本发明属于电活性生物膜技术领域，尤其涉及一种电活性生物膜的成膜方法及其应用。
背景技术
电活性生物膜，具有将电子传递到胞外环境中的能力，它们不仅参与环境中的关键元素地球化学循环过程，同时也能应用到微生物电化学系统、生物传感器和生物计算中系统中。但是，在自然环境下形成生物膜是一个十分缓慢的过程，因为它不仅有微生物与基质间的反应，还有微生物之间的富集，会受到营养物质分布不均匀和与基质反应不充分等限值因素的影响。因此，发掘能替代自然生物膜的高性能人造生物膜，已经成为了人们热切关注的问题。
传统的人造生物膜制备方法，主要是通过一些介质，例如聚四氟乙烯，将生物膜固定在电极表面，这一过程不可避免地会减少生物膜的完整性，甚至会破坏其中微生物的活性。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种电活性生物膜的成膜方法及其应用，该方法能够快速形成电活性生物膜，且其具有较好的产电性能。
本发明提供了一种电活性生物膜的成膜方法，包括以下步骤：
将氧化石墨烯溶液、二价铁盐和含氮导电聚合物超声混合，加热，干燥，得到固体产物；
将所述固体产物在无氧气氛下再次加热，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯；
将所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌混合，得到的生物聚合体在磁场作用下吸附在基体上，得到电活性生物膜。
优选地，所述二价铁盐选自醋酸亚铁、硝酸亚铁和氯化亚铁中的一种或多种。
优选地，所述含氮导电聚合物选自聚吡咯和/或聚苯胺。
优选地，所述氧化石墨烯溶液中氧化石墨烯、二价铁盐和含氮导电聚合物的质量比为0.006～0.03:15～50:15～50。
优选地，所述加热的温度为150℃～200℃，加热的时间为8～12h。
优选地，所述干燥的时间为10～24h；所述超声的时间为8～12min。
优选地，所述干燥的方式选自冷冻干燥或真空干燥。
优选地，所述再次加热的温度为500～700℃，再次加热的时间为2～5h。
优选地，所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯的质量和电活性菌的体积比为(4～8)mg:1ml。
本发明提供了一种微生物电化学系统，包括工作电极、辅助电极和参比电极；所述工作电极的表面附有由上述技术方案所述成膜方法制备的电活性生物膜。
本发明提供了一种电活性生物膜的成膜方法，包括以下步骤：将氧化石墨烯溶液、二价铁盐和含氮导电聚合物超声混合，加热，干燥，得到固体产物；将所述固体产物在无氧气氛下再次加热，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯；将所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌混合，得到的生物聚合体在磁场作用下吸附在基体上，得到电活性生物膜。该方法通过磁场作用将氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯/电活性菌的生物聚合体快速吸附到基体上，得到电活性生物膜。该方法能够快速形成电活性生物膜，且其具有较好的产电性能。该过程方便简捷，无需贵重设备，是一种快速、高效、廉价、环保、简便、稳定、可控的电活性生物膜快速成膜方法。实验结果表明：电活性生物膜的电流密度达到约0.20～0.23ma/cm2。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的四氧化三铁-还原氧化石墨烯的扫描电镜图；
图2为本发明实施例1中制备的氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料的扫描电镜图；
图3为本发明实施例2中四氧化三铁-还原氧化石墨复合材料在磁场下形成生物膜过程的时间和电流密度响应图；
图4为本发明实施例2中氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨复合材料在磁场下形成生物膜过程的时间和电流密度响应图；
图5为还原氧化石墨烯在磁场下工作电极ito玻璃上形成生物膜的sem图；
图6为实施例2制备的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料在磁场下工作电极ito玻璃上形成生物膜的sem图；
图7为实施例2制备的氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料在磁场下工作电极ito玻璃上形成生物膜的sem图。
具体实施方式
本发明提供了一种电活性生物膜的成膜方法，包括以下步骤：
将氧化石墨烯溶液、二价铁盐和含氮导电聚合物超声混合，加热，干燥，得到固体产物；
将所述固体产物在无氧气氛下再次加热，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯；
将所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌混合，得到的生物聚合体在磁场作用下吸附在基体上，得到电活性生物膜。
