专利名称：一种萝卜系胼胝体和用它培育植物体及杂交种子的方法
技术领域：
本发明是关于新基因型的CMS萝卜系的胼胝体，并由此生产植物体和杂交种子的方法，进一步涉及上述NWB-CMS萝卜系的植物体选择用DNA标记；尤其涉及一种包括序列号码5或者6的碱基序列的NWB-CMS萝卜系的胼胝体，利用它培育植物体和生产杂交种子的方法，以及拥有以序列号码5或者6表示的碱基序列为特点的NWB-CMS萝卜系的有关植物体选择用DNA标记的内容。
背景技术：
雄性不育(male sterility)是花粉，花粉囊，雄蕊等雄性器官异常而产生不育的现象。雄性不育有基因原因和环境原因，在雄性器官里花粉的不育发生的情况最多。发生花粉不育的基因原因是染色体发生异常而花粉母细胞的减数分裂发生混乱，以及细胞核内的基因或细胞质基因(cytoplasmicfactor)的突变细胞发生异常而花粉在成熟过程中被破坏。
由于花粉母细胞的减数分裂发生混乱而造成的雄性不育，其雌性器官也发生异常；而花粉在成熟过程中被破坏造成的雄性不育，其雌性器官仍具有正常的受精能力。只有花粉不育而雌蕊具有受粉能力的雄性不育导入到杂交样本时，在人工杂交里不需要去雄(castration)，所以可利用在改良、种植杂交种子的杂交优势育种法的F1选种(seed gathering)里。
细胞核内根据基因的雄性不育称为“细胞核雄性不育(genic malesterility)”，这些主要在进行隐性遗传并隐性同型结合(homozygouslyrecessive)时发生不育。由此，利用它生产F1杂交种子时只得到约50％的不育株，所以为了确认F1个体的育性，必须使各个体开花后确认花粉生成的过程。此外，雄性不育系的保持以及扩繁也需要很多努力，而且有些作物花太小而很难判断育性，并对营养生长期太长的作物很难适用。
一方面，根据细胞质基因的雄性不育称为“细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，以下称为“CMS”)”，这是由于细胞质的缘故线粒体不能执行正常的功能而生成非正常的花粉，因而不具备自花授粉能力。CMS是母体遗传(maternal inheritance)，杂交任何可育系也不育株达100％，所以雄性不育系的保持很容易，非常方便地适用于以叶子、茎等营养器官为收获物的作物里。
由于这些原因，目前正在继续进行一些在生产杂交种子时试图利用CMS的试验，并且对许多植物体CMS的研究进行到了分子水平。从而澄清了许多引起CMS的细胞质因素。目前在十字花科(Cruciferae family)作物里具有CMS系的白菜属(Brassica sp.)有Polima，Ogura，Napus，Anand等，萝卜属(Raphanus sp.)有Ogura，Kosena等。这些品系都是因为细胞质内的线粒体基因的结构变形或者生成新的开放阅读框(ORF，open reading frame)的缘故引起CMS。(Cardi，T.and Earle，E.B.，Theor.Appl.Genet，94204-212，1997；Grelon，M.et al.，Mol.Gen.Genet，243(5)540-547，1994；Iwabuchi，M.etal，Plant Mol.Biol.，39(1)183-188，1999)。
到目前为止所知的CMS萝卜系里Ogura-CMS系在雄性不育的导入率和稳定性方面最优秀。由此，生产萝卜的F1杂交种子时主要使用Ogura-CMS系。但是，Ogura-CMS系的雄性不育不是完全根据细胞质因素引起的，也有细胞核内因素的影响。而且，Ogura-CMS系作为生产杂交种子的杂交亲本时，按育种系CMS的导入与否出现显著的差异。由于这些问题，利用Ogura-CMS系而生产F1杂交种子是有育限的。
因此，迫切的要求开发一种对F1杂交种子的雄性不育导入率高的新CMS萝卜系。但是，和分离、鉴别微生物的过程有所不同，确认植物CMS特性的过程因为需要很多时间和努力，所以对此的开发并不活跃。
