化的含量之和作为25径基维 生素 D的含量。
[0107] 基于上述的实验条件，经过多次试验验证，本发明实施低、中、高浓度加标回收实 验的日内精密度和连续3天的日间精密度的RSD<9%。25径基维生素化和25径基维生素化的 检出限（S/N=3)分别为0.：3ng/ml和0.化g/ml，25^基维生素化和25径基维生素 D3的定量限 (S/N= 10)分别为0.8ng/m巧日0.5ng/ml (参见图I)。简单有效的前处理过程，高分辨率和高 灵敏度的液相色谱串联质谱仪，适宜的液相条件和良好的质谱参数的优化，使得本发明的 实施数据优于已报道的文献数据。
[0108] 实施例2为使本领域技术人员更好地理解本发明，现提供一个例子来说明本发明 用于25径基维生素 D的检测方法的具体实现过程。
[0109] 将150ul人血清移取至洁净的2ml离屯、管中，加入IOul内标溶液，混匀10s，加入 0.2M硫酸锋溶液150ul，混匀IOs，加入300ul甲醇，混匀IOs，加入750ul正己烧，混匀30s，离 屯、（13000巧m，5min)，取上清液600ul，50°C氮气吹干，最后用75ul 70 %甲醇水溶液复溶，满 旋混匀后，转移至玻璃内衬管，加载至液相色谱自动进样器中。
[0110] 液相色谱自动进样器自动将样品加载到色谱柱，然后通过流动相传递至质谱仪 LC-MS/MS"LC-MS/MS采用电喷雾电离源化SI)串联四级杆质量分析器作为质谱检测器进行 分析。其中，脱溶剂气溫度为400°C，脱溶剂气流速为90化/化，离子源溫度为120°C，毛细管 电压为2500V。采用多反应监测离子MRM扫描，其条件参见表1。
[0111] 表1反应监测离子扫描MRM条件
[0114] 其中，*代表定量离子对
[0115] 自动进样器自动将20ul预先净化好的样品加载到超高效液相色谱系统中，液相色 谱条件参见表2。色谱柱采用AC卵口Y UPLC邸H C18 Column(2.1 X 5〇111111，1.7皿），4流动相 为含2mM乙酸锭和0.1 %甲酸的水，B流动相为含2mM乙酸锭和0.1 %甲酸的甲醇，其中，色谱 柱柱溫为45°C，进样量为20ul，流速为0.4ml/min。
[0116] 表2液相色谱条件
[0118]样品随流动相排出色谱柱出口后，在压力的作用下进入质谱仪离子源或废液，由 六通阀控制进入离子源的样品通道。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电离子，带 电离子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3,其中，Ql和Q3为质量分析器，只允许根据25径 基维生素化和25?基维生素化的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子 在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。
[0119] 质谱仪的第一个四级杆(Ql)选择具有25径基维生素化、25径基维生素化、6(1-25径 基维生素化和 6(1-25径基维生素化（内标)的特定质荷比mA的离子，具有运些m/z比的离子被 允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3,其中只有25径基维生素化、25径基维生素化和内 标的碎片离子被选择通过，而其他离子被除去。参见表3,出示了被用于鉴别和定量的25径 基维生素 D。
[0120] 表3 25径基维生素 D的质量转变表
[0122] 随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子质量数转化成数字信号的电子脉 冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子信号强度对时间作图，即得质谱总离 子流图。
[0123] 血清标准物中分析物和内标的峰面积的比值被用于构建内标标准曲线，然后该曲 线被用于计算样品或质量控制物中分析物浓度，结果见表4;
[0124] 表4 25径基维生素化和化径基维生素化的精密度
[0126]某权威检测中屯、，采用本实施方法进行了 1000例的人体血清250皿检测，检测结果 显示质量控制物质结果准确，实验人员每日至少可W检测100份样品，检测效率高。说明本 方法准确可靠，前处理简单，分析时间短。
【主权项】