该方法通过磁场作用将氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯/电活性菌的生物聚合体快速吸附到基体上，得到电活性生物膜。该方法能够快速形成电活性生物膜，且其具有较好的产电性能。该过程方便简捷，无需贵重设备，是一种快速、高效、廉价、环保、简便、稳定、可控的电活性生物膜快速成膜方法。
本发明将氧化石墨烯溶液、二价铁盐和含氮导电聚合物超声混合，加热，干燥，得到固体产物。本发明优选将氧化石墨烯溶液和二价铁盐先超声混合，然后再加入含氮导电聚合物超声混合；更优选地，将氧化石墨烯溶液和二价铁盐先超声混合8～12min，然后再加入含氮导电聚合物超声混合8～12min。在本发明具体实施例中，氧化石墨烯溶液和二价铁盐先超声混合10min，然后再加入含氮导电聚合物超声混合10min。
在本发明中，所述氧化石墨烯溶液优选采用hummers法制得。所述氧化石墨烯溶液的浓度优选为1～5mg/l，更优选为2～5mg/l。在本发明具体实施例中，所述氧化石墨烯溶液的浓度为1.5mg/l。
在本发明中，所述二价铁盐优选选自醋酸亚铁、硝酸亚铁和氯化亚铁中的一种或多种。
在本发明中，所述含氮导电聚合物选自聚吡咯和/或聚苯胺。
在本发明中，所述氧化石墨烯溶液中氧化石墨烯、二价铁盐和含氮导电聚合物的质量比优选为0.006～0.03:15～50:15～50，更优选为0.007～0.025:15～40:15～40。在本发明具体实施例中，所述氧化石墨烯溶液中氧化石墨烯、二价铁盐和含氮导电聚合物的质量比为0.009:20:20。
在本发明中，所述氧化石墨烯溶液、二价铁盐和含氮导电聚合物超声混合后加热的温度优选为150℃～200℃，更优选为160～190℃，加热的时间优选为8～12h，更优选为10～12h。在本发明具体实施例中，所述加热的温度为180℃，时间为12h。
在本发明中，所述干燥的方式优选选自冷冻干燥或真空干燥；所述干燥的时间优选为10～24h。
得到固体产物后，本发明将所述固体产物在无氧气氛下再次加热，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯(n-fe3o4/rgo)。在本发明中，所述无氧气氛优选通过氮气实现。
在本发明中，所述再次加热的温度优选为500～700℃，再次加热的时间优选为2～5h。在本发明具体实施例中，所述再次加热的温度为600℃，时间为3h。
所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料中氮的掺杂能够使四氧化三铁-还原氧化石墨烯表面形成更多的正电荷，有利于复合材料快速地静电吸附表面带负电荷的微生物，形成生物聚合体。利用氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料带有磁性的特性，通过磁场作用将氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌的生物聚合体吸附到基体表面，形成一定厚度、稳定且可控的电活性生物膜。与传统生物膜相比，本发明提供的方法不仅快速、简便、稳定、可控，同时形成的生物膜能够产生更高的电流，在生物电化学系统及生物传感器的应用中具有一定的发展前景。
得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯后，本发明将所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌混合，得到的生物聚合体在磁场作用下吸附在基体上，得到电活性生物膜。
在本发明中，所述电活性菌优选选自硫还原地杆菌g.sulfurreducens。所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯的质量和电活性菌的体积比优选为(4～8)mg:1ml。在本发明具体实施例中，所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯的质量和电活性菌的体积比为30mg：5ml。
在本发明中，所述基体优选选自氧化铟锡(ito)玻璃；所述基体的规格优选为(3～6)cm×(3～6)cm。在本发明具体实施例中，所述氧化铟锡(ito)玻璃的规格为5×5cm2。
在本发明中，所述磁场作用优选通过磁铁实现。本发明通过控制磁铁的位置来控制生物膜的形成。在本发明具体实施例中，优选将磁铁置于反应装置的底部，产生磁场，带磁性的生物聚合体会通过磁力作用更快吸附至ito玻璃上。
在本发明具体实施例中，所述电活性生物膜的成膜方法具体包括：
步骤一、取得氧化石墨烯材料，加入二价铁盐后超声，再加入含氮导电聚合物，再超声，加热，然后再冷冻干燥，将得到的固体通氮气再加热，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯；
步骤二、将氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯与电活性菌混合形成生物聚合体，加入到以ito玻璃为工作电极的生物电化学系统中，在靠近ito玻璃电极的一端放置磁铁，通过磁力吸附作用，在电极上得到电活性生物膜。
