用t-test比较差异显著性，冲<0.05差 异显著，*冲<0.01差异极显著。
[0042] 由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外对肺癌A549细胞的增殖活性具 有抑制作用，实验结果见图2。全缘马尾藻多糖SPSW浓度和时间依赖性方式显著地抑制肺 癌A549细胞的体外增殖活性。不同浓度的全缘马尾藻多糖SPS处理A549细胞24h后，对A549 细胞的增殖抑制率2%上升至92%，并且在SPS浓度为1.5mg/ml时其对A549细胞的抑制率高 达 92.1%。
[0043] 然而由上述实施例2制得的全缘马尾藻多糖SPS-A在体外对肺癌A549细胞的增殖 活性结果显示，在SPS-A浓度为1.5mg/ml时其对A549细胞的抑制率只有39.1 %，因此选择水 提全缘马尾藻多糖(SPS)作为本发明原料。
[0044] 实施例4
[004引 SPS体外给药诱导肺癌A549细胞发生调亡
[0046] 调亡细胞的染色质呈现浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和调亡小体等 典型的调亡形态。细胞调亡早期，憐醋酷丝氨酸(PS)外翻，Annexin V是对PS有高度亲和力 的重组蛋白，可作为外翻的PS的特异性探针并作为早期调亡的标志之一。
[0047] 实验方法
[0048] 取对数期的A549细胞，膜酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度为3 X 104个/ml;将 盖玻片泡酸洗净高压灭菌后，放入12孔培养板中，注意防止染菌污染;取1ml制备好的细胞 悬液加到培养板中的盖玻片上，放入细胞培养箱中继续培养;24h后，取出培养板，加入0， 0.2，0.4and 0.6mg/ml的全缘马尾藻多糖继续培养；1化后，取出培养板，倒掉细胞上清液， 用4%多聚甲醒室溫固定lOmin，无菌PBS清洗Ξ次细胞;加入化echst 33258染色液室溫继 续解育lOmin;巧光显微镜下观察，随机挑选Ξ个视野进行拍照保存。
[0049] 同样取对数期的A549细胞，膜酶消化成单细胞悬液，接种6孔板，调整细胞数量为1 X 1〇6个/孔;24h后，加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全缘马尾藻多糖继续培养；1化后，收集 A549细胞并用PBS清洗两次，500μ1结合缓冲液重悬细胞沉淀，分别加入扣1 Annexin V- 門TC and PI，室溫避光解育lOmin，即刻使用流式细胞仪检测。
[0050] 由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外能够诱导肺癌A549细胞发生调 亡。结果如图3A所示，A549细胞经SPS处理12h并经化echst 33258染色后，其细胞核出现了 典型的调亡形态学特征，包括:染色质固缩、核碎裂、调亡小体形成等;Annexin V-FITC/PI 双染实验进一步验证了SPS对A549细胞的调亡的诱导作用，结果如图3B所示，不同浓度的 SPS处理肺癌A549细胞1化后，晚期（右上象限）和坏死(左上象限）的调亡细胞所占的比例分 别从0.7%上升至28.8% ,0.6%升高至12.7%。
[0051 ] 实施例5
[0052] SPS体外给药诱导肺癌A549细胞线粒体膜电位下降
[0053] 线粒体在内源性的线粒体调亡通路中发挥重要作用，线粒体膜电位的降低受多种 压力信号因子激活并且是细胞死亡级联过程中不可逆转的步骤，其被认为是线粒体调亡通 路中的重要事件，同时也是细胞早期调亡的标志之一。JC-1是一种膜渗透性的亲脂性阳离 子巧光染料，其在线粒体内表现出电势依赖性的积聚。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基 质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色巧光;不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失， JC-1只能W单体的形式存在于胞浆中，产生绿色巧光。因此颜色的变化非常直接的反映出 线粒体膜电位的变化。
[0054]实验方法
[005引取对数期的A549细胞接种6孔板，调整细胞的数量为1 X 106个/孔;培养2地后，加 入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全缘马尾藻多糖继续培养；1化后，加入JC-1染料解育30min; 离屯、收集细胞沉淀，染色缓冲液洗两遍，检测缓冲液重悬后使用流式细胞仪检测。
[0056] 由实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外能够诱导肺癌A549细胞线粒体膜电 位的降低，结果见图4,与对照组相比，SPS处理之后的A549细胞发射红色巧光的细胞数明显 降低而发射绿色巧光的细胞数显著增加，说明了 A549细胞线粒体膜电位的降低。
