基于极性反转纳喷雾离子源的蛋白质高电荷离子产生方法与流程

本发明涉及一种蛋白质高电荷离子产生方法，尤其涉及一种基于极性反转纳喷雾离子源的蛋白质高电荷离子产生方法。

背景技术：

蛋白质等生物大分子经电喷雾之后会形成带有多个电荷的离子。根据电喷雾发生条件的不同，分子所带的电荷数也会有所不同。当分子所带的电荷数较少时，被称为低电荷离子；而当分子所带电荷数较多时，被成为高电荷离子。高电荷离子的形成为蛋白质等生物大分子的检测带来了诸多便利：

1.高电荷离子的形成极大地拓展了质谱所能检测到的蛋白质分子量范围。这是由于质谱检测器所检测的是离子的质荷比(m/z)，蛋白质分子带上较多电荷之后，它的m/z会显著下降，从而使蛋白质分子的m/z落入普通质谱所能检测的质荷比范围内。目前，除飞行时间质谱(timeofflightmassspectrometry，tof-ms)外，绝大部分商用质谱所能检测的质荷比范围为50～3000左右。而蛋白质分子的分子量通常为几十kda，甚至几百kda。当蛋白质分子带上较多电荷之后，绝大部分常见蛋白质的m/z均落在1000～3000范围内，可轻易地被质谱检测到。

2.高电荷蛋白质离子在进行质谱检测时能够获得更高的灵敏度和分辨率。质谱的灵敏度和分辨率随着m/z的提高而显著下降，在m/z的低质量端进行检测时，会得到明显更好的检测效果。对于一些对离子所带电荷较为敏感的质谱质量分析器，如轨道阱质量分析器(orbitrap)和傅里叶变化离子回旋共振质量分析器(fouriertransformioncyclotronresonance，fticr)，这一现象更为明显。

3.高电荷蛋白质离子不容易形成金属离子加合物。蛋白质分子很容易与溶液中的微量金属阳离子形成金属离子加合物，从而使得谱峰展宽，灵敏度下降，严重影响谱峰的辨认。相比之下，蛋白质的高电荷离子较低电荷离子更不易形成金属离子加合物，对蛋白质的检测更为有利。

4.高电荷蛋白质离子在进行多级碎裂的时候，碎裂效率更高，碎片离子更多，对蛋白质分子的结构鉴定更为有利。在进行电子捕获碎裂(electroncapturedissociation，ecd)和电子转移碎裂(electrontransferdissociation，etd)时，这一现象更为明显。

目前，人们已经发展出了多种产生蛋白质高电荷离子的方法。最为常见的就是向溶液中添加酸、碱等变性试剂，通过改变溶液的ph，使蛋白质分子变性，结构破坏，从而产生高电荷离子。向溶液中添加有机溶剂可以作为辅助手段，进一步破坏蛋白质分子的结构，提高蛋白质高电荷离子的产生效率。酸和碱等试剂除了可以直接向溶液中添加之外，还可以在气相中进行添加。将酸和碱添加进电喷雾离子源的干燥气中，在电喷雾的去溶剂过程中，酸和碱的蒸汽与电喷雾形成的带电液滴相互作用，最终导致液滴ph值的变化，造成蛋白质分子结构的破坏，从而产生高电荷蛋白质离子。由于大部分常用酸、碱和有机溶剂都具有较强的挥发性和毒性，因此，它们的使用不可避免会带来一些人身安全的顾虑和操作上的不便，需要在有通风橱和相关防护措施的条件下进行使用。

近年来，人们又陆续发现了一些酸、碱以外的高电荷试剂，它们本身为有机溶剂，如m-nba、环丁砜、二甲亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)等。向溶液中添加一定比例的这些有机溶剂，一般为1％～15％(v/v)，在样品离子化时便能产生蛋白质的高电荷离子。这些有机溶剂的使用也会带来一定的安全隐患。

此外，人们还提出了一种电热高电荷离子产生方法。该方法需向溶液中添加约100mm的碳酸氢铵(nh4hco3)。当使用较低电压进行电喷雾时，会产生低电荷蛋白质离子，而当使用较高电压进行电喷雾时，便会产生高电荷蛋白质离子。这一方法避免了诸多挥发性有毒有机试剂的使用。但高浓度nh4hco3的使用，会对目标蛋白质的信号产生较大影响，显著降低检测灵敏度。