本发明提供了一种微生物电化学系统，包括工作电极、辅助电极和参比电极；所述工作电极表面附有上述技术方案所述成膜方法制备的电活性生物膜。
在本发明中，所述辅助电极优选为钛丝；所述参比电极为ag/agcl。所述工作电极表面附有上述技术方案所述成膜方法制备的电活性生物膜。
具体的，氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯在微生物电化学系统中的应用过程包括：
将氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌混合形成生物聚合体，应用于以表面积为5cm2锡掺杂in2o3的ito玻璃为工作电极，钛丝为辅助电极，ag/agcl为参比电极，容器体积为40ml构建的三电极微生物电化学系统中，加入生物聚合体，并加入乙酸钠浓度为10mmol/l的基底营养液(所述基底营养液成分组成为：nh4cl(0.25g·l-1)、kcl(0.1g·l-1)、nah2po4·h2o(0.6g·l-1)、nahco3(2.5g·l-1)、维生素溶液(10ml·l-1)和矿物质溶液(10ml·l-1))，置于30℃恒温培养箱中培养，并连接至电化学工作站(上海辰华，chi1000c)，初始电位为0.2v(vs.ag/agcl)，记录微生物在电极上产生电流随时间的变化曲线。在装置运行时，通过在装置底部放置磁铁，使ito工作电极上置于带磁场区域中，此时代表磁场开关为“开”的状态，带磁性的生物聚合体会通过磁力作用更快吸附至ito玻璃上。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种电活性生物膜的成膜方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1四氧化三铁-还原氧化石墨烯和氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯磁性复合材料的制备
取20mg醋酸亚铁，加入6ml利用hummers法制得浓度为1.5mg/l的氧化石墨烯，超声分散10分钟；然后将20mg聚吡咯缓慢加入到已经分散均匀的溶液中，继续超声10分钟，将超声后形成的稳定悬浊液放入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中并封装好，加热至于180℃，恒温12个小时，再将固体样品冷冻干燥处理24小时，得到的黑色固体在氮气氛围中600℃下加热处理3小时，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯(n-fe3o4/rgo)；同时，本发明还制备了无添加聚吡咯且其他条件不变情况下的四氧化三铁-还原氧化石墨烯(fe3o4/rgo)，制得两种材料的sem结果分别如图1和图2所示，图1为本发明实施例1中制备的四氧化三铁-还原氧化石墨烯的扫描电镜图；图2为本发明实施例1中制备的氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料的扫描电镜图。
实施例2四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料和氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料在三电极体系磁性微生物电化学系统的应用效果
取30mg实例1中所述制得的四氧化三铁-还原氧化石墨烯与5ml的地杆菌菌液混合形成生物聚合体，应用于以表面积为5cm2锡掺杂in2o3的ito玻璃为工作电极，钛丝为辅助电极，ag/agcl为参比电极，容器体积为40ml构建的三电极微生物电化学系统中，加入5ml上述制备的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和地杆菌混合形成的生物聚合体溶液，并加入乙酸钠浓度为10mm的基底营养液，置于30℃恒温培养箱中培养，并连接至电化学工作站(上海辰华，chi1000c)，初始电位为0.2v(vs.ag/agcl)，记录微生物在电极上产生电流随时间的变化曲线，电流值越大，则产电效果越好。所述基底营养液成分组成为：nh4cl(0.25g·l-1)、kcl(0.1g·l-1)、nah2po4·h2o(0.6g·l-1)、nahco3(2.5g·l-1)、维生素溶液(10ml·l-1)和矿物质溶液(10ml·l-1)。在装置运行时，通过在装置底部放置磁铁，使ito工作电极上置于带磁场区域中，此时代表磁场开关为“开”的状态，带磁性的生物聚合体会通过磁力作用更快吸附至ito玻璃上；同时，与无添加四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料的情况进行对比，以上所得到的时间和电流密度响应曲线如图3所示，图3为本发明实施例2中四氧化三铁-还原氧化石墨复合材料在磁场下形成生物膜过程的时间和电流密度响应图，由图3可知：当磁场为“开”时，带磁性的生物聚合体在磁场作用下聚集到电极表面，使电流迅速升高达稳定状态，但电流稳定时，添加四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料得到的电流密度和无加入磁性材料的电流密度相同，添加四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料只能加快生物膜的在电极表面生长，而无法提高电极的产电效果。
