超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素d的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及维生素 D检测的技术领域，特别设及一种超高效液相色谱串联质谱检 测血清25径基维生素 D的方法。
【背景技术】
[0002] 维生素 D为脂溶性非必需维生素，是固醇类衍生物，25径基维生素 D是维生素 D在肝 微粒体25径化酶的作用下转化形成，由于其与维生素 D的其他代谢产物相比，在血液中的浓 度高且循环周期长，而成为维生素 D体内浓度的良好指示剂，是人体维生素 D营养状况的评 价指标。
[0003] 维生素 D家族成员中最重要的是维生素化和维生素化。维生素化多含于植物性食物 中，它是植物的麦角固醇经阳光照射而合成。维生素化占人体总量90%-95 %，主要是由皮 肤内的7-脱氨胆固醇在特定波长的紫外线照射作用下合成，也可通过食物摄取获得。维生 素 D具有调节人体血清巧憐代谢，维持骨骼和肌肉的正常生理作用。随着对于维生素 D的深 入研究发现，人群中维生素 D缺乏普遍存在，且维生素 D缺乏与各类疾病的发生和发展密切 相关，比如肥胖、高血压、糖尿病、屯、梗等屯、血管疾病和代谢综合征疾病。因此维生素 D缺乏 与各类疾病的相互关系引起国内外研究机构的广泛关注。
[0004] 传统的25径基维生素 D检测方法有放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光法、电 化学发光法和高效液相色谱法等。但主要存在如下问题:第一，由于25径基维生素 D在人体 内主要与血清结合蛋白结合，人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存在严重的 基质干扰。而传统的放射免疫法和发光法，不能有效去除基质干扰;第二，现有检测技术前 处理过程复杂、方法特异性差;第=，免疫法有时存在交叉反应，出现假阳性结果，同时发光 法存在发光效率低等问题。因此免疫法和发光法不能同时准确定量25径基维生素化和25径 基维生素化的含量，无法给出准确的25径基维生素 D的总含量;第四，上述传统方法整个检 测过程时间长、通量低。
[000引因此，需要分析领域技术人员迫切解决的一个问题就是：如何提供一种适合用于 人体血清的25径基维生素 D的检测方法。相比传统免疫法和液相色谱法，液相色谱串联质谱 法(LC-MS/MS)能够解决上述问题，目前国际普遍认为LC-MS/MS是检测血清中25径基维生素 D的"金标准"。然而该"金标准"处理过程复杂，灵敏度和精密度有待进一步提高。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在解决现有技术的不足，提供一种适用于人体血清的25径基维生素 D的 检测方法，能够有效去除基质干扰，快速检测。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[000引超高效液相色谱串联质谱检测血清25径基维生素 D的方法包括如下步骤：
[0009] (1)向血清样品中加入体积为血清样品体积1/15至2/15的25径基维生素 D的内标 物，加入硫酸锋溶液和甲醇溶液进行蛋白质沉淀;充分混匀后加入正己烧溶剂萃取;再充分 混匀后离屯、，得到上清液和沉淀，移取上清液后用氮气吹干沉淀，再加入复溶液，得到待测 样品；所述25径基维生素 D内标物包含6d-25H基维生素化和/或6d-25H基维生素 D3;所述复 溶液为甲醇和水按7: (2-4)，优选7:3的体积比混合的混合液；
[0010] 其中，所述血清样品、硫酸锋溶液、甲醇溶液、正己烧溶剂的体积比为1 :(0.8- 1.2) : (1.8-2.2): (4-6)，优选1:1: 2 : 5 ;所述复溶液与血清样品的体积比为1: (1.8- 2.2) ，优选 1:2;
[0011] (2)对待测样品用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测。
[0012] 优选地，步骤(2)所述质谱采用正离子模式，并采用多反应监测离子扫描MRM的扫 描方式；
[0013] 所述正离子模式中，内标定量离子对包括6(1-25径基维生素化定量离子对和6d-25 径基维生素化定量离子对；目标定量离子对包括25径基维生素化定量离子对和25径基维生 素化定量离子对；目标定性离子对包括25径基维生素化定性离子对和25径基维生素化定性 离子对；
[0014] 内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为：