技术实现要素：

针对上述现有技术中的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种方便、实用，且低毒低害的基于极性反转纳喷雾离子源的蛋白质高电荷离子产生方法以及其操作方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于极性反转纳喷雾离子源的蛋白质高电荷离子产生方法，包括如下步骤：

s1，向样品溶液中添加1～10mm高电荷试剂；

s2，从纳喷雾喷针的尾端注入样品溶液；

s3，将金属电极从纳喷雾喷针尾端插入到纳喷雾喷针内，直至金属电极与样品溶液接触到；

s4，用绝缘端盖封住纳喷雾喷针的尾端并连通高压电源和金属电极；

s5，打开高压电源先对金属电极输出-2.5kv～-5.0kv电压，持续输出3s～12s；然后对金属电极输出+1.5kv～+2.0kv电压，用于产生纳喷雾。

优选地，在步骤s5中，在打开高压电源后，先对金属电极输出-2.5kv～-5.0kv电压，持续输出3s～12s；然后对金属电极输出+1.5kv～+2.0kv电压。

优选地，所述1～10mm高电荷试剂为强酸盐或中强酸盐。

优选地，所述强酸盐为溴化物、氯化物、碘化物或硝酸盐，所述中强酸盐为磷酸盐。

与现有技术相比，本发明实施例至少具有以下优点：

本发明首先向样品溶液中添加特定浓度的高电荷试剂，然后使用反相负高压对样品溶液进行预处理，之后使用正相高压产生纳喷雾。相比于基于普通纳喷雾(nano-esi)的蛋白质高电荷离子产生方法而言，本发明更具实用性，使用起来更为方便，具体如下：

首先，本发明使用普通无机盐或有机盐(如氯化钠(nacl)，氯化钾(kcl)等)作为高电荷试剂，这些试剂极为常见和易得，且毒性极低，甚至无毒，使用起来更为方便。基于普通纳喷雾的方法一般使用强酸、强碱等试剂，或间硝基苄醇(m-nitrobenzylalcohol，m-nba)、环丁砜等特殊有机试剂作为高电荷试剂，这些试剂在普通实验室并不常见，且毒性较大，挥发性强，操作起来需要通风橱等特殊设施，对人体危害较大。

其次，本发明所需高电荷试剂的浓度低。盐在溶液中的浓度为1～10mm(10^-3mol/l)级别。而基于普通纳喷雾的方法所需高电荷试剂的浓度则明显更高。如使用间硝基苄醇或环丁砜时，所需两种试剂的浓度为1％～5％(v/v)，几乎达到了它们的溶解度极限。

再次，本发明对生物样品具有更好的适应性。很多生物样品在前处理过程中会溶解在磷酸盐和氯盐缓冲液中。这些盐的存在会对普通纳喷雾的信号产生极大的影响。因此，基于普通纳喷雾的方法在检测前需要进行除盐步骤。这些额外的操作会带来样品损失和污染。而本发明建立在极性反转纳喷雾离子源上，对盐溶液具有极强的耐受性。此外，生物样品中常用的缓冲盐正好是本发明中可用的高电荷试剂。因此，本发明可以直接对生物样品进行分析。

附图说明

图1a为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂，对细胞色素c(cytc，来源于马心脏，购自sigmaaldrich)的离子化效果检测结果示意图；

图1b为使用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂，对细胞色素c得到的检测结果示意图；

图1c为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂对肌红蛋白(mb，来源于马心脏，购自sigmaaldrich)的检测结果示意图；

图1d是用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂的检测结果示意图；

图1e为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂对钙调素(cam，来源于牛心脏，购自sigmaaldrich)的检测结果示意图；

图1f是用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂的检测结果示意图；

图1g为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂对溶菌酶(lys，来源于鸡蛋蛋白，购自sigmaaldrich)的检测结果示意图；

图1h是用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂的检测结果示意图；

图2a为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnh4cl作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图2b为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmkcl作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图3为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmlicl作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图4a为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnah2po4作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图4b为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmna2hpo4作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图4c为用极性反转纳喷雾的方法，以2mmnai作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图4d为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnano3作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图5a为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnahco3作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图5b为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnh4hco3作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图5c为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnahs作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图5d为用极性反转纳喷雾的方法，以5mm(nh4)2s作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图5e为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnaac作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图5f为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnh4ac作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图6为用极性反转纳喷雾的方法，以5mm(nh4)2co3作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图7为用极性反转纳喷雾的方法，以5mm甲酸铵(hcoonh4)作为添加试剂对细胞色素c的检测结果示意图；

