相萃取仪等贵重仪器，灵敏度和精密度更高，满足临 床检测要求。另外，相比常规的液相色谱柱，超高效色谱柱的填料颗粒更细，同时耐压能力 更强，检测灵敏度更高，可W快速检测，缩短分析时间，因此本发明在采用LC-MS/MS方法的 前提下，优化前处理过程和仪器设置参数，同时优化了LC-MS/MS方法中的流动相和梯度条 件，进而改善了色谱峰的峰形和响应值，使得25径基维生素 D的检测灵敏度显著提高，适合 临床推广。
【附图说明】
[0047]图1是25径基维生素化和化径基维生素化的定量限（S/N= 10)。
【具体实施方式】 [004引实施例1
[0049] 所述超高效液相色谱串联质谱仪检测25径基维生素 D的方法实包括如下步骤：
[0050] (1)前处理：
[0051 ]向人体血清样品中加入25径基维生素 D的内标物，加入硫酸锋溶液和甲醇溶液进 行蛋白质沉淀;充分混匀后加入正己烧溶剂萃取;再充分混匀后离屯、，接着移取上清液并进 行氮气吹干，加入复溶液，得到待测样品；
[0052] 其中，所述人血清样品与所述硫酸锋溶液、甲醇溶液、正己烧萃取溶液的体积比为 1:1:2: 5;所述上清液与对应的原溶液的体积比为1:1;所述复溶液与人血清样品的体积比 为 1:2。
[0053] 25径基维生素 D内标物可W包括(16-25径基维生素化和/或(16-25径基维生素化。即 可W只包括少-25径基维生素化，也可W只包括少-25径基维生素化，也可W同时包括少-25径 基维生素化和少-25径基维生素化。
[0054] 如果只检测25径基维生素化（250皿2)，则可W只添加(16-25径基维生素化；如果只 检测25径基维生素化(250HD3)，则可W只添加少-25径基维生素化；
[00巧]如果同时检测25径基维生素化和25径基维生素化，则可W同时添加(16-25径基维生 素〇2和少-25径基维生素 D3。
[0056] 对加入正己烧后的溶液的离屯、条件为：13000r/min的速度离屯、5min。
[0057] 对移取的上清液干燥的条件为:通50°C的氮气直至干燥。
[0058] 所述复溶液为甲醇和水的混合物，其中，甲醇和水的体积比为70:30。
[0059] (2)检测；
[0060] 对所述待测样品采用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；
[0061] 所述检测采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子MRM;
[0062] MRM:Multiple Reaction Monitor,指多反应监测离子扫描；
[0063] 其中，内标定量离子对包括少-25径基维生素化定量离子对和/或少-25径基维生素 化定量离子对；
[0064] 具体的，当检测少-25径基维生素化时，采用少-25径基维生素化的定量离子对；
[0065] 当检测少-25径基维生素化时，采用少-25径基维生素化的定量离子对；
[0066] 当同时检测(16-25径基维生素化和(16-25径基维生素〇3,采用(16-25径基维生素化的 定量离子对和少-25径基维生素化的定量离子对；
[0067] 目标定量离子对包括25径基维生素化定量离子对和/或25径基维生素化定量离子 对；目标定性离子对包括25?基维生素化定性离子对和/或化径基维生素化定性离子对；
[0068] 具体而言，对25径基维生素化进行检测时，采用25径基维生素化定量离子对和25径 基维生素化定性离子对；
[0069] 对25径基维生素化进行检测时，采用25径基维生素化定量离子对和25径基维生素 化定性离子对；
[0070] 同时对25径基维生素化和25径基维生素化进行检测时，分别采用25径基维生素化 定量离子对和25径基维生素化定性离子对及25径基维生素化定量离子对和25径基维生素化 定性离子对；
[0071] 内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的条件包括：
[0072] 64-25?基维生素化定量离子对的母离子的质荷比为407.3,对应的子离子的质荷 比为159.1;
[0073] 64-25?基维生素化定量离子对的母离子的质荷比为419.3,对应的子离子的质荷 比为83.1;
