试剂盒，其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种大肠杆菌0157:H7检测试剂盒、其制备方法和应用，属于微生物检测领域。
技术背景
[0002]大肠杆菌0157:H7是目前世界上公认的三大最主要的食源性致病菌之一。自1982年美国科学家发现以来，其危害日益严重。它可以通过污染猪肉、禽肉、牛肉、牛奶、三明治、果汁、蔬菜和饮水等进行传播，也可以通过人与动物，人与人之间接触传播，进而危害人的生体健康。大肠杆菌0157:H7的感染剂量极低，最低10个活菌就可能感染致病。感染患者一般出现腹部绞痛、非出血性腹泻、呕吐、低度发热症状以及溶血性尿毒综合症，甚至导致急性肾衰竭而死亡。因此，快速、高灵敏的检测大肠杆菌0157:H7具有非常重大的理论和现实意义。
[0003]相比传统的检测大肠杆菌0157:H7的方法(分离鉴定法、PCR方法和生物传感器方法)，胶体金免疫层析法可以避免传统方法的耗时费力(一般2-7天)，具有便捷、特异敏感、稳定性强、快速(一般15分钟)、不需特殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测等特点。但胶体金试纸条的检测灵敏度相对不高(通常高于104CFU/mL)，这个缺陷限制了其在食品和农产品中的普及使用以及定量检测。虽然业界提尝试通过改良试纸条读取仪和最大限度消除试纸条背景干扰信号等方式来提高胶体金试纸条的检测灵敏度，但其效果均不明显。
【发明内容】
[0004]鉴于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种新型的大肠杆菌0157:H7检测试剂盒，其通过优化纳米金粒子的光学性能和单分散度，实现光学理论上能与试纸条读取仪光源波长达到最佳的耦合效果，从而大幅提高试纸条的检测性能。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种制备所述大肠杆菌0157:H7检测试剂盒的方法。
[0006]本发明的再一目的在于提供所述大肠杆菌0157:H7检测试剂盒的用途，例如，利用所述试剂盒实现的大肠杆菌0157:H7检测方法。
[0007]为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括:
[0008]一种大肠杆菌0157:H7检测试剂盒,包含:
[0009]大肠杆菌0157:H7胶体金试纸条，包括:
[0010]样本垫，用以向所述试纸条内摄入添加有纳米金球标记大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的液态待检测样品，
[0011]以及，表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有大肠杆菌0157: H7存在时能与所述纳米金球标记大肠杆菌0157: H7单克隆抗体及大肠杆菌0157:H7结合的第一抗体，而所述质控线内包含在无大肠杆菌0157:H7存在时就能与所述纳米金球标记大肠杆菌0157:H7单克隆抗体结合的第二抗体，
[0012]所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；
[0013]以及，纳米金球标记大肠杆菌0157:H7单克隆抗体，包含单分散的纳米金球和标记在所述纳米金球上的大肠杆菌0157:H7单克隆抗体,其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。
[0014]在一可选实施方案之中，所述试纸条包括依次分布于基板上的样本垫、检测垫和吸水垫，其中所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。
[0015]较为优选的，所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20-0.65，等离子光学波长为520-560cm \粒径为18_60nm。
[0016]尤为优选的，所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20。
[0017]进一步的，所述第一抗体包括大肠杆菌0157:H7兔多抗，所述第二抗体包括驴抗鼠二抗。
[0018]进一步的，所述检测垫采用硝酸纤维膜。
[0019]前述任一种试剂盒的制备方法，包括:
[0020]纳米金球标记大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的制备，包括:将HAuCl4与柠檬酸三钠在水相反应体系中于100-150°C恒温回流，使反应溶液颜色从浅黄一浅紫色一浅红色一酒红色，获得粒子分散度PDI为0.20-0.65的、粒径为18-60nm、等离子光学波长为520-560cm 1的纳米金球，再将所述纳米金球的分散液与大肠杆菌0157:H7单克隆抗体混合搅拌，并以BSA和PEG2000进行封闭，离心除去未标记的抗体，用复溶液复溶，备用；
[0021]胶体金试纸条的制备，包括:将样本垫、检测垫、吸水垫依次粘贴在基板上，并将第一抗体和第二抗体分别施加至检测垫上，形成检测线和和质控线。
[0022]一种大肠杆菌0157:H7检测系统，包含前述任一种试剂盒以及试纸条读取仪光源。
[0023]一种大肠杆菌0157:H7检测方法，包括:
[0024]提供前述任一种试剂盒；
[0025]将所述纳米金球标记大肠杆菌0157:H7单克隆抗体加入液态的待检测样品并充分混合，再取混合物滴加至所述试纸条的样本垫上，待混合物在试纸条上充分扩散后，则:
[0026]观察试纸条颜色变化，而定性分析待检测样品中是否存在大肠杆菌0157:H7 ；
[0027]或者，以试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C值，并与标准曲线对照，定量检测待检测样品中大肠杆菌0157:H7的含量。
[0028]进一步的，该方法对于大肠杆菌0157:H7的检测限为102CFU/mL。
[0029]前述标准曲线可通过业界悉知的方式获得，即制备一系列不同浓度的大肠杆菌0157:H7的标准样品，依照前述的检测方法，分别获得和记录T、C值和T/C值，再依据所获检测结果和相应标准样品的浓度，探知检测结果与样品浓度存在确定的数学关系，从而建立标准曲线。
[0030]其中，T、C值分别为试纸条读取仪测得的检测线(T线)和和质控线(C线)的检测值，例如吸光度值等。
[0031]本发明的再一重要目的还在于提供一种试剂盒，包括:
[0032]试纸条，包括:
[0033]样本垫，用以向所述试纸条内摄入含有纳米金标记物的液体样品，
[0034]表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有目标物质存在时能与所述纳米金标记物及目标物质结合的识别物质，而所述质控线内包含在无目标物质存在时就能与所述纳米金标记物结合的参考物质，
[0035]所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；
[0036]以及，纳米金标记物质，包含单分散的纳米金球以及结合在所述纳米金球上的、能与目标物质特异性结合的标记物，其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源波长耦合的等离子光学波长。
[0037]进一步的，其中目标物质与所述纳米金标记物、识别物质系呈夹心结合的方式，特别是，目标物质被结合于纳米金标记物和识别物质之间。
[0038]该试剂盒对于某些生物、化学物质的检测均是适用的，特别适于对具备双抗体夹心结合性能的蛋白质等目标物质的检测。
[0039]本发明还提供了基于所述试剂盒的检测方法和检测系统。
[0040]其中，该检测方法包括:将所述纳米金标记物加入液态的待检测样品并充分混合，再取混合物滴加至所述试纸条的样本垫上，待混合物在试纸条上充分扩散后，则:
[0041]观察试纸条颜色变化，而定性分析待检测样品中是否存在目标物质；
[0042]或者，以试纸条读取仪读取，记录T、C值和T/C值，并与标准曲线对照，定量检测待检测样品中目标物质的含量。
[0043]其中，该检测系统包含前述任一种试剂盒以及试纸条读取仪光源。
[0044]与现有技术相比，本发明有益效果至少在于: