。更为经常地被检测到的改变是与发光化合物结合的被分析物的数量的改变，当样品被激发时，在其发光强度上有反应。
术语“相互作用”在本文中指的是造成染料在样品受到激发时改变其发光特性的那些反应、嵌入、结合，或其它的可以达到同样效果的作用。
术语“关键成分”在本文中指的是在产品组合物中的对鉴定该产品为重要的那些成分。
术语“痕迹化合物”在本文中指的是在产品中以很低浓度(例如，在ppm级或ppb级)存在的化合物。痕迹化合物可以与某一关键成分相关。痕迹化合物可以在关键成分的源中加入，或者在制造产品的时候加入。
本发明还包括下述的一个或一个以上的优点。本发明的方法可以用于蒸馏制酒工业，其中可以对痕迹化合物和关键成分用特定的发光化合物来测定。进而，指明乙醇的发光化合物可以用于确定产品的真实性。例如，用黄马齿玉米制造的酒含有的痕迹化合物与从蔗糖制造的酒不同。
虽然可乐等软饮料含有类似水平的关键成分，但是，关键成分的水平可以用来鉴定某一产品是否被从浓缩物稀释到适当的水平。例如，在分析软饮料时，可以用咖啡因作为发光化合物的靶标。软饮料中的其它的靶标可以但不限于高果糖糖浆和pH。
进而，香水、香料、调味剂、食品、以及其它的各种饮料都可以被本发明的方法来鉴定，而不用加入将要被使用者消费的试剂到产品中。本发明的优点之一是不需要加入外源性产品标记物。相反，使用产品本身的被分析物就可以进行检测。这对鉴定食品的真实性来讲就更为重要，因为加入不需要的标记物会影响食品的风味、气味、一致性等，而且当被消化时，还可能影响健康。这对那些非常不愿意改变产品的公司来讲更为重要。
本发明可以在不改变产品的情况下精确地得到需要被鉴定和监视的产品的发光特征表。
本发明的另一个优点是不需要知道或确定产品的组成，就可以选择发光化合物和建立精确地确定产品真实性的检测。因此，不需要知道可口可乐或百事可乐的配方，就可以确定使用这些商标的产品的真实性。这一点与很多的红外方法不同(例如，近红外、中红外、富利艾变换的红外)，那些方法经常需要获得足够的信息来确定受试产品组成。本发明的这个优点对那些不愿意披露其产品的秘方的公司来讲就更为重要。
本发明另外一个优点是，使用发光化合物的敏感水平远远超过使用富利艾变换红外的方法的敏感水平。
本发明的其它的优点和特征讲在以下的描述中和权利要求中变的更为明了。
附图的简要说明

图1表示的是化合物1-13号的化学结构。
图2是数据流程图。
本发明的详细描述本发明提供了自动化分析产品中被分析物如关键成分以及被分析物的如关键成分的相对量的方法，进而鉴定产品的真实性和监视仿冒以及监视产品质量管理。具体地讲，发光化合物可以被用来确定被分析物如产品的关键成分和定量其相对含量。
鉴定仿冒或改变的产品的方法依靠对一种产品建立一组介于2-7个具体的发光化合物以及专门化的自动化操作方法和新数据的分析。这些方法可以被用来提供与使用现有技术相似的方法，并且使用常规和可以获得的设备时更为迅速的完成。本发明的进一步方面提供了定量测定产品被仿冒的程度和改变的程度的技术。本发明再一方面提供了确定产品关键成分的方法和化合物。
本发明提供了确定产品中被分析物的相对数量的方法，将产品暴露于发光化合物中选定的发光化合物。对被分析物进行选择，使在有被分析物存在的情况下，该化合物可以与产品中水性和/或有机性的液体发生相互作用(例如，分配，嵌入，或结合)。产品成分与发光化合物之间的相互作用包括使用发光检测系统可以探察的化学反应。发光可以包括冷光、荧光、磷光。荧光如在“实用荧光”(Second Edition,G.G.Guilbault,Editor,MarcelDekker,Inc.,1990)所述，这篇文献通过在此引述而合并于本文。
一般而言，是将产品的样品与发光化合物混合。发光化合物与产品中的被分析物在对每一个产品和发光化合物为特定的温度和时间阶段内进行反应，例如，直到混合物的发光不再随着时间而改变为止。用光谱通带和截断滤膜分离由于样品的发光产生的光谱的激发波长。可以确定由于相互作用造成的发光的变化，计算公式为[(Fd-Fp)/Fd]x100，其中Fp是在没有产品时发光化合物的发光，Fd是将发光化合物暴露于产品后的发光。发光的改变是发光化合物与产品中被分析物相互作用的结果。发光还会因为间接影响而改变，例如，由被掺杂的产品的成分的淬灭造成。
发光化合物可以包括两种发光化合物，如果染料发光的最大值之间超过40nm，就可以被一起加入到样品小井中。在观察每一个具体的发光化合物时，需要更换波长滤片。确定某一个被分析物是否存在时，可以使用的发光化合物的种类数目是没有限制的。可以提高实际使用的发光化合物的种类数目来确定是否偶某一种成分存在，或在对相关的化合物的分析种排除非特异性的分析结果。
如果产品的被分析物的化学结构或痕迹化合物是未知的，也可以确定产品的真实性，此时优选使用3-7种不同的发光化合物。使用自动化机器人工作台(例如，Beckman Biomek 1000)，可以将发光化合物以随机的方式和产品标准物加入到微滴盘中。一旦对所有的标准物都建立了可探察的发光形式，就可以将一种测试产品加入到相同的微滴盘中(例如，可以是99标准物和1受试产品)。样品的发光结果与微滴盘中每一个标准相比较。这样，就可以在没有建立标准物发光水平的记录的情况下，确定产品的真实性。
发光化合物可以有很多的实例，其中的一些在图1中给出(化合物1-1 3)。化合物1是5-(2-碳肼甲基硫代乙酰)氨基荧光素，化合物2是5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素，化合物3是氟代-3戊铵盐，化合物4是硫酸原黄素半硫酸盐，化合物5是四(四甲铵)盐，化合物6是吖啶橙盐酸化物水合物，化合物7是BTC-5N，化合物8是吖啶黄素，化合物9是4-氨基荧光素，化合物10是5-氨基荧光素，化合物11是蓝香豆素硫化物，化合物12是香豆素二酸穴状配体(CD222)，化合物13是曙红Y。
可以被分析的液体产品和可以提供区分性和显著性分析的发光化合物的实例有，含乙醇的产品，如中度酒、伏特加、龙舌兰酒，它们可以被化合物如1、2、3、4、5、6、7、8、或9检测；含蔗糖或高果糖的产品，例如软饮料(如可口可乐和百事可乐)，它们可以被化合物如1、2、3、或9检测；婴儿食品，例如，Similac,Carnation,Enfamil等，它们可以被化合物如1、2、3、或7检测。应该理解的是，液体样品可以得自液体产品，或来自非液体产品(例如，溶解固体或半固体，提取固体并溶解等)。
本发明的方法可以用于分析其它的液体产品以及从其它的产品衍生的液体样品，其基础是选择正确的发光化合物用于分析。例如，含胺的发光化合物(如化合物1)和那些用于修饰胺、乙醇、精氨酸、鸟嘌呤核苷、和多糖的发光化合物(如化合物2)等，可以用于对产品的真实性的鉴定，监视和检测如中度酒、蒸馏酒、婴儿食品、或软饮料等。此外，那些钙指示剂化合物(如化合物3)，以及可以与Cd2+、Zn2+、pd2+或Ba2+复合的化合物(如化合物7)，可以用于对产品的真实性的鉴定，监视和检测如中度酒、蒸馏酒、婴儿食品、或软饮料等。发光吖啶化合物(如化合物6)可以与脂类和脂肪复合，可以用于对蒸馏酒或婴儿食品的真实性的鉴定和监视它们的生产。可以与醇类相互作用的发光吖啶黄化合物(如化合物8)可以用于对中度酒和蒸馏酒的产品真实性鉴定和监视及检测它们的生产。那些与伯醇、醛、或酮反应的发光化学物(如化合物9和10)可以用于中度酒、蒸馏酒、或软饮料的真实性鉴定或监视它们的生产。
发光化合物的选择对发光化合物的选择可以根据下述性质中的一个或一个以上(1)发光化合物在组合物中应该与产品的被分析物相互作用；(2)发光化合物在组合物中应该与产品的被分析物按照依赖浓度的方式相互作用；(3)发光化合物和相互作用的产物应该稳定并可以被重复；(4)同一批号的产品应该与发光化合物按照同样的方式相互作用；以及(5)发光化合物应该按产品关键成分的化学结构与那些接近的产品发生不同的相互作用(例如，区别不同品牌的产品，如，区别Smirnoff牌和Absolute牌的伏特加)。在很多情况下，需要确定多个发光化合物来鉴定一种消费品的真实性和监视其生产。
确定可以用于分析产品的发光化合物时，不需要知道产品中被分析物的化学结构，可以对其选择或假设其存在于产品中。对一种产品至少选定一种被分析物。可以按照上述的原则以及参照表1和表2中的信息来选择后选的发光化合物。这些表中的信息不是限制性的，只是提供对选择发光化合物有益的信息。表1中给出了用于鉴定产品关键成分的特殊功能基团的发光化合物的反应性基团。表2给出了选择的有用的起始发光化合物。含有发光化合物(根据上述原则及与产品中被分析物相互作用的结果选择)的样品的发光可以被用来鉴定产品的真实性、区分仿冒、和进行质量管理。
优选的选择方法如下。选择一种产品。稀释该产品，直到其吸收低于0.02。选择多种发光化合物，如染料。对这些染料进行稀释，使它们在以1.4μl染料加入到1ml稀释的产品中(一般为0.3-500微摩尔)的发光强度在200-2000之间。然后制备一系列的产品稀释物(吸收都小于0.02)。这样，例如，就可以得到按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、和1∶30比例稀释的产品稀释物。加入的染料量为1.4μl染料/ml稀释的产品。相似地，染料还可以加入到(1)可以接受的、但被改变了的标准物(如仅稀释了5％的标准物)中，(2)被改变了的但不可以接受的标准物(如稀释大于10％的标准物)中，(3)非真实的但很相近的产品(如百事可乐对可口可乐)。每项试验进行四份。由电子化手段建立了标准物的指纹，并且确定了可接受的范围，包括对可接受的被改变了的产品的指纹，排除了不可接受的和不真实的产品，使用的软件和计算公式在下面给出，而且预先确定了置信限(例如，两个标准偏差，三个标准偏差等)。在96井微滴盘中同时对多种染料测试并自动读取数据。根据区分真实和可接受的产品与非真实性和不可接受的产品的能力来选择染料。另外，可以进行校正。首先，选定测试稀释物，其稀释度是某种染料获得最大荧光时的最低产品稀释浓度的50％。然后，对其它的变量进行选择，如温度、培养时间、不可接受的和不真实的产品等，每个变化做四份，从而使选择的染料可以用于给定产品。应该理解的是，使用这类筛选方法，可以选定那些建立指纹特征表的染料的群体，而不用知道产品的组成，或产品中与染料结合的被分析物的组成。
表1
表2
另外一种用于鉴定产品的发光工具是称为杂质淬灭法的标准发光现象。甚至在稀释溶液中，杂质都可以造成对发光的可检测的淬灭。可以通过探察实际的淬灭量来确定产品的具体批号和批次。例如，参见“实用荧光”(Practical Fluorescence,G.G.Guilbault,Editor,page 32)。还可能的是，发光化合物的发光波长在有产品的某一成分存在(或缺失)时会发生漂移。这种漂移可以被用来定量产品中某一成分的数量。
有两种方法可以确定产品的区域性差别。一种方法涉及确定原料中不同地区的特异性化合物。不同地区的供货商将把不同水平的痕迹化合物留在所供应的原料中。虽然这些痕迹化合物的含量非常小，但是，发光化合物对百万分级的甚至在某些情况下对十亿分级都是敏感的。例如，痕迹水平的化合物，如醛和甲醇，可以被用来确定在水果和可乐饮料中蔗糖和高果糖玉米糖浆的不同来源(即不同的供应商)。在另外一个实例中，从玉米中蒸馏的乙醇含有与从蔗糖中蒸馏的乙醇不同的痕迹化合物。对这些痕迹元素的分析和鉴定可以用来检测产品的真实性，或检测某一产品的回充填(即稀释)。
第二种可以确定产品的区域性差别的方法涉及分析原料中不同地区的痕迹元素(或化合物)，例如，稀释消费品的水。痕迹元素(或化合物)可以被用作某一批号产品的标记。具体地讲，钙、镁和/或重金属的水平可被用来鉴定那些“特定批号水身份”的产品。此外，生产厂家的加工过程回留下可检测数量的至少一种痕迹物质并可以用来鉴定该公司的具体产品。痕迹物质的种类和数量使鉴定某一具体生产的批号成为可能。例如，很多可乐的浓缩液和终产品都具有固定水平的咖啡因。那些指示咖啡因浓度的发光化合物可以按照本文中的方法找到。
用发光分析可以确定样品中关键成分的相对数量。发光测量可以与其它的痕迹发光分析方法一起用于鉴定真实性。例如，伏特加必须含有50％以上的乙醇才可以被合法地称为伏特加。此外，该方法还可以被用来对橙汁、苹果汁、柠檬汁等的真实性、批号、批次等进行鉴定。
水的相对含量可以在标准品与怀疑样品之间进行比较，例如，比较它们的萘胺。磺酸化的萘胺，如2-p-甲苯氨基亚萘基-6-磺酸盐(2,6-TNS)和1-苯胺基-8-萘磺酸盐(1,8-ANS)在水中改变其发光波长。波长的改变决定于其在水中的含量。例如，在水中，光谱敏感性的改变是向更长的波长变化，发光的光子数目和衰变期都降低。
数据分析可以使用多变量分析对具有发光化合物的每个产品的样品的发光结果进行分析。通常，得到的结果都用以同样方式处理的标准产品的发光，即“指纹”，来比较和解释。对所有的样品都可以分析其关键成分，使用的发光化合物可以含有单一的发光化合物，或多种发光化合物的组合。对每一套产品样品确定其最大和最小平均值，每个样品取四份(n=4)。多元比较程序可以确定关键数值(例如，在95％置信水平)，得到最大和最小样品平均值的差异，也就是各个产品的差异。样品平均值的差异如果等于或大于该关键数值，则表明产品之间有显著差异。该显著差异表示产品的原料、组成、或加工不同。