一方面，在植物的育种里为了选择具有指定性状的系，和性状相关的特性作为标记。过去利用根据性状特性(例花的颜色)变异的标记(Staub，J.E.et al.，HortScience，31(5)729-741，1996)，但是很多性状的标记根据环境不仅有变化的可能(例黄瓜的新育形基因de)，而且存在标记的数量极有限的缺点。
由此，最近有开发研究利用在DNA碱基序列水平上发生的变异的分子标记(DNA标记)。性状植物含有很多DNA标记，且对植物体的功能或生理不会有障碍，而使得利用标记成为一个很好的方法(Jones，N.et al.，NewPhytol.，137165-177，1997)。在萝卜属的CMS系中，已经开发对Ogura-CMS和Kosena-CMS系的DNA标记。利用扩大上述标记的引物，应用PCR对各系独特的标记(PCR产物)的检测而选择各CMS系。由此，开发F1杂交种子的雄性不育导入率高的新CMS萝卜系，同时开发用来选择这些新品系的标记。
对此，本发明者开发新的CMS萝卜系的过程中，分离、鉴别拥有与传统的Ougra-以及Kosena-CMS萝卜系不同基因型CMS的NWB-CMS萝卜系，这种NWB-CMS萝卜系的F1植物体的雄性不育导入率比利用在传统生产F1杂交种子的Ougra-CMS萝卜系更高，并一起开发了这种NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记。
发明内容
本发明的目的在于提供具有新基因型的细胞质雄性不育(CMS)特性的NWB-CMS萝卜系(Raphanus sativus line)的胼胝体(保藏号KCTC10339BP)。
本发明的另一目的在于提供利用上述胼胝体制造NWB-CMS萝卜系植物体的方法，以及上述NWB-CMS萝卜系植物体与要导入雄性不育的雄性可育萝卜系植物体杂交而生产NWB-CMS萝卜系的杂交种子的方法。
本发明的又一个另外目的在于提供扩大NWB-CMS萝卜系植物体选择用DNA标记，以及上述DNA标记的引物。
本发明“NWB-CMS萝卜系”是指在本发明分离、鉴别的萝卜系，且和传统CMS不同的具有新基因型CMS的萝卜系。
本发明的NWB-CMS萝卜系的胼胝体(保藏号KCTC 10339BP)，具有新基因型的细胞质雄性不育(CMS)特性，并且包含序列号5和序列号6以及序列号5或序列号6的碱基序列。
而且本发明，还进一步提供了将上述胼胝体诱导，利用组织培养而无性生殖NWB-CMS萝卜系植物体的制造方法。
上述植物体的制造方法包括(a)从第一项的胼胝体诱导芽(shoot)的阶段；(b)形成上述芽的胼胝体里诱导生根的阶段；以及(c)形成上述生根的胼胝体经过土壤驯化和再分化过程形成植物体的阶段。
并且本发明，还提供了上述NWB-CMS萝卜系植物体与要导入雄性不育的雄性可育萝卜系杂交为特点的CMS萝卜系杂交种子的制造方法。
本发明还提供了具有以序列号码5或者序列号码6表示的碱基序列为特点的NWB-CMS萝卜系植物体选择用DNA标记，扩大上述标记的引物以及包括上述引物和PCR反应混合物为特点的NWB-CMS萝卜系植物体的选择试剂盒(kit)。
上述引物用序列号码1和2，或者序列号码3和4的引物成双为特点。
本发明人为了开发具有新的基因型CMS的萝卜系，把中国吉林省地区的野生青皮萝卜约100多种作为对象选择具有CMS特性的萝卜。把野生青皮萝卜作为杂交样本和雄性可育个体进行杂交。把上述野生青皮萝卜和雄性可育系杂交后生产的F1个体再和雄性可育系进行回交(backcross)后生产F2个体，然后调查生产的F2个体的花粉生成而实现CMS的确认。
这时在F2个体里雄性可育和雄性不育都出现的话，杂交样本的雄性不育是被细胞核内基因和细胞质基因引起的，只出现雄性不育个体时则纯粹是被细胞质基因引起的雄性不育。通过多次的检查最终选择确认为安全地拥有CMS特性的萝卜。