取30mg实施例1中所述制得氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯与5ml的地杆菌菌液混合形成三种生物聚合体，按照上述四氧化三铁-还原氧化石墨烯在三电极体系磁性微生物电化学系统的应用的方法，在相同条件下记录微生物在电极上产生电流的变化曲线，得到的时间和电流密度响应曲线如图4所示，图4为本发明实施例2中氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨复合材料在磁场下形成生物膜过程的时间和电流密度响应图；由图4可知：当磁场为“开”时，带磁性的生物聚合体在磁场作用下聚集到电极表面，电流迅速升高，且电流密度还随培养时间不断升高，约40小时后达到稳定，稳定时电流达到0.21～0.23ma/cm2。
图3和图4对比可知：电流达到稳定时，氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料应用于三电极体系磁性微生物电化学系统相比四氧化三铁-还原氧化石墨烯材料具有更高的电流密度。
实施例3
根据实施例2中的方法，通过在电活性菌液中分别添加还原氧化石墨烯、四氧化三铁-还原氧化石墨烯和氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料形成生物聚合体，并利用实施例2中构建的微生物电化学系统，将ito玻璃置于磁场中，在恒温30℃下培养形成稳定的电活性生物膜；取ito上生物膜，经2％的戊二醛固定3小时，去离子水清洗，依次用30％、50％、70％、90％和100％的乙醇溶液分别脱水10分钟，再将样品冷冻干燥处理24小时，通过sem观察不同磁性复合材料在磁场条件下对微生物的生长情况和吸附效果，结果如图5、图6和图7所示；图5为还原氧化石墨烯在磁场下工作电极ito玻璃上形成生物膜的sem图；图6为实施例2制备的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料在磁场下工作电极ito玻璃上形成生物膜的sem图；图7为实施例2制备的氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯复合材料在磁场下工作电极ito玻璃上形成生物膜的sem图；从图5可知：无加入磁性材料的电极表面只有少量的微生物；图6和图7可知：加入四氧化三铁磁性材料的电极材料表面附着大量的微生物。
通过对比图5、图6和图7可知：磁性材料四氧化三铁和氮掺杂的四氧化三铁能使电极表面聚集更多的微生物，从而提高产电效果。
实施例4
取15mg氯化亚铁，加入5ml利用hummers法制得浓度为1.5mg/l的氧化石墨烯，超声分散10分钟；然后将20mg聚苯胺缓慢加入到已经分散均匀的溶液中，继续超声10分钟，将超声后形成的稳定悬浊液放入聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中并封装好，加热至于180℃，恒温12个小时，再将固体样品冷冻干燥处理24小时，得到的黑色固体在氮气氛围中600℃下加热处理3小时，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯；取30mg制得的四氧化三铁-还原氧化石墨烯与5ml的希瓦氏菌菌液混合形成生物聚合体，根据实施例2中的方法，应用于生物电化学系统中，并记录微生物在电极上产生电流随时间的变化曲线。结果表明，当磁场为“开”时，电流迅速升高，稳定时电流密度可达到0.22ma/cm2。
由以上实施例可知，本发明提供了一种电活性生物膜的成膜方法，包括以下步骤：将氧化石墨烯溶液、二价铁盐和含氮导电聚合物超声混合，加热，干燥，得到固体产物；将所述固体产物在无氧气氛下再次加热，得到氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯；将所述氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯和电活性菌混合，得到的生物聚合体在磁场作用下吸附在基体上，得到电活性生物膜。该方法通过磁场作用将氮掺杂的四氧化三铁-还原氧化石墨烯/电活性菌的生物聚合体快速吸附到基体上，得到电活性生物膜。该方法能够快速形成电活性生物膜，且其具有较好的产电性能。该过程方便简捷，无需贵重设备，是一种快速、高效、廉价、环保、简便、稳定、可控的电活性生物膜快速成膜方法。实验结果表明：电活性生物膜的电流密度达到0.20～0.23ma/cm2。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。