通常，这些分析涉及进行Tukey多重比较程序(TukeyMultiple Comparison Procedure)，例如，在95％置信水平(α=0.05)。该多重比较程序假设样品的平均值k依赖于单个的随机样品，每个含有相同数量的读数n。在这种情况下，标准偏差s是样品平均平方误差(MSE)的平方根。该MSE有一定数目的自由度ν与其相关。由κ、ν和α可以确定Studentized范围的关键数值qα(κ、ν)[(参见，例如，Biometrika Tables,Vol.1,E.L.Pearson and H.O.Harily,eds.,Cambridge University Press,Cambridge(1966)]。因止，则距离ω为ω=qα(k,v)sN0.5]]>Tukey分析可以鉴定那些样品平均值不与标准产品相匹配的情况。如果两个测定值的差距大于ω，那么，这两个产品就不同。如果不是这样，则这对样品具有非常相似的组成(即，组成相同，但可能是不同的批次)。每一个发光化合物/产品样品系统可以被认为是单一的变量。讲对各种发光化合物的分析结合起来，可以得到多变量分析，我们为此专门开发了软件。进行这种多变量发光产品真实性分析，可以使用工作表类型的计算机软件来完成。
在上面描述了Tukey分析后，应该理解的是其它的多变量分析方法也可以被使用。这些替代的方法包括，例如，Duncan多范围分析和Newman-Kuls分析，对它们的描述见BiostatisticalAnalysis,3rdEdition,J.H.Zar,Prentice-Hall,Upper Saddle River,NJ(1996)。
图2是数据流程图，表示本发明系统的整体工作情况。标准物样品用第一处理系统40和选择的化合物处理，得到产生的发光结果42。可以将这些结果存储到数据库44。类似地，用处理系统46和同样的选择的化合物对未知的样品进行处理。该处理系统46产生发光结果48，即每一个未知的样品的指纹。然后由比较装置50进行比较，得到样品真实性的指标。可以采用上述的Tukey多变量方法进行比较。接收发光结果的计算机可以从处理系统40和46直接接收发光数据，也可以通过网络接收这些数据。比较装置可以从进行比较的计算机附近或远程数据库接收标准样品的指纹数据。
适宜配合比较装置50的计算机一般包括主机，连接有输出装置如显示器，还连接有输入装置如键盘。主机一般包括处理器，通过内部机制与存储系统连接。输入装置也同处理器和存储系统在内部连接，输出装置也如此。
应该理解的是，该计算机系统可以连接一个或一个以上的输出装置。输出装置的例子有阴极射线管显示器(CRT)，液晶显示器(LCD)，打印机，通讯装置如调制解调器，以及声音输出等。还应该理解的是，该计算机系统可以连接有一个或一个以上的输入装置。输入装置的例子有键盘，键板，鼠标，笔和板，通讯装置，声音输入和扫描仪等。应该理解的是，本发明并不受计算机系统连接的具体的输入或输出装置和在此所描述的装置的限制。
计算机系统可以是常规计算机，将其配置为可以处理高水平程序语言即可，如C语言或PASCAL语言。该计算机系统还可以被特殊编程，采用特殊的硬件。对于常规计算机系统，其处理器可以是市售的处理器，如Intel公司生产的486等×86系列，或680×0系列的摩托罗拉公司生产的处理器。其它的很多种处理器也都可以被使用。这些微处理器运行操作系统，例如，UNIX、DOS、和VMS等，从而控制对其它的计算机程序的运行，并提供制表、解疑、输入/输出的控制、财务、汇编、存储任务、数据管理、和记忆管理、通讯控制和相关的功能。该处理器和运行系统限定了工作平台，规定了可以为其编写程序的语言。
记忆系统一般包括计算机可读和可写的非易失性的介质，比如磁盘、快速记忆和记忆带等。磁盘可以是可移动的，如便携式磁盘或光盘，或者是永久性的，如硬盘。磁盘中有可以储存信号的轨迹，一般是二进制的，即按照0和1的序列进行运算的。这些信号可以限定被微处理器执行的应用程序，或被应用程序处理的磁盘中储存的信息。一般在工作时，处理器将存储于非易失性记录介质中的数据变为集成电路的记忆元素，一般为易失性随机可读记忆，如动态随机存取存储器(DRAM)或静态随机存取存储器(SRAM)。集成电路记忆元素是处理器可以比从磁盘中更快地获得的形式。处理器一般在集成电路记忆中操作数据，运行后，将数据复制到磁盘。对数据在磁盘和集成电路记忆元素之间的运动有多种管理机制，本发明并不受这些机制的限制。还应该理解的是，本发明不限于任何具体的记忆系统。
应该理解的是，本发明并不限于具体的计算机平台、具体的处理器、或具体的高水平语言。此外，计算机系统可以是多处理器的计算机系统，也可以是多个计算机连接起来的计算机网络。
材料和方法我们建立了优化分析方法和鉴定在产品的水中和/或有机成分中的产品的真实性或仿冒性的方法。使用化合物1-10的方法描述如下。
使用Beckman Biomek 1000自动工作台(BeckmanInstruments,Columbia,MD)制备稀释液，将150微升的发光化合物加入到测试盘中，当然，也可以使用其它的自动工作台。测试盘可以是任何适宜的材料制造的，并具有任何数目的小井，例如，6、24、96、或384个小井(Corning-Costar,Falcon-Collaborative的小井测试盘)。没有产品时的发光化合物的发光是Fp，接触了产品后的发光是Fd。在这些试验中使用的是分子动力荧光读取器(Molecular Dynamics FluorImager 575)读取Fp和Fd，其它的测试盘读取器也可以被使用(如，Cytofluor)。
使用光谱通道和截取滤片从样品的发光光谱中分离激发的波长。对测试盘中每一个小井中的每一种化合物进行其Fd发光分析。重复进行试验，以纠正系统误差，例如，自动移液(＜5％)。然后，使用Beckman Biomek 1000自动工作台将150微升的产品加入到小井内的化合物中。让化合物和产品进行反应，时间和温度服从每一个具体产品和化合物的要求。由于产品而造成的化合物发光的改变用公式[(Fd-Fp)/Fd]x100来计算。
在某些实施方案中，可以使用一些不反应的标准物如红宝石或其它的宝石等来补偿激光输出信号强度的改变。在这些实施方案中，不反应标准物可以被放在测试盘的一个小井中。
化合物1号，即5-(2-碳肼甲基硫代乙酰)氨基荧光素，购自于Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR，批号2841-1。工作溶液的最后浓度是在0.5-10微摩尔的范围内。化合物1号的最大激发在中性pH时为488 nm，在pH 8时为356 nm。化合物1号在520nm处有最大发射。对于该化合物的合成可以参见R.E.Hileman,etal.,Bioconjugate Chem.5:436(1994)。
