内皮细胞HUVEC增殖活性的影响
[OOW]如前述实施例3中所用的MTT比色法来评估全缘马尾藻多糖SPS对体外培养的人厮 静脉内皮细胞HUVEC增殖活性的抑制作用。
[0078]实验方法
[0079]如实施例3中的实验方法相同。
[0080]由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外能够抑制人厮静脉内皮细胞 皿VEC的增殖活性，实验结果如图8所示，全缘马尾藻多糖SPSW浓度依赖性方式抑制内皮细 胞的增殖。
[0081 ] 实施例10
[0082] SPS体外给药对人厮静脉内皮细胞HUVEC迁移活性的影响
[0083] 因为血管内皮细胞的迁移对新生血管生成是必须的，所W通过划痕实验和 Transwell实验检测了CS5931对细胞迁移的影响。
[0084] 实验方法 [008引平板划痕法：
[0086] 取对数期HUVEC细胞，膜酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度为3.5 X ΙΟ4个/ml，取 100μΙ细胞悬液加入到96孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱中培养24h;用无菌的20化1 的黄枪头在每个孔中划线，形成单细胞划痕，并用无菌PBS冲洗两次;将含有不同浓度的SPS (0，0.2，0.3，and 0.4mg/ml)和2 %胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养基加入孔板中，每个浓度 梯度设立6个复孔;解育lOh后，倒置相差显微镜下观察并随机选择3个视野进行拍照;HUVEC 细胞的迁移通过测定药物处理前后划痕的宽度来计算，其迁移率计算公式如下所示:迁移 抑制率（％) = [1-(药物处理组的平均宽度/空白对照组的平均宽度）]Xl〇〇%实验重复Ξ 次，数据W r±S;D表示，通过SPSS16,采用t-test比较差异显著性，冲<0.05差异显著，*冲 <0.01差异极显著。
[0087] Transwell 迁移法
[0088] 该实验是在Transwell Boyden chamberKorning Cos1:a;r,Cambridge,MA,USA)中 进行的，该小室含有8μπι的滤膜，可W允许细胞跨膜穿过，具体实验方法如下：取对数期 HUVEC细胞，膜酶消化成单细胞悬液，用各个不同浓度的SPS(0，0.2，0.3，and 0.4mg/ml)调 整细胞密度为5 ΧΙΟ5个/ml;取10化1各浓度梯度的细胞悬液加入到化answell培养板的上 室中，设3个复孔;下室则放入0.6ml含20%胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养基，放入二氧化 碳培养箱中培养化;取出培养板，倒掉小室内外的培养液，PBS清洗滤膜Ξ次，并用95 %的乙 醇室溫固定30分钟，然后0.1%的结晶紫室溫染色20min;用PBS洗去多余的燃料，并用棉签 将小室上表面的细胞擦掉，只留下迁移到滤膜下表面的细胞;倒置相差显微镜下观察迁移 到下室的细胞，并拍照保存;计算细胞迁移抑制率，公式如下:抑制率（％) = [1-(药物处理 组的迁移细胞数/空白对照组的迁移细胞数）]Xl〇〇%;实验重复Ξ次，数据WF+SD表 示，通过SPSS16，采用t-test比较差异显著性，冲<0.05差异显著，*冲<0.01差异极显著。
[0089] 由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体外能够抑制人厮静脉内皮细胞 HUVEC的迁移活性。图9A 9C表明，在划痕实验中，随着SI^浓度的增加，划痕的愈合能力逐渐 降低，也即SPS对册VEC细胞迁移活性的抑制作用呈剂量依赖性。Transwell实验结果（9B 9D)表明，SPS W浓度依赖性方式引起册VEC细胞迁移的抑制作用；0.2，0.3，and 0.4mg/ml SPS处理册VEC细胞化后，其对内皮细胞册VEC迁移的抑制率分别为42.9，61.0和67.9 %。上 述SI^对内皮细胞迁移能力的抑制作用是发生在细胞增殖没有受到其显著影响的时间和浓 度下（图8 )，所W才真正意义上说明了 SI^是通过抑制血管内皮细胞的迁移来发挥其抗血管 生成作用的。
[0090] 实施例11
[0091] SPS体外给药对人厮静脉内皮细胞HUVEC管腔形成活性的影响
[0092] 内皮细胞管腔的形成是新生血管生成的重要过程，所W检测SI^对皿VEC细胞管腔 形成能力的影响。
[009引实验方法