[0074] 目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的条件包括：
[00巧]25径基维生素化的母离子的质荷比为401.35，对应的定量离子的质荷比为383.3， 定性离子的质荷比为159.1;
[0076] 25径基维生素化的母离子的质荷比为413.35,对应的定量离子的质荷比为395.3， 定性离子的质/荷比为83.1;
[0077] 其中，所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件包括：
[007引 色谱柱:AC卵口Y UPLC 邸H C18 Column(2.1 X 50臟，1.7皿）；
[0079] 色谱柱柱溫:45°C;
[0080] 进样量:20ul;
[0081 ]流速:0.4ml/min;
[0082] 梯度模式洗脱中流动相包括:A流动相为含2mM乙酸锭和0.1 %甲酸的水，B流动相 为含2mM乙酸锭和0.1 %甲酸的甲醇。
[0083] 采用上述流动相，在梯度洗脱中，25径基维生素化的保留时间为3.16min，25^基 维生素化的保留时间为3.09min。
[0084] 多反应监测离子扫描MRM的条件如下： 物质 衛乎财 锥孔电比(V) 驻留时间樹 碰鐘能量巧） 250HD: 巧 3* ：24 0.05 1 円 250! ID， 413.35>83.! % 0.05 22
[00扣] - 250H 化 4(儿3 护 3S3.3* 24 ().()5 10 250HD：, 401.3扣|巧.1 24 0.05 28 ci6-250IlD2 419.35>83.1 24 0.05 22
[0086] d6-250HD3 407.35> 159.1 24 化 05 敛
[0087] 其中，*代表定量离子对
[0088] 可W理解，上述MRM的条件并不是只对应一种情形，可W是检测25径基维生素化， 也可W是检测25径基维生素化，还可W是同时检测化径基维生素化和25径基维生素化。
[0089] 梯度洗脱条件如下： 时间Cm虹) A相比例（％) B相比例（％) 0.00 27 73 「 1 2.00 27 巧
[0090] 3.50 2 98 3.51 Tl 73 6.00 27 73
[0091] 质谱离子源参数包括：
[0092] 电离源:电喷雾电离ESI源；
[0093] 脱溶剂气溫度:400°C;
[0094] 脱溶剂气流速:900L/化；
[009引离子源溫度：120°C;
[0096] 毛细管电压:2500V。
[0097] (3)定性判断和定量计算：
[0098] 依据25径基维生素化和/或25径基维生素化的保留时间为定性依据，判断25径基维 生素化和/或化径基维生素化的存在；
[0099] 具体而言，当检测25径基维生素化时，依据25径基维生素化的保留时间判断25径基 维生素化的存在；
[0100] 当检测25径基维生素化时，依据25径基维生素化的保留时间判断25径基维生素化 的存在；
[0101] 当同时检测25径基维生素化和25径基维生素化时，依据25径基维生素化和25径基 维生素化的保留时间判断化径基维生素化和25径基维生素化的存在。
[0102] 用超高效液相色谱串联质谱法对样品进行定性判定，在相同试验条件下，样品中 被测目标物质色谱峰定量离子对和定性离子对保留时间与标准溶液中对应物质色谱峰定 量离子对和定性离子对的保留时间一致，则可W判断样品中存在对应的目标物质。
[0103] 依据25径基维生素化和/或25径基维生素化与对应内标物在内标曲线上的峰面积 比值，计算人体血清样品中的25径基维生素化和/或化径基维生素化的含量。
[0104] 具体而言，当检测25径基维生素化，依据25径基维生素化与对应内标物在内标标准 曲线上的峰面积比值，计算人体血清中的25径基维生素化的含量。
[0105] 当检测25径基维生素化，依据25径基维生素化与对应内标物在内标标准曲线上的 峰面积比值，计算人体血清中的25径基维生素化的含量。
[0106] 当同时检测25径基维生素化和25径基维生素化时，依据25径基维生素化和25径基 维生素化与对应内标物在内标标准曲线上的峰面积比值，计算人体血清中25径基维生素化 和25径基维生素化的含量。基维生素化和25径基维生素