[0015] 64-25?基维生素化定量离子对的母离子的质荷比为419.3,对应的子离子的质荷 比为83.1;
[0016] 64-25?基维生素化定量离子对的母离子的质荷比为407.3,对应的子离子的质荷 比为159.1;
[0017] 目标定量离子和目标定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为：
[0018] 25径基维生素化的母离子的质荷比为413.35,对应的定量离子的质荷比为395.3， 定性离子的质荷比为83.1;
[0019] 25径基维生素化的母离子的质荷比为401.35，对应的定量离子的质荷比为383.3， 定性离子的质荷比为159.1;
[0020] 所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件为：
[00引]色谱柱:AC卵口Y UPLC 邸H C18 Column(2.1 X 50臟，1.7皿）；
[0022] 色谱柱柱溫:45。0;
[0023] 进样量:20ul;
[0024] 流速:〇.4ml/min;
[0025] 流动相：流动相A为含2mM乙酸锭和0.1 %甲酸的水，流动相B为含2mM乙酸锭和 0.1%甲酸的甲醇；
[0026] 6(1-25?基维生素 D3和25径基维生素 D3的保留时间为3.09min，6d-25^基维生素化 和25径基维生素化的保留时间为3.16min;
[0027] (3) W化径基维生素化和25径基维生素化的保留时间为定性依据，判断25径基维生 素化和化径基维生素化的存在；
[0028] 依据25径基维生素化和25径基维生素化与对应内标物在内标标准曲线上的峰面积 比值，计算血清样品中的25径基维生素化和化径基维生素化的含量。
[0029] 另外，所述反应监测离子扫描MRM的锥孔电压、驻留时间、碰撞能量条件如下：
[0030] 物质 离子对 锥化电化(V) 驻留时间巧）碰撞能量（V) 250HD： 413.35>3953* 24 0.05 10 250HD: 413,35>83.1 .24 0.05 22 250HD] 401.一巧 >383.3* 24： 0.05 10 250HD; 401.35> 159.1 24 0.05 28 C16-250HD2 419,35>83.1 24 0.05 2玄 C16-250HD3 407.35> 159.1 24. 0.05 28
[0031] 其中，*代表定量离子对
[0032] 所述梯度洗脱的条件如下： 时间（单位min) A流动相比例（％) B流动相比例（％) 0.00 11 巧 2胤） 巧 巧
[0033] 3.50 2 魄 3.51 27 73 6.00 27 73
[0034] 所述质谱中质谱离子源参数如下：
[003引电离源：电喷雾电离ESI源；
[0036] 脱溶剂气溫度:400°C;
[0037] 脱溶剂气流速:900L/化；
[003引离子源溫度：120°C;
[0039] 毛细管电压:2500V。
[0040] 优选地，步骤（1)中所述离屯、的条件为：在室溫下，W 13000r/min的速度离屯、5-lOmin。步骤(1)所述用氮气吹干沉淀是通入45-55°C的氮气直至沉淀干燥。
[0041] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0042] 本发明应用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，本发明可W同时定性或定量检 测出人血清中的25径基维生素化和化径基维生素化；
[0043] 本发明通过硫酸锋溶液联合甲醇溶液进行蛋白质沉淀，通过正己烧液液萃取，氮 气吹干复溶后便可W用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；
[0044] 本发明前处理简单，并且可W有效去除基质干扰，特异性、抗基质干扰能力强；
[0045] 本发明应用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，检测时间短，通量高，检测灵敏 度、精密度高，成本低廉。
[0046] 总之，本发明采用蛋白质沉淀和液液萃取法得到25径基维生素 D提取液，利用超高 效液相色谱串联质谱仪进行检测，同位素稀释法定量。满足前处理简单，能有效去除基质干 扰，同时准确定量检测25径基维生素化和25径基维生素化，并且整个检测过程时间短，通量 高。相比目前已报道的LC-MS/MS法检测25径基维生素 D的文献，本发明前处理更简单，不需 要进行固相萃取净化操作或者在线固