[0094] 册VEC细胞在3D基质层(Ma化igel胶)上形成管腔状结构的能力的实验思路如下： 将分装的Ma化ige 1胶(BD，Be壯ord，MA，USA)从-20°C冰箱中取出，放入4°C冰箱中过夜解冻 成液体状;将96孔培养板、无血清RPMI-1640培养基、1.5ml的小离屯、管放入-80°C冰箱中预 冷却，备用；在冰上，将Ma化igel胶用预冷的1640培养基按照1:2的比例稀释混匀；6化1/孔 的稀释Matrigel胶加入到96孔板中，冰上放置lOmin，再放入37°C培养箱中聚合30min;取对 数期册VEC细胞，膜酶消化成单细胞悬液，用各个不同浓度的SPS (0，0.2，0.3，and 0.4mg/ ml)调整细胞密度为3 X ΙΟ4个/ml ;Matrigel胶聚合之后，取不同浓度的SPS细胞溶液各 0.1ml加入聚合的胶上，37Γ细胞培养箱中继续培养化;倒置相差显微镜下观察管腔形成情 况，随机挑选3个视野进行拍照保存。
[0095] 实验结果如图10所示:各个不同浓度的SPS处理册VEC内皮细胞化后，能够显著抑 制血管内皮细胞在Matrigel胶上小管拟态的形成；高浓度的SPS甚至能够完全破坏小管 (10D)。W上实验结果表明了SPS能够抑制册VEC细胞的小管拟态的形成，同样，该抑制作用 发生在册VEC细胞的增殖活性没有受到SPS明显抑制的作用时间和作用浓度下，所W说SPS 确实能发挥抗血管生成活性。
[0096] 新生血管生成是一个多级的过程，静止状态的血管内皮细胞首先在血管生成因子 的刺激下增殖、迁移、侵入下层基质、形成管腔架构，最终形成一个成熟的功能化的血管网 络。我们的实验发现全缘马尾藻多糖SPS能够抑制内皮细胞的增殖、迁移和管腔拟态的形 成，说明SI^能够在血管生成的多个水平上发挥抗血管生成作用。
[0097] 实施例12
[0098] SPS体内给药抑制斑马鱼新生血管生成
[0099] 传统上的血管生成的体内检测都太复杂而很难进行大规模的药物筛选，而斑马鱼 胚胎的通体透明性和在无功能性血管系统下存活Ξ到四天的特性使得斑马鱼模型能够被 运用到体内的血管细胞生物学中。斑马鱼胚胎是评估抗癌药物的抗血管生成活性的理想实 验模型。
[0100] 实验方法
[0101] 转基因斑马鱼Tg(f 1 i la: EGFP)y 1饲养在自动循环水装置中，水溫控制在28°C， 14h/l化光暗周期条件下;受精卵通过自然受精获得，然后放入恒溫培养箱中28Γ继续培养 2地;期间，及时鉴定并剔走死亡的呈白色的卵，防止污染水质。斑马鱼卵受精后2地，将鱼卵 20个/孔分入24孔板中，加入不同浓度的全缘马尾藻多糖SI^继续解育4她;解育结束后，将 斑马鱼胚胎在室溫下用4%的多聚甲醒固定化，PBS冲洗Ξ次后将鱼卵放置在载玻片上于倒 置巧光显微镜下观察并拍照。
[0102] 由上述实施例1制得的全缘马尾藻多糖SPS在体内能显著抑制斑马鱼胚胎的血管 生成，实验结果如图11所示，对照组斑马鱼形成了健康的节间静脉（ISV)和光滑的篮状结构 肠下血管（SIV)(图11A D)，而SI^加药组的节间静脉和肠下静脉均出现了明显的抑制作用 (图 11B C E F)。
【主权项】
1. 一种全缘马尾藻多糖的应用，其特征在于:全缘马尾藻多糖作为制备抗癌药物或抗 癌保健品中的应用；或，全缘马尾藻多糖作为制备抗血管再生的药物或抗血管再生成保健 品中的应用。2. 根据权利要求1所述的全缘马尾藻多糖的应用，其特征在于:所述全缘马尾藻多糖作 为制备抗非小细胞型肺癌药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的全缘马尾藻多糖的应用，其特征在于:所述全缘马尾藻多糖以 全缘马尾藻原料采用热水提取法提取，而后过滤、浓缩，浓缩后经醇沉、干燥，即得全缘马尾 藻多糖。4. 根据权利要求1或2所述的全缘马尾藻多糖的应用，其特征在于:所述全缘马尾藻多 糖分子量范围为100~200kDa，主要组成单糖为岩藻糖和半乳糖，两者的摩尔比例为1~10: 1，硫酸根含量为15 %~50 %。5. 根据权利要求1所述的全缘马尾藻的应用，其特征在于:所述全缘马尾藻来源于褐藻 门，褐藻纲，墨角藻目，马尾藻科的马尾藻属。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种全缘马尾藻多糖的应用。全缘马尾藻多糖作为制备抗癌药物或抗癌保健品中的应用；或，全缘马尾藻多糖作为制备抗血管再生的药物或抗血管再生成保健品中的应用。本发明全缘马尾藻多糖对抗癌和抗血管具有显著的抑制作用，并公开了将全缘马尾藻多糖应用于制备抗癌和抗血管生成药物和保健品，能够诱导癌细胞凋亡，降低线粒体膜电位，阻滞G2/M细胞周期，抑制内皮细胞增殖，抑制HUVEC细胞迁移，抑制HUVEC细胞的小管拟态的形成，从而对恶性肿瘤有一定的预防和治疗作用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/715, A61K36/03
【公开号】CN105596376
【申请号】CN201610061227
【发明人】金维华, 刘格, 孙超岷, 张全斌
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月28日