1. 超高效液相色谱串联质谱检测血清25羟基维生素 D的方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤： (1) 向血清样品中加入体积为血清样品体积1/15至2/15的25羟基维生素 D的内标物，加 入硫酸锌溶液和甲醇溶液进行蛋白质沉淀;充分混匀后加入正己烷溶剂萃取;再充分混匀 后离心，得到上清液和沉淀，移取上清液后用氮气吹干沉淀，再加入复溶液，得到待测样品； 所述25羟基维生素 D内标物包含6d-25羟基维生素02和/或6d-25羟基维生素 D3;所述复溶液 为甲醇和水按7: (2-4)的体积比混合的混合液； 其中，所述血清样品、硫酸锌溶液、甲醇溶液、正己烷溶剂的体积比为1:(0.8-1.2): (1.8-2.2): (4-6);所述复溶液与血清样品的体积比为I: (1.8-2.2); (2) 对待测样品用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述质谱采用正离子模式，并采用多 反应监测离子扫描MRM的扫描方式； 所述正离子模式中，内标定量离子对包括6d_25羟基维生素 D2定量离子对和/或6d-25羟 基维生素 D3定量离子对；目标定量离子对包括25羟基维生素 D2定量离子对和/或25羟基维生 素 D3定量离子对；目标定性离子对包括25羟基维生素 D2定性离子对和/或25羟基维生素 D3定 性呙子对； 内标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为： 6d-25羟基维生素 D2定量离子对的母离子的质荷比为419.3,对应的子离子的质荷比为 83.1； 6d-25羟基维生素 D3定量离子对的母离子的质荷比为407.3,对应的子离子的质荷比为 159.1； 目标定量离子和目标定性离子的多反应监测离子扫描MRM的质荷比条件为： 25羟基维生素 D2的母离子的质荷比为413.35,对应的定量离子的质荷比为395.3,定性 离子的质荷比为83.1; 25羟基维生素 D3的母离子的质荷比为401.35,对应的定量离子的质荷比为383.3,定性 离子的质荷比为159.1; 所述液相色谱采用梯度洗脱模式，液相色谱条件为： 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18Column(2.1x50mm, 1·7μπι); 色谱柱柱温:45°C; 进样量:20ul; 流速:〇 .4ml/min; 流动相:流动相A为含2mM乙酸铵和0.1 %甲酸的水，流动相B为含2mM乙酸铵和0.1 %甲 酸的甲醇； 6d-25羟基维生素 D3和25羟基维生素 D3的保留时间为3.09min，6d-25羟基维生素02和25 羟基维生素 D2的保留时间为3.16min; (3) 以25羟基维生素02和25羟基维生素 D3的保留时间为定性依据，判断25羟基维生素 D2 和25羟基维生素 D3的存在； 依据25羟基维生素 D#P25羟基维生素 D3与对应内标物在内标标准曲线上的峰面积比 值，计算血清样品中的25羟基维生素出和25羟基维生素 D3的含量。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应监测离子扫描MRM的锥孔电压、驻留 时间、碰撞能量条件如下：4. 根据权利要求2所述的方法，所述梯度洗脱的条件如下：5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述质谱中质谱离子源参数如下： 电离源：电喷雾电离ESI源； 脱溶剂气温度:400°C; 脱溶剂气流速:900L/Hr; 离子源温度：120°C; 毛细管电压：2500V。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述离心的条件为:在室温下，以 13000r/min 的速度离心 5-lOmin。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述用氮气吹干沉淀是通入45-55 °〇的氮气直至沉淀干燥。
【专利摘要】本发明提供了一种高灵敏高通量超高效液相色谱串联质谱仪检测25羟基维生素D的方法。向血清样品中加入25羟基维生素D的内标物，加入硫酸锌溶液和甲醇溶液进行蛋白沉淀；充分混匀后加入正己烷溶剂萃取；再充分混匀后离心，接着移取上清液并进行氮气吹干，加入复溶液，得到待测样品；对待测样品用超高效液相色谱串联四级杆质谱仪进行检测；以25羟基维生素D2和/或25羟基维生素D3的定量离子对及定性离子对的保留时间为定性依据，采用内标标准曲线法定量。本发明前处理简单，特异性、抗基质干扰能力强；检测时间短，通量高，检测精密度、灵敏度高，成本低廉。
【IPC分类】G01N30/88, G01N30/06
【公开号】CN105527364
【申请号】CN201510530370
【发明人】袁洪, 郭成贤, 江涛, 刘湘军
【申请人】袁洪
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年8月26日