其后，为了调查对已选萝卜的F1个体的雄性不育导入率，把上述已选萝卜作为杂交亲本生产F1种子。其结果，和其他系杂交的上述萝卜的雄性不育导入率比利用在传统F1选种的Ougra-CMS萝卜系明显高(参照表1)。
然后，本发明者为了确认上述萝卜是否为传统的CMS萝卜系，利用把对Ougra-以及Kosena-CMS萝卜系独特的DNA标记扩大的引物进行PCR。其结果，在本发明选择的萝卜里没有检测出Ougra-以及Kosena-CMS萝卜系的独特的DNA标记(参照图1)。从而本发明里选择的萝卜确认为是和传统的CMS萝卜系不同的品系，并命名为“NWB-CMS”。
本发明的NWB-CMS萝卜系的植物体用当前行业所共知的一般的组织培养方法可无性生殖。比如，容易进行白菜，萝卜等的十字花科植物的组织培养的器官发生的微细增殖法(培养无形成器官的叶子，叶柄，茎节，子叶，子叶轴等的组织在上述组织的表面诱导新的芽眼的方法)，或者用通过诱导胼胝体的再分化方法等无性生殖。
具体地说，把本发明品系的种子在1/2MS培养基里平皿接种(plating)培养后，第四天除掉包含一些叶柄的子叶后把这些在MS培养基里分化并诱导胼胝体。然后，从上述胼胝体诱导芽(shoot)，形成芽的胼胝体移到根诱导培养基里后诱导生根。最后，经过土壤驯化和再分化过程成长为完全的植物体。2002年9月18日，本发明者把NWB-CMS萝卜系的胼胝体(callus)寄存到韩国生命工学研究院(Korea Research Institute of Bioscience &BiotechnologyKRIBB)的基因银行(保藏号KCTC 10339BP)。
根据本发明使上述NWB-CMS萝卜系的植物体和导入雄性不育的植物体(雄性可育萝卜系)杂交而生产F1种子。
本发明的杂交种子生产方法可适用于所有雄性可育系里，举例子来说有汉城春1523，汉城春1978，总太1642，珍珠大平340，时无1462，圣护院52，总太1968，总太2015，1934(义城半青和总太的分离系统)，Mn002，Mn003，YB-1，1825(青皮核总太的分离系统)，AD 1002，Mn006，三季春1634，宫重总太JA046，宫重总太JA048，宫重总太JA049，宫重总太JA053，宫重总太1642，宫重总太1921，宫重总太1923，宫重总太1929，宫重1706，晚抽宫重2004，晚抽总太1916，晚抽总太1917，晚抽总太1918，美浓2113，汉城春1861，汉城春2064，圣护院1877，圣护院1947，龙岘1709，圆白分离Mn005，圆白分离1935，总太1946等。
一方面，通过图1确认用传统的Ougra-以及Kosena-CMS系选择用DNA标记是不能选择本发明的NWB-CMS萝卜系，但是对上述Ougra-以及Kosena-CMS系独特的标记是无法区分本发明的NWB-CMS萝卜系和雄性可育系。由此，本发明人开发了对NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记的基础作业，在十字花科内存在的不同的CMS系之间RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)进行分析。
具体地说本发明对近缘种之间的细胞质区分很有用，并进行了提供丰富的统计资料的线粒体DNA的RFLP。在各系中抽出的总DNA用六个限制酶(BamHI，DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII，XbaI)分别切断并电泳后，进行Southern blot分析而比较RFLP式样。
这时所用的探针是在十字花科植物之一的阿拉伯芥(Nrabidopsis thaliana)里所澄清的32个线粒体基因(参照表二)。通过RFLP的结果搜寻引起不同的座位(polymorphic site)，确认所用探针的32个基因里atp6以及atp9基因的3′部分发生变异(参照图2以及图3)。