图8a为碱性蛋白质分子的高电荷离子形成过程中的负高压步骤示意图；

图8b为碱性蛋白质分子的高电荷离子形成过程中的正高压步骤示意图；

图9a为酸性蛋白质分子的高电荷离子形成过程中的负高压步骤示意图；

图9b为酸性蛋白质分子的高电荷离子形成过程中的正高压步骤示意图；

图10a为kcl所得谱图；

图10b为nh4cl所得谱图；

图10c为nah2po4所得谱图；

图10d为na2hpo4所得谱图；

图10e为nai所得谱图；

图10f为lii所得谱图；

图11为本发明基于极性反转纳喷雾离子源的蛋白质高电荷离子产生方法的离子源的结构示意图；

图12a为图8a中纳喷雾喷针及其内部样品溶液及各种离子的走向/分布示意图；

图12b为图8b中纳喷雾喷针及其内部样品溶液及各种离子的走向/分布示意图；

图13a为图9a中纳喷雾喷针及其内部样品溶液及各种离子的走向/分布示意图；

图13b为图9b中纳喷雾喷针及其内部样品溶液及各种离子的走向/分布示意图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例验证基于极性反转电压策略的纳喷雾离子源的检测效果。

一种基于极性反转电压策略的纳喷雾离子源，包括

纳喷雾喷针，用于装载样品溶液；纳喷雾喷针的材质不限，一般为玻璃或石英；尖端内径与普通纳喷雾所需内径一致，为1～10μm。nano-tip尾端的尺寸不限。

金属电极，插入到纳喷雾喷针内，与样品溶液直接接触；电极材质不限，但应具有化学惰性，不易与样品溶液发生化学反应导致腐蚀和溶解。一般为铂丝。

绝缘端盖，封堵在纳喷雾喷针的尾端，防止漏电；

高压电源，具有正反双向输出功能，与金属电极连接，连接金属电极的电线穿过绝缘端盖。

所述高压电源的正向输出电压范围为0～+3kv，反向输出电压范围为0～-5kv。

蛋白质高电荷离子产生方法：

先在样品溶液中添加1～10mm高电荷试剂，即盐。盐的种类有一定的要求，需要是强酸的盐，如氯化物、溴化物、碘化物和硝酸盐等，或中强酸的盐，如磷酸盐。弱酸的盐是无法成为高电荷试剂的，如硫化物、碳酸盐、甲酸盐和醋酸盐。盐的阳离子的种类对高电荷试剂的效果没有显著影响。li⁺、na⁺、k⁺和nh4⁺等的盐均可作为高电荷试剂。

然后执行极性反转纳喷雾方法以进行蛋白质样品的检测。此时获得的质谱图即为蛋白质带有高电荷的谱图。

(1)nacl用于不同蛋白质高电荷离子的产生

本发明所建立的高电荷离子产生方法对所有蛋白质样品具有普适性。这里，我们选取了4种最为常见的蛋白质样品作为待测对象进行方法可行性验证。以最为常见的盐，即nacl作为高电荷试剂，用我们的方法对这些蛋白质进行了检测，并与普通纳喷雾的检测结果进行了对比。

图1a为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂，对细胞色素c(cytc，来源于马心脏，购自sigmaaldrich)的离子化效果。从图中可以看到两个峰簇，即低电荷峰簇和高电荷峰簇。其中，低电荷峰簇以带有9个电荷的谱峰9+峰为主峰，具有明显较高的信号强度。而高电荷峰簇以带有17个电荷的谱峰17+峰为主峰，具有明显较低的信号强度。加权平均电荷数qav用于计算目标蛋白质分子所带的平均电荷数，可以用于不同方法之间的比较。qav的定义如公式1所示。其中，qi是第i个谱峰所对应的电荷数，wi是第i个谱峰的信号强度，n是谱峰的总数。在上述纳喷雾的检测条件下，细胞色素c的平均电荷数qav＝10.6+。

图1b为使用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂，对细胞色素c得到的检测结果。与普通纳喷雾的检测结果显著不同的是，在本发明要求保护的方法结果中，只有高电荷峰簇，没有低电荷峰簇，并且高电荷峰簇的主峰为18+峰。从谱峰的种类和信号强度来看，使用极性反转纳喷雾的方法所产生的细胞色素c离子的整体带电数要明显高于普通纳喷雾的方法。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.7+，比普通纳喷雾的结果有了一个显著的提升。

图1c为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂对肌红蛋白(mb，来源于马心脏，购自sigmaaldrich)的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以18+峰为主峰。钙调素的平均电荷数qav＝18.5+。图1d是用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以23+峰为主峰。肌红蛋白的平均电荷数有了显著的提高，qav＝21.8+。