化合物2号和3号应该一起使用。化合物2号，即5-(4,6-二氯三嗪基)氨基荧光素，购自于Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR,批号2851-1。在二甲亚砜中(DSMO,ACS试剂，SigmaChemical,St.Louis,MO)制备化合物2的溶液。工作溶液的最终浓度范围是0.5-10微升。化合物2的最大激发在495.7 nm,最大发射在516.3 nm。关于这个化合物的原来用途参见Barskii etal.,lzv.Akad.Nuak SSSR,V.E.(1968)PN 101。
化合物3号，即氟代-3戊铵盐，购自于Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR，批号2641-6。工作溶液的最终浓度范围是0.5-10微升。化合物3的最大激发在510 nm，最大发射在530 nm。氟代-3戊铵盐原来用途是在细胞试验中测量钙水平的。参见Tsien R.,et al.,J.Biol.Chem.264:8171(1989)。
化合物4号，即硫酸原黄素半硫酸盐(3,6-二氨基吖啶半硫酸盐)，购自于Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。工作溶液的最终浓度范围是0.5-10微升。化合物4的最大发射在甲醇中为515nm。原黄素原来用途是给细胞染色和布匹的染料。参见Chan,L.M.,et al.,Biochem.Biophys.Acta,204:252(1970)。
化合物5号，即四(四甲铵)盐，购自于Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。工作溶液的最终浓度范围是0.5-20微升，根据受试产品而定。化合物5的最大激发在488 nm，最大发射在535 nm附近。化合物5号原来的用途是荧光测定钠离子浓度时的钠指示剂(Sodium Greenlm)，由Molecular Probes公司发展出来的。
化合物6号，即吖啶橙盐酸化物水合物，购自于Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。工作溶液的最终浓度范围是0.5-20微升。化合物6的最大激发为490 nm，最大发射为519 nm。化合物6号可以用于印刷油墨和生物学样品中脂肪和脂类的染色剂。参见Clark,G.,“Staining Procedure”ed.Williams and Wilkins,Baltimore 1981pp.48,57,61,71,72,86,87,89,90 and 429。
化合物7号，即BTC-5N(Costlei et al.,J.of Chem.SocietyPerkins translation 2,p.1615)，购自于Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。工作溶液的最终浓度范围是0.5-20微升。化合物7的最大激发为约415 nm，最大发射为515 nm。
化合物8号，即吖啶黄素，含有约8比1的3,6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和3,6-二氨基吖啶，购自于Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。工作溶液的最终浓度范围是0.5-20微升，取决于具体的受试产品。化合物8在其中性形式下，在乙醇中的最大激发为约483 nm，最大发射为517 nm，而且其发射状态延续时间长，可以样品中乙醇的相对含量。这种长时间的发射状态的报道见于Furumoto,H.W.and Ceccon,H.L.,IEEE J.Quantum Electron.,QE-6,262(1970)。化合物8是常规的生物染色剂，并可以用做发光化合物和Schiff试剂。参见“Conn’s,Biological Stains,”9th ed.:Lillie,R.D.,Ed.；Williams and 25 WilkinsBaltimore,1977；p.355。
化合物9号，即4-氨基荧光素，购自于Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。工作溶液的最终浓度范围是0.5-20微升，取决于具体的受试产品。化合物9的最大激发为约496 nm，最大发射为530 nm。参见Coons,A.H.,et al.,J.Exp.Med.91:1-14(1950)。
化合物10号，即5-氨基荧光素，购自于Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。使用方式及浓度类似于化合物9号。化合物10的最大发射为530 nm。参见Glabe et al.,Anal.Biochem,130:287-294(1983)。
化合物11号，即蓝香豆素硫化物，S-6902，购自于MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR。化合物11的最大激发在325 nm，最大发射在373 nm。化合物11号可以用于测量亚硫酸盐。亚硫酸盐对高果糖浆的污染是玉米加工和研磨工业中众所周知的问题。
化合物12号，即香豆素二酸穴状配体(CD222)(Costleiet al.,J.of Chem.Society Perkins translation 2,p.1615)购自于Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。化合物12是比例染料，最大激发在365 nm，最大发射在465 nm。化合物12号是对钾敏感的染料，可以鉴定含有苯甲酸钾的产品，而苯甲酸钾是众多可乐饮料中的防腐剂。
化合物13号，即曙红Y，购自于Sigma-Aldrich,St.Louis,MO。化合物13的最大激发为522 nm，最大发射为551 nm。化合物13号是pH敏感的发光化合物。
实施例1-中度酒本发明的分析方法可以用于葡萄酒和蒸馏酒工业，鉴定产品的真实性、保卫国际驰名商标、记录产品质量、检测对产品的回充填(即用低档次成分稀释产品)。在这些工业中，产品中的乙醇的来源和产地可以用来鉴定产品的真实性。产品的标签必须正确地反应厂商灌装瓶内的成分。以前，没有实际可行的鉴定乙醇来源或中度酒(96％乙醇)的方法。
对6个乙醇样品进行了双盲试验来区分它们。此外，如果进行双份试验，则该试验就设计为检测这些双份样品的试验。
从表3和表4中的数据可以鉴定中度酒的产地。表3中，受到激发后的发光水平是从6个样品(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、和10-6)中监测到的，每个试验进行了4次(A、B、C、和D)，都使用了一对发光化合物。在每一套数据中，每个产品的样品都用发光化合物测验4次。激发波长为522 nm。发光化合物是化合物2号和3号。
发光化合物原液的制备是，将化合物2号以2 mM的浓度溶解于DMSO中，化合物3号以1mM浓度溶于DMSO中。
发光化合物的工作液对照中度酒的已知样品进行调整。最佳浓度的确定是，发光化合物的浓度使其发光强度对已知中度酒和其它的样品之间的区分值大于ω。化合物2号的工作液是用12微升的原液溶于20毫升的蒸馏水制备的。化合物3号的工作液是将100微升的原液溶于20毫升的蒸馏水来制备的。
化合物2号和3号都需要53OBP+15光通道滤镜来降低在发光测量中的激发光波强度。发射光的强度测量都是以相对单位荧光(rfu)表示的。发射测量总是在线性反应区内进行，其在荧光测量仪器上的读数区为200-2000rfu。表3 统计数据中度酒A10-1 A10-2 A10-3 A10-4 A10-5 A10-6B10-1 B10-2测量10.2276-0.5481-0.2021-0.2030-0.54790.17730.2088-0.5474测量20.2299-0.5454-0.1991-0.1979-0.53540.20960.2363-0.5417测量30.2384-0.5471-0.2095-0.1966-0.54790.18110.2148-0.5524测量40.2468-0.5573-0.1982-0.1939-0.54340.19320.2113-0.5548方差 7.618E-05 2.886E-05 2.629E-05 1.467E-05 3.466E-05 2.119E-03 1.584E-04 3.377E-05平均值 0.2357-0.5495-0.2022-0.1978-0.54370.19030.2178-0.5491B10-3 B10-4 B10-5 B10-6C10-1 C10-2 C10-3 C10-4测量1 -0.2395-0.2079-0.56990.16700.2480-0.5471-0.1908-0.1828测量2 -0.2116-0.2309-0.56270.23370.2683-0.5383-0.1899-0.1886测量3 -0.2424-0.2381-0.56370.16770.2759-0.5330-0.1883-0.1862测量4 -0.2312-0.2292-0.57690.18100.2501-0.5356-0.1911-0.1756方差 1.936E-04 1.689E-04 4.32E-05 9.967E-04 1.876E-04 3.765E-05 1.506E-06 3.184E-05平均值-0.2312-0.2256-0.56830.18740.2606-0.5385-0.1900-0.1833C10-5 C10-6 D10-1 D10-2D10-3 D10-4 D10-5 D10-6测量1 -0.54490.21540.2435-0.5597-0.2321-0.2200-0.56330.1974测量2 -0.56150.22340.2609-0.5486-0.2191-0.2104-0.56260.2431测量3 -0.54880.22470.2687-0.5496-0.1994-0.1999-0.55520.2597测量4 -0.54530.24280.2861-0.5452-0.2055-0.1891-0.54660.2766方差 6.0446E-05 1.341E-04 3.124E-04 3.882E-05 2.134E-04 1.776E-04 6.078E-05 1.161E-03平均值-0.55010.22660.2648-0.5508-0.2141-0.2048-0.55700.2442MSE=0.0001835 ω=0.0354918
每种工作溶液(150μl)用自动操作仪器加入到测试盘中，体积的误差小于5％。将该工作溶液/测试盘进行背景荧光测定，以用于计算组合物的成分，测试盘的尺寸，以及激光结果。可以使用各种的激光或非激光的荧光检测系统来进行激发和发射试验。在这类的实验中，使用的是FluorImager 575(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)进行的测定。
中度酒样品被直接加入到样品测试盘中。分析中度酒中的关键发现是，对残留的水的分析是十分重要的。对化合物3号的信号的设计是要分析残留水。然而，样品中高浓度的乙醇掩饰了水的信号。为了使这种鉴定方法工作良好，在样品被加入到测试盘的单个小井中后，用真空将乙醇去除。这样，就可以对中度酒样品中的水进行准确的分析。由于这种去除是直接发生在微滴盘中，所有的样品都受到同样的处理，其方法是将真空装置自动放在自动化操作工作台上进行的。
试验的结果列于表3。对每一组(A、B、C、或D)4个测定进行变量和平均值的计算。在这个指纹分析中使用的置信限水平是95％。如果两个样品的平均值之间的差距大于ω，则这两个样品就不同(即，其组成上显著不同)。例如，试验A中，样品10-1的发光强度的平均值为0.2357，而样品10-2的则为-0.5495。它们之间的差距是0.7852。该A试验的ω值为0.0354918。如果两个样品之间的差距(0.7852)大于ω(0.0354918)，则这两个样品不同。因此，样品10-1和10-2是不同的。这种比较严格依据统计数据，可以自动进行，不用进一步的推断。
指纹数据都列于表4，用于进行比较。表4中的数值1表明，两个样品的平均值的差距大于ω。数值0表示两个样品的差距不大于ω。因此，数值0表明样品是成对的(即，组成基本相似，例如，不同的批次或批号)，或样品是对自己进行的试验(表4中从左上到右下的对角线)，而数值1表示两个样品不同。当成对的样品始终保持不一样的时候，则样品就被确认为在组成上有实质的不同(即，不同的品牌)。表4中指纹分析的结果是，产品10-1和10-6,10-2和10-5,10-3和10-4是相互不同的(即，不同批次)的成对(即，组成基本相似)产品。
实施例2-基馏酒按照与实施例1相似的方法，还可以鉴定蒸馏酒，例如，鉴定伏特加。在这个指纹分析中，可以使用化合物1、2、3、4、5、6、7、和8号。
化合物1号的工作原液是在1∶1的DMSO/水的混合物中为1.5 mM。化合物2号的工作原液是在DMSO中为2 mM。化合物3号的工作原液是在1∶1的DMSO/水混合物中为0.5 mM。化合物4号的工作原液是在DMSO中为1 mM。化合物5号的工作原液是在蒸馏水中为1 mM。化合物6号的工作原液是在DMSO中为1 mM。化合物7号的工作原液是在蒸馏水中为1 mM。化合物8号的工作原液是在乙醇中为4 mg/mL(色谱级，SigmaChemical Company,St.Louis,MO)。