而且，比较各基因的RFLP式样(pattern)的结果是，nad3基因作为探针时，出现和atp6基因以及atp9基因作为探针的情况分别类似的条带(band pattern)(参照图4以及图5)。从这些结果推定在线粒体基因组里atp6基因以及atp9基因位于和nad3基因邻接的位置上。
本发明人参照上述RFLP分析结果，选择对NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记。为了这些，参照atp6基因以及nad3基因的碱基序列制造扩大atp6基因5′部分和nad3基因之间的正方向以及逆方向引物。上述引物分别命名为“ia6f”和“rn3f”，把这些的碱基序列用序列号码1以及2记载。利用上述引物，NWB-CMS萝卜系的DNA作为模板后进行PCR的结果是，只有NWB-CMS萝卜系里检测出约1.8kb大小的带(band)(参照图6的A)。
而且，参照atp9基因以及nad3基因的碱基序列制造扩大atp9基因的3′部分和nad3基因之间的正方向以及逆方向引物。上述引物分别命名为“ia9f”和“n31r”，把这些碱基序列用序列号码3以及4记载。其后，利用上述引物进行PCR的结果，只在NWB-CMS萝卜系里检测出约2.3kb大小的带(band)(参照图6B)。
此外，本发明人分析了对NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记的碱基序列。根据本发明的DNA标记之一的ia6f以及rn3f引物扩大的PCR产物的碱基序列记载为序列号码5。根据本发明的DNA标记的另一个ia9f以及n31r引物扩大的PCR产物的碱基序列记载为序列号码6。
本发明为了扩大序列号码5或者序列号码6的DNA标记而提供的标记引物包括当前行业可设计的所有引物。举一例来说，具有在本发明制造的用序列号码1以及2表示的碱基序列ia6f以及rn3f引物，然后用序列号码3以及4表示的碱基序列ia9f以及n31r引物。
本发明的NWB-CMS萝卜系选择试剂盒里包括的PCR反应混合物可含有PCR反应里所需要的一般物质，比如说Taq聚合酶(polymerase)，反应缓冲溶液，dNTP混合物，MgCl2，BSA和适当量的水等。而且，根据本发明的试剂盒，另外可包含确认PCR产物的检测与否的琼脂糖(agarose)和电泳缓冲溶液。
在作物育种里，不仅需要很多努力和经费，而且利用迅速性、准确性以及敏感性高的PCR技术检测DNA标记的话，目标性状选择将更准确。由此，利用本发明的引物(primer)进行PCR，并检测上述引物扩大的本发明的DNA标记的有无，所以NWB-CMS萝卜系选择更迅速、准确。
图1A是Ougra-CMS萝卜系用特殊的引物行PCR结果的凝胶体照片。
图1B是Kosena-CMS萝卜系用特殊的引物进行PCR结果的凝胶体照片。
其中图1A和图1B的各泳道如下泳道1白光泳道2新珍珠 泳道3YR拓洋泳道4献夏泳道5NWB1 泳道6NWB2泳道7MF1 泳道8MF2 泳道9萝卜的叶泳道10白玉春 泳道11圆白泳道12春作泳道13太白 泳道14红风1 泳道15红风2图2A是用EcoRI酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp6基因作为探针进行Southern blot的结果。
图2B是用XbaI酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp6基因作为探针进行Southern blot的结果。
图3A是用EcoRV酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp9基因作为探针进行Southern blot的结果。