图1e为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂对钙调素(cam，来源于牛心脏，购自sigmaaldrich)的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以18+峰为主峰。肌红蛋白的平均电荷数qav＝18.6+。图1f是用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以20+峰为主峰。钙调素的平均电荷数有了显著的提高，qav＝20.2+。

图1g为使用普通纳喷雾，以1％(v/v)乙酸(hac)为高电荷试剂对溶菌酶(lys，来源于鸡蛋蛋白，购自sigmaaldrich)的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以10+峰为主峰。溶菌酶的平均电荷数qav＝9.8+。图1h是用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnacl作为高电荷试剂的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以11+峰为主峰。溶菌酶的平均电荷数有了显著的提高，qav＝11.2+。

从上述结果可以看出，以nacl作为高电荷试剂，我们的方法能够获得不同种类蛋白质的高电荷离子，并且蛋白质离子所带平均电荷数显著高于普通纳喷雾方法。

(2)以其它氯盐用于细胞色素c高电荷离子的产生

如前所述，本发明所建立的极性反转纳喷雾方法对盐的种类有一定的要求，需要强酸或中强酸的盐，而盐的阳离子则对检测效果的影响不大。此处，在nacl的基础上，通过改变阳离子的种类，分别对k⁺、nh4⁺和li⁺进行考察，用于细胞色素c高电荷离子的产生。

图2a为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnh4c1作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以18+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.6+。

图2b为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmkcl作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以17+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.2+。

图3为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmlicl作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以17+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.2+。

从上述结果可以看出，以不同的氯盐作为高电荷试剂，使用极性反转纳喷雾的方法均可以产生细胞色素c高电荷离子的实际效果。加上之前考察过的nacl，我们所考察的氯盐包括：licl、nacl、kcl以及nh4cl，这些氯盐均能产生细胞色素c高电荷离子，并且效果差异不大。由此可见，盐的阳离子的改变，对高电荷离子的产生效果影响不大。

(3)其它强酸或中强酸钠盐用于细胞色素c高电荷离子的产生

强酸或中强酸的盐均能用于产生蛋白质的高电荷离子。此处，在nacl的基础上，改变阴离子，分别对i^-、no3^-、h2po4^-和hpo4^2-进行了考察。

图4a为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnah2po4作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以17+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.9+。

图4b为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmna2hpo4作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以17+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝16.7+。

图4c为用极性反转纳喷雾的方法，以2mmnai作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以18+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝17.2+。

图4d为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnano3作为高电荷试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见一个高电荷峰簇，以18+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝15.3+。

从上述结果可以看出，以不同的强酸或中强酸的钠盐作为高电荷试剂，使用极性反转纳喷雾的方法均可以产生细胞色素c高电荷离子的实际效果。加上之前考察过的nacl，我们所考察的钠盐包括：nacl、nai、nano3、nah2po4和na2hpo4，这些钠盐盐均能产生细胞色素c高电荷离子，并且差异性不大。由此可见，当盐的阴离子为强酸或中强酸的酸根时，均能产生细胞色素c的高电荷离子。

(4)不能产生细胞色素c高电荷离子的盐

弱酸的盐无法产生蛋白质的高电荷离子。此处，以硫化物、碳酸盐、醋酸盐和甲酸盐作为考察对象，对此进行了验证。

图5a为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnahco3作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以9+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝9.6+。

图5b为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnh4hco3作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以10+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝10.1+。

图5c为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnahs作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以9+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝9.0+。

图5d为用极性反转纳喷雾的方法，以5mm(nh4)2s作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以8+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝8.0+。

图5e为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnaac作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以8+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝8.0+。

图5f为用极性反转纳喷雾的方法，以5mmnh4ac作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以8+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝7.8+。

图6为用极性反转纳喷雾的方法，以5mm(nh4)2co3作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以9+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝9.6+。

图7为用极性反转纳喷雾的方法，以5mm甲酸铵(hcoonh4)作为添加试剂对细胞色素c的检测结果。从图中可见，无高电荷峰簇产生，只有一个低电荷峰簇，以8+峰为主峰。细胞色素c的平均电荷数qav＝8.0+。