工作液浓度的确定按照实施例1进行。发光化合物的最佳浓度被确定为使两个样品的差值大于ω时就可以区别这两个样品的水平。化合物2号的工作液用120微升的2 mM原液稀释在20毫升的蒸馏水中制备。化合物3号的工作液用100微升的原液稀释在20毫升的蒸馏水中制备。化合物4号的工作液用100微升的原液稀释在50毫升的蒸馏水中制备。化合物5号的工作液用75微升的原液稀释在50毫升的蒸馏水中制备。化合物6号的工作液用50微升的原液稀释在50毫升的乙醇中制备。化合物7号的工作液用25微升的原液稀释在50毫升的蒸馏水中制备。化合物8号的工作液用50微升的原液稀释在50毫升的蒸馏水中制备。化合物1、2、3、4、5、6、和8号需要使用53OBP+15的滤镜来降低在发射过程中的激发波长强度。化合物7号需要使用515 nm长波滤镜(Long Pass Filter,LP)。
如同实施例1，每种工作溶液(150μl)用自动操作仪器加入到测试盘中，体积的误差小于5％。按照实施例1对蒸馏酒(伏特加)样品进行分析。
实施例3-碳化饮料和水果饮料本发明的方法可以用于软饮料和水果汁工业中，例如，特别是检查第三者对每次生产的配方重组和监视被许可方对合同的遵守。对这类样品的检测的分析速度应该高于300样品/小时。本检测不是双盲试验。
对产品配方的鉴定方法类似于实施例1的方法。当产品达到同样高质量的时候，它们的指纹一样。参见表5，对6个样品(百事可乐1、百事可乐2、无糖百事可乐3、传统可口可乐4、无糖可口可乐5、和野黑樱6)，用四种不同的发光化合物(A、B、C、和D)各测试4次。试验A使用化合物1号。试验B使用化合物2号。试验C使用化合物3号。试验D使用化合物9号。每种产品的样品用每种发光化合物测试四次。
试验方法基本如下。将饮料或果汁用水稀释到1∶10-1∶300，为的是得到与发光化合物的最佳反应。样品的最佳反应是用浓度曲线对最大发射反应确定的。样品的浓度的选择是，使其给出对受试样品的最大发射反应的一半值。表5 A A A A A A B B百事可乐1 百事可乐2 无糖百事可乐 传统可口可乐 无糖可口可乐 野黑樱 百事可乐1 百事可乐2测量1-0.8311-0.8360-0.7252-0.8701 -0.6664 -0.8449 -0.3758-0.3040测量2-0.8473-0.8358-0.7179-0.8716 -0.6614 -0.8368 -0.3471-0.3294测量3-0.8315-0.8349-0.7157-0.8721 -0.6414 -0.8432 -0.3254-0.3186测量4-0.8407-0.8293-0.7145-0.8633 -0.6544 -0.8368 -0.3368-0.2848方差6.105E-05 9.985E-06 2.301E-05 1.644E-05 1.179E-04 1.179E-04 1.924E-04 3.725E-04平均值 -0.8376-0.8340-0.7183-0.8693 -0.6559 -0.8404 -0.3418-0.3092B B B B C C CC无糖百事可乐 传统可口可乐 无糖可口可乐 野黑樱百事可乐1 百事可乐2 无糖百事可乐 传统可口可乐测量1 0.3592-0.2481 0.7057-0.67252.3477 2.4311 3.2869 2.2283测量2 0.3953-0.2200 0.7018-0.65832.4218 2.2661 3.2057 2.2739测量3 0.3907-0.2192 0.7283-0.66202.4042 2.4579 3.2358 2.3609测量4 0.4082-0.2119 0.7634-0.67312.4532 2.5020 3.3130 2.4228方差3.886E-04 2.551E-02 7.983E-04 5.589E-05 1.958E-03 1.061E-02 2.357E-05 7.589E-03平均值 0.3780-0.2248 0.7248-0.66652.4067 2.4143 3.2603 2.3215C C D D DD D D无糖可口可乐 野黑樱 百事可乐1 百事可乐2 无糖百事可乐 传统可口可乐 无糖可口可乐 野黑樱测量1 3.4794 1.68448.65898.8383 7.33588.0844 6.874810.4029测量2 3.4689 1.69868.76419.1611 7.39818.3034 6.977910.5467测量3 3.5929 1.74899.10299.1162 7.58218.2324 7.030310.5861测量4 3.6457 1.92019.45179.4517 7.50148.6027 7.187911.0469方差7.507E-03 1.174E-02 0.12883.833E-021.192E-02 4.752E-02 1.705E-02 7.776E-02平均值 3.5467 1.76308.99449.1055 7.45448.3057 7.017710.6456MSE=0.0152267ω=0.3232988
发光化合物的工作原液的制备是，化合物1号在1∶2的DMSO/水中的浓度为1.5 mM，化合物2号在DMSO中的浓度为2 mM，化合物3号在DMSO中的浓度为1 mM，化合物9号在DMSO中的浓度为10mM。
发光化合物的工作溶液的浓度按照实施例1取最佳值。最佳浓度的确定是，发光化合物的浓度使其发光强度对标准产品的样品和其它的未知样品之间的区分值大于ω。化合物1号的工作液的制备是将75微升的原液稀释于50毫升蒸馏水中。化合物2号的工作液的制备是将120微升的原液稀释于20毫升蒸馏水中。化合物3号的工作液的制备是将100微升的原液稀释于20毫升蒸馏水中。化合物9号的工作液的制备是将50微升的原液稀释于50毫升蒸馏水中。
化合物1、2、3、和9号需要使用53OBP±15的滤镜来降低在发射过程中的激发波长强度。样品的处理和发射的分析都按照实施例1进行。
试验结果列于表5。对每个样品于每个发光化合物的结合共进行了4个不同的试验(A、B、C、和D)。每次测量都重复4次以确定其重复水平。对每组4次的测量结果进行变量和平均值的计算。在这个指纹分析中，置信限水平为95％。如果两个样品的平均值之间的差距大于ω，则这两个样品就不同(即，其组成上显著不同)。例如，在化合物D的试验中，样品百事可乐1的发光强度的平均值为8.9944，而样品百事可乐2的则为9.1055。它们之间的差距是0.1111。该试验的ω值为0.3232988。如果两个样品之间的差距(0.1111)大于ω(0.3232988)，则这两个样品不同。因此，样品百事可乐1和百事可乐2是基本相同的。
表6中的指纹数据是按照实施例1的方法建立的并用于进行比较。按照表6进行的指纹分析，百事可乐1和百事可乐2是成对的，组成相似，而其它的样品则不相关。
实施例4-对饮料的一步分析可以对实施例3的方法进行修正后，使其监视饮料中的关键成分。重要的是，本发明的自动化发光测量方法同样可以监视那些常规真实性鉴定方法中所检测的关键成分。换句话说，有些产品中固有的成分具有发光特性。可以对这些成分在一个分析盘中进行分析的方法与发光化合物结合起来，就可以将自动化的方法修改为廉价的一步发光扫描方法。
在可乐中所监视的标准成分是，例如，高果糖糖浆、咖啡因，苯甲酸钠，pH值，以及甜味素。对可乐的检测已经找到了结合的两种发光化合物。第一种结合监视糖的来源、咖啡因、pH、和防腐剂(例如，苯甲酸钠和苯甲酸钾)。第一种结合可用于分析常规的碳化饮料。第二种结合是经过修饰的，用于分析无糖碳化饮料并监视甜味剂，咖啡因，pH，和防腐剂。这些结合的设计是要检测具体成分的改变，如百分之0.1,0.3,0.5,1,2，和3水平内的降低。
第一种结合包括化合物1号，化合物2号，和化合物11号，用于分析糖(或高果糖玉米糖浆)。咖啡因本身是一种发光化合物，因而不需要与其它的化合物混合。常规的防腐剂，苯甲酸钠和苯甲酸钾都可以被一些发光化合物鉴定。例如，化合物12号是对钾敏感的染料。苯甲酸基团中的羧酸可以与各种烷基卤，碳化二亚胺，以及含醇的发光化合物(见表1)反应。使用在pH1-4中(大多数的饮料的pH值在2.4-4.0之间)可以发射的任何pH敏感性发光化合物就可以对pH进行确定。PH敏感性发光化合物的一个实例是化合物13号。
发光化合物的工作原液的制备是，化合物1号在1∶1的DMSO/水中的浓度为1.5 mM，化合物3号在1∶1的DMSO/水中的浓度为0.5 mM，化合物11号在乙醇中的浓度为10 mM，化合物12号在DMSO中的浓度为10 mM，化合物13号在蒸馏水中的浓度为10 mM。
发光化合物的工作溶液的浓度，按照实施例1对鉴定每种软饮料的关键成分取最佳值。化合物1号的工作液的制备是将75微升的原液稀释于50毫升蒸馏水中。化合物3号的工作液的制备是将100微升的原液稀释于20毫升水中。化合物11号的工作液的制备是将50微升的原液稀释于50毫升蒸馏水中。化合物12号的工作液的制备是将50微升的原液稀释于50毫升蒸馏水中。化合物13号的工作液的制备是将50微升的原液稀释于100毫升蒸馏水中。
咖啡因(无水性，Sigma Reference Standard Product IC-1778)被用作不含咖啡因的饮料(产品特异性)的标准物，是确定咖啡因的内部校准标准。咖啡因的最大激发在254 nm和330 nm，最大发射在350nm。
化合物1号和3号都需要使用52OBP+15的滤镜。咖啡因需要345LP滤镜。化合物11号需要365B±15的滤镜。化合物12号需要46OBP+6.8滤镜。化合物13号需要550BP+15 nm滤镜。
第二种结合对无糖碳化饮料的分析基本与第一种结合相同，除了化合物1号，3号和11号被指示甜味剂存在的发光化合物取代。它们包括与羧酸基团和氨基反应的发光化合物。具体见表1。
实施例5-婴儿食品本发明的方法还可以用于婴儿食品工业来鉴定产品的真实性。在1995年，仿冒的婴儿食品在16个州的连锁食品店中非法销售。货架上的真实的婴儿食品可以保证消费者得到真实可靠的产品。使用本发明的方法，就可以保证在销售地的产品与产地的产品相一致。此外，使用质指纹鉴定，还可以检测产品是否被仿冒或受到破损了。
产品的配方可以用与实施例1类似的方法鉴定。当产品达到同样的高质量标准时，它们的指纹相同。参见表7，对六个样品(Gerber,Similac液体，Similac粉剂，Carnation Follow-up,Enfamil，和奶粉标准物)进行了发光的监视，每个样品用发光化合物测试4次。发光化合物包括化合物1号，2号，3号和7号。
样品的制备按照厂商的说明书进行，将它们的产品用水稀释(例如，将8.5克的产品溶于60毫升的蒸馏水中)。获得的溶液进一步稀释1000倍，用Millipore 0.22/Lm无菌过滤器过滤。过滤后的样品直接用于分析。
发光化合物的工作原液的制备是，化合物1号在1∶2的DMSO/水中的浓度为1.5 mM，化合物2号在DMSO中的浓度为2 mM，化合物3号在DMSO中的浓度为1 mM，化合物7号在蒸馏水中的浓度为1mM。
发光化合物的工作溶液的浓度，按照实施例1所述选定。化合物1号的工作液的制备是将75微升的原液稀释于20毫升蒸馏水中。化合物2号的工作液的制备是将120微升的原液稀释于20毫升水中。化合物3号的工作液的制备是将100微升的原液稀释于20毫升蒸馏水中。化合物7号的工作液的制备是将25微升的原液稀释于50毫升蒸馏水中。
化合物1号，2号，3号和7号都需要使用53OBP±15 nm的滤镜。按照实施例1进行分析。被稀释和过滤的样品直接加入到染料中进行发光测定。
实验的结果列于表7。每个样品与发光化合物结合都进行了测定。每个测定重复4次来确定其重复水平。在指纹分析中使用的置信限为95％。所进行的分析与实施例1和2中描述的相似。
例如，Gerber样品的平均发光是-0.2049,Similac样品的平均发光为-0.1941。它们之间的发光的差距是0.0108。该实验的ω是0.044。如果他们的差距(0.0108)小于两个样品的ω，那么，这两个样品基本相同。所以，这两个产品基本相同。指纹数据列于表8，建立的方法与实施例1相同，用于进行各种比较。从表8中的指纹分析的结果看，Gerber,Similac和Enfamil样品都是相同的。然而，Carnation和标准物不同。标准物是Carnation挥发后的牛奶。
表7
表8
其余的实施方案都在权利要求书的范围之内。
等同物本领域的技术人员将知道或者通过不多的例行试验就能确定许多与本文介绍的具体实施方案等价的方案。这些方案和其他等价方案没有脱离本发明的权利要求规定的范围。
权利要求
1．一种确定样品与已知真实标准或已知具有至少一种选择的真实材料的特征的相关性的方法，该方法包括(a)制备样品与至少一种发光化合物的混合物；(b)用激发波长的光照射样品混合物；(c)监视作为照射光波的反应性的至少一种发射光波，建立样品发射强度；(d)提供标准混合物的标准指纹特征，所述的标准混合物包括标准物和发光化合物，用照射光波照射多个标准混合物并监视其反应性的发射光波来建立标准指纹；以及(e)将样品的发射强度与标准指纹相比较来确定该样品的真实性。