[0057] 实施例6
[0058] SPS体外给药诱导肺癌A549细胞活性氧的产生
[0059] 活性氧是线粒体氧化呼吸链的副产物并在细胞的氧化压力中发挥重要作用，堆积 的活性氧会攻击细胞内的核酸、蛋白和脂质，并最终导致细胞的死亡。线粒体是细胞内活性 氧的主要来源，活性氧的产生与线粒体膜电位的降低密切相关。过量的细胞内活性氧破坏 线粒体膜的完整性，导致细胞色素 C的释放，激活caspase级联反应，并导致细胞的调亡产 生。
[0060] 实验方法
[0061] 将对数生长期的肺癌A549细胞接种6孔板，调整细胞数量为1 X 106个/孔;培养24h 后，加入0，0.4，0 . Sand 1. Omg/ml的全缘马尾藻多糖继续培养；1化后，加入活性氧探针 DCFH-DA解育20min，无血清培养基洗Ξ次后，收集细胞进行流式细胞仪检测。
[0062] 由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外能够诱导肺癌A549细胞活性氧 的产生。与对照组A549相比，SPSW浓度依赖性的方式诱导A549细胞的活性氧水平的显著增 加 (图 5A，B)。
[0063] 实施例7
[0064] SPS体外给药诱导肺癌A549细胞产生周期阻滞
[0065] 细胞周期分布被认为是细胞存活、生长和增殖的主要参数之一。不受控的细胞增 殖是肿瘤的典型特征，所W细胞周期阻滞代表着肿瘤治疗的主要祀标。细胞周期监测点是 检测细胞周期各时相间转换的主要调节机制。细胞周期的正常进展若被各种细胞损伤影 响，细胞周期将会被阻滞在G2/M和S期。一旦细胞损伤不能被修复，细胞将停止异常的细胞 分裂而最终走向调亡或是坏死的过程。
[0066] 实验方法
[0067] 将对数生长期的肺癌A549细胞接种6孔板，调整细胞数量为1 X 106个/孔;培养24h 后，加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全缘马尾藻多糖继续培养；1化后，细胞通过离屯、收集， 经由冰浴的PBS洗涂两次后，用70%预冷的酒精于4°C固定12h;固定的A549细胞离屯、收集并 用PBS洗两次后，用PI(含化ase)于37°C避光解育30min，然后使用流式细胞仪检测各个时相 的细胞数。
[0068] 由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外能够诱导肺癌A549细胞产生G2/ Μ细胞周期阻滞。实验结果如图6A，B所示，随着SPS处理浓度的增加，G1期的细胞数从72.8% 下降到52.8%，而G2/M期的细胞数从12.3%上升到28.5%，说明了8?5诱导肺癌4549细胞 G2/M细胞周期阻滞。
[0069] 实施例8
[0070] SPS体外给药对肺癌A549细胞调亡相关蛋白表达的影响
[0071] 调亡是受到严格调控的一个生理过程，其设及明显的蛋白质表达谱的变化。在各 种肿瘤相关的蛋白中，促调亡和抗调亡蛋白通常被作为调亡的分子标记。作为调亡的诱导 者和调节者的肿瘤抑制蛋白P53,设及到DNA的损伤修复、细胞周期和调亡的控制等。Bcl-2 蛋白家族是调亡重要的调节者，并且在线粒体调亡通路中发挥着重要的作用。其中，Bcl-2 是该家族中抗调亡成员能抑制细胞色素 C从线粒体向胞质的释放，Bax是该家族中促调亡成 员能促进细胞色素 C的释放。而Bax/Bcl-2的比率是线粒体调亡通路中的关键检查点，两者 比率的升高意味着调亡产生。细胞色素 C一旦从线粒体释放至胞质内，就会结合Apaf-1, ATP ,and procaspase-g形成调亡体复合物，激活起始者caspase-9和下游的效应者 caspase-3,随后诱导PARP切割然后执行调亡过程，也即触发caspase依赖性的线粒体调亡 通路的启动。
[007引实验方法
[0073] 将对数生长期的A549细胞接种六孔板，调整细胞数量为1 X 106个/孔;培养2地后， 加入0，0.4，0. Sand 1. Omg/ml的全缘马尾藻多糖继续培养；1化后，离屯、收集细胞，通过血球 计数板对细胞进行计数，加入相应量的裂解缓冲液，沸水浴煮lOmin制备蛋白样品；随后蛋 白样品通过10 % SDS-PAGE胶分离并转移至NC膜上，随之相继解育一抗和二抗，最后加入ECL 发光液检测各蛋白表达量的变化。
[0074] 实验结果如图7所示，与对照组A549各蛋白的表达量相比，SPS处理A549细胞之后， 细胞P53蛋白的表达量显著升高，说明SI^对A549细胞调亡的诱导设及P53相关的信号通路； Be 1 -2表达量降低、Bax表达量升高，故Bax/Bc 1 -2的比率显著增加，表明SI^诱导的线粒体调 亡通路是通过对Bax/Bd-2比率的上调的方式来实现的；此外，SPS处理A549细胞后，其活性 形式，也即切割型的caspase-3, caspase-9和PARP的表达均显著上升，进一步说明了 SF*S诱 导A549细胞线粒体调节的调亡。
[007引实施例9
[0076] SPS体外给药对人厮静脉