从上述结果可以看出，当使用弱酸的盐作为添加剂时，无法产生细胞色素c的高电荷离子。所考察的弱酸盐包括三种碳酸盐(nahco3、nh4hco3和(nh4)2co3)、两种硫化物(nahs和(nh4)2s)、两种醋酸盐(naac和nh4ac)，以及一种甲酸盐(hcoonh4)，这些弱酸盐均无法产生细胞色素c的高电荷离子。由此可见，当盐的阴离子为弱酸的酸根时，无法产生细胞色素c的高电荷离子。

(5)机理探讨

本发明利用了盐的阴离子与蛋白质分子的相互作用，通过溶液中阴离子与蛋白质分子表面的官能团相互作用，从而改变蛋白质分子的结构，造成蛋白质分子结构的破坏，使得原本包裹在蛋白质分子内部的官能团得以释放出来。由此一来，蛋白质分子便能带上更多电荷，形成高电荷离子。

碱性蛋白质分子在中性溶液中带有正电荷，而酸性蛋白质分子在溶液中带有负电荷。它们形成高电荷离子的机理略有差别。

首先讨论碱性蛋白质分子的高电荷离子形成过程。极性反转纳喷雾方法的整个过程分为两步，即负高压步骤和正高压步骤，如图8所示。首先使用负高压作用于样品溶液(图8a及图12a)，溶液中带有正电荷的金属阳离子和碱性蛋白质分子均向远离喷针尖端的方向移动。由于金属离子具有明显较小的碰撞体积，因此，它们所迁移出的距离较大，而蛋白质分子具有较大的碰撞体积，它们只能迁移非常有限的一段距离。金属离子和蛋白质分子由此便被分离开。带有负电荷的阴离子则向着喷针尖端的方向移动，并在针尖区域聚集，浓度不断增大。由于电喷雾的持续进行，所以样品溶液保持着向针尖方向的移动。当电压转变为正高压后，溶液中各组分的迁移方向开始反转(图8b及图12b)。金属阳离子和蛋白质正离子向着针尖的方向移动，而阴离子则从针尖向着电极的方向移动。由于蛋白质分子距离喷针尖距离较近，于是它们率先与阴离子相遇，并产生强烈的相互作用，最终导致蛋白质分子的结构发生改变。由于电喷雾的持续发生，溶液依然向着喷针尖端的方向移动，并携带着结构改变的蛋白质分子到达喷针尖端形成电喷雾，产生蛋白质的高电荷离子。由于不论是在负高压下还是在正高压下，溶液均向着喷针尖端的方向进行单向移动，因此当电压切换为正高压后，金属离子来不及追上蛋白质分子，蛋白质分子便已经形成电喷雾，所以最后得到的检测信号为蛋白质分子的质子化离子峰，没有金属离子加合物的谱峰出现。

对于酸性蛋白质而言，高电荷离子的形成过程略有不同，如图9所示。当时用负高压作用于样品溶液的时候，溶液中带有正电荷的金属阳离子向着远离喷针尖端的方向移动(图9a及图13a)。带有负电荷的蛋白质分子和阴离子向着喷针尖端的方向移动。蛋白质分子和阴离子在喷针尖端聚集并相互作用，最终导致蛋白质分子结构的破坏。当高压电转变成正高压时，聚集在喷针尖端的蛋白质分子在溶液的携带下直接形成电喷雾，产生高电荷离子(图9b及图13b)。由于金属阳离子还需要一段时间迁移到喷针尖端来，因此不会与蛋白质分子形成金属离子加何物。

在形成高电荷离子的过程中，蛋白质分子与盐的阴离子的相互作用是关键所在。从所得质谱图的放大图中可以看到蛋白质分子与阴离子的加合物谱峰(图10)。这些加合物谱峰的出现进一步验证了蛋白质分子与阴离子之间强烈的相互作用。分别以氯盐、磷酸盐和碘盐作为高电荷试剂，对细胞色素c进行检测，并对检测结果进行了考察。在kcl所得的谱图中，可以看到明显的带有一个cl的加合物谱峰(图10a)。在nh4cl所得的谱图中，也可以看到明显的带有一个cl的加合物谱峰(图10b)。磷酸盐的检测结果也是类似的。在nah2po4所得的谱图中，可以看到明显的带有一个、两个和三个h2po4^-的加合物谱峰(图10c)。在na2hpo4所得的谱图中，也可以看到明显的带有一个、两个和三个h2po4^-的加合物谱峰(图10d)。碘盐的结果也是类似的。在nai所得的谱图中，可以看到明显的带有一个、两个和三个i^-的加合物谱峰(图10e)。在lii所得的谱图中，也可以看到明显的带有一个、两个和三个i的加合物谱峰(图10f)。