2．根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供背景对照混合物，其包括发光化合物，但没有样品或标准物；用激发波长激发该背景对照混合物，并监视其反应性发射波长，建立背景发射；以及根据背景对照混合物的发射与样品混合物的发射之间的至少一种差异来确定样品的发射强度。
3．根据权利要求1所述的方法，其中所述的发光化合物是用自动移液器加入到发光化合物中的。
4．根据权利要求1所述的方法，其中所述的样品混合物有自动移液器加入到微滴盘中。
5．根据权利要求1所述的方法，其中所述的标准物，样品，或它们两者都具有固有的荧光，磷光，或冷光化合物。
6．根据权利要求5所述的方法，其中所述的化合物是咖啡因。
7．根据权利要求1所述的方法，其中所述的发光化合物是荧光素，磷光素，或冷光素。
8．根据权利要求1所述的方法，其中所述的发光化合物与样品的成分或标准物，或它们两者都反应，得到至少一种荧光，磷光，或冷光成分。
9．根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的标准物是一种组合物，包括预先确定了相对数量的真实材料的特征性成分。
10．根据权利要求2所述的方法，其中所述的标准物是一种组合物，包括预先确定了相对数量的真实材料的特征性成分，根据与背景对照发射比较而确定的第一发射改变来得到样品的发射强度，并且标准指纹是根据所述的多个标准混合物的每一个的第二改变而得到的被调整了的标准指纹；以及比较步骤包括将第一发射改变与被调整了的标准指纹相比较而得到的样品成分的相对数量的定量化。
11．根据权利要求1所述的方法，包括将步骤(b)-(c)重复至少三次。
12．根据权利要求11所述的方法，其中所述的步骤(b)-(c)的重复采用了不同的发光化合物。
13．根据权利要求11所述的方法，其中所述的不同的照射和发射波长是在每一个步骤中都进行的。
14．根据权利要求1所述的方法，其中所述的步骤(b)-(c)被重复至少三次，其中使用的是相同的发光化合物和同样的照射和发射波长，从而建立了产品指纹发射的档案。
15．一种选择染料确定产品真实性的方法，该方法包括将候选的染料加入到真实标准产品的液体样品的候选稀释液中，所述的候选染料是在与液体样品中的被分析物相互作用并被照射后以特定波长发光的，选择测试的稀释度，使所述的候选染料被以该浓度加入到液体样品中后以选择的强度发光，测定所述的候选染料与液体样品在所述的稀释度的众多混合物中的发光强度范围，确定所述的候选染料与非真实产品的液体样品在所述的稀释度的混合物中的实验性发光强度，以及比较该实验性发光强度和所述的发光强度范围，如果所述的实验性发光强度落在所述的发光强度范围之外，则该候选染料就被选择为可以用于确定所述的样品的真实性。
16．根据权利要求15所述的方法，其中所述的候选染料是多种候选染料，每一种染料都在特定的波长发光，而且其中的被分析物是多种被分析物，每一种染料结合所述的多种被分析物中的不同对象。
17．根据权利要求15所述的方法，其中所述的产品是液体消费品。
18．根据权利要求16所述的方法，其中所述的产品是液体消费品。
19．根据权利要求15-19所述的方法，其中产品的化学组成是未知的。
20．根据权利要求15-19所述的方法，其中被分析物化学结构是未知的。
21．一种鉴定产品真实性的方法，该方法包括，获得受试产品的液体样品，然后加入到发光化合物的液体样品中，该发光化合物与产品的被分析物相互作用得到测试样品，照射该受试样品，将受试样品的发光强度与发光化合物和真实产品的液体标准物同发光化合物的混合体经过照射后的受试样品的发光强度相比较，其中发光强度的相似性表明样品的真实性，而发光强度的不相似确定样品的非真实性。
22．根据权利要求21所述的方法，其中产品的化学组成是未知的。
23．根据权利要求21所述的方法，其中被发光化合物结合的被分析物的化学结构是未知的。
24．根据权利要求21所述的方法，其中所述的被分析物不是外源性的产品标记物。
25．根据权利要求21所述的方法，其中所述的产品是液体消费品。
26．根据权利要求21所述的方法，其中所述的发光化合物是多个发光化合物，并且所述的被分析物是多个被分析物，每一种发光化合物结合不同的所述的被分析物。
27．根据权利要求21所述的方法，其中所述的多个发光化合物在3-7个化合物的范围。
28．根据权利要求21所述的方法，其中，受试样品的发光强度与多个所述的混合物的发光强度相比较，并且，真实性要求的是，受试样品的发光强度落在预先选择的置信限定义的强度范围内，该强度范围是从所述的多个混合物的发光强度计算出来的。
29．根据权利要求26所述的方法，其中所述的比较步骤利用微处理器进行。
30．根据权利要求21-29所述的方法，其中所述的发光化合物是荧光染料。
31．一种计算机辅助的鉴定液体产品真实性的方法，该方法包括接收由加入某一种成分到液体产品的受试样品中并测量其发光所产生的发光数据；接收由对真实液体产品和某一种成分的混合物的样品进行发光测量所产生的发光数据；将受试样品的发光强度与多个混合物的样品的发光强度相比较，并且，其中真实性要求的是，受试样品的发光强度落在预先选择的置信限定义的强度范围内，该强度范围是从所述的多个混合物的发光强度计算出来的。
32．根据权利要求31所述的方法，进一步包括使用计算机数据库存储和提供真实产品的发光信息，并包括计算机可读取的带有计算机可读取的逻辑的介质，其中，计算机可读取的逻辑包括指示真实产品与某一种成分的多个混合物的样品发光强度测量的真实产品的众多记录，以及对所述成分和/或产品的指示，其中的记录可以通过对所述成分和/或产品的指示来读取，其中所述的接收真实产品的发光强度的步骤包括利用对所述成分和/或产品的指示来读取计算机可读取的介质以提取记录数据。
33．一种储存和提供关于真实产品发光信息的计算机数据库，该数据库包括带有计算机可读取的逻辑的计算机可读取的介质，其中计算机可读取的逻辑包括指示真实产品与某一种成分的多个混合物的样品发光强度测量的真实产品的众多记录，以及对所述成分和/或产品的指示；以及利用对所述成分和/或产品的指示来读取计算机可读取的介质以提取记录数据的装置。
全文摘要
本发明提供了产品的真实性、防伪性、制造质量性的高效、经济的鉴定方法和化合物。本发明的方法和化合物可以对产品中的关键材料测定其相对含量。化合物是发光的且与产品的关键材料相互作用,例如,中度酒饮料,伏特加,龙舌兰酒,软饮料以及婴儿食品等,当相互作用完成后,用本发明的方法鉴定由发光确定的关键成分的结果。
文档编号G07F7/08GK1217789SQ97194434
公开日1999年5月26日 申请日期1997年5月6日 优先权日1996年5月6日
发明者理查德·H·斯林弗瑞德 申请人:莱昂实验有限公司