图3B是用HindIII酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp9基因作为探针进行Southern blot的结果。
图4A是用EcoRI酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp6基因和nad3基因作探针进行Southern blot结果的比较。
图4B是用EcoRV酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp6基因和nad3基因作探针进行Southern blot结果的比较。
其中图4A和图4B的各泳道如下泳道1NWB1 泳道2NWB2泳道3白光 泳道4新珍珠泳道5MF1泳道6MF2图5A是用DraRI酶切各CMS萝卜系的DNA后，用atp6基因和nad3基因作探针进行Southern blot结果的比较。
图5B是用EcoRV酶切各CMS萝卜系的DNA后，把atp6基因和nad3基因作探针进行Southern blot结果的比较。
其中图5A和图5B的各泳道如下泳道1NWB1 泳道2NWB2泳道3白光 泳道4新珍珠泳道5MF1泳道6MF2图6A是根据本发明的ia6f以及rn3f的引物进行PCR的结果的凝胶体照片。
图6B是根据本发明的ia9f以及n31r的引物进行PCR的结果的凝胶体照片。
其中图6A和图6B的各泳道如下M分子量标记泳道1NWB1 泳道2NWB2泳道3白光泳道4新珍珠 泳道5夏童泳道6YR拓洋泳道7献夏 泳道8Huyumine泳道9萝卜的叶泳道10白玉春泳道11春作 泳道12太白泳道13红风1 泳道14红风3 泳道15圆白泳道16MF1 泳道17MF2泳道18小松菜泳道19Donskya 泳道20Jasai 泳道21Anand
泳道22绿风3泳道23秋强图7是根据本发明的ia6f以及rn3f引物(黑色用阴影的斜体表示)扩大的部位，包括引物序列的用灰色阴影表示的碱基序列(226-999以及2290-2645)分别表示atp6基因和nad3基因。
图8是本发明的ia9f以及n31r引物(黑色用阴影的斜体表示)扩大的部位，包括引物序列的用灰色阴影表示的碱基序列(102-321以及2596-2640)分别表示和atp9基因以及nad3基因类似的部分。
具体实施例方式
以下，根据实例详细地说明本发明。
但是，如下实例只是举例本发明而已，本发明的内容并不仅限制在如下实施例里。
实施例1NWB-CMS萝卜系的开发以及利用它进行杂交种子的生产本发明人为了开发具有新的基因型的CMS的萝卜，把中国吉林省地区的野生青皮萝卜100多种作为对象，调查花器组织的花粉发育以及自花授粉后一次性的选择判定为拥有雄性不育特性的萝卜20种。其后，已选萝卜作为对象再一次进行第二次调查而最终选择拥有CMS特性的一个萝卜。这时把和雄性可育系进行杂交后生产的F1个体再一次和雄性可育系进行回交而生产F2，然后调查生产的F2个体的花粉生成而进行CMS的确认。
其后，本发明人为了确认选择的CMS萝卜系是否为F1的杂交亲本，而与需要导入雄性不育的育种系进行杂交实验。这时，要导入CMS的育种系使用如下表1里记载的16种类的育种系(韩国(株)NONGWOO BIO公司)，对照群是使用主要用在生产传统杂种种子的Ougra-CMS萝卜系。这时上述Ougra-CMS萝卜系使用白光(韩国兴农种子(seeds))，献夏(日本sakada种子)以及Huyumine(日本sakada种子)。生产的F1种子里导入雄性不育是通过调查花器组织的花粉发育以及自花授粉程度来确认。在用Ougra-CMS萝卜系的实验(对照群)里，在一个Ougra-CMS萝卜系(白光)里明确地确认CMS已导入时，其他Ougra-CMS系(献夏以及Huyumine)没有进行杂交实验。
其结果，如下表1里记载的所示，把Ougra-CMS萝卜系作为杂交样本时，在16种类的育种系里只有约50％程度出现雄性不育，此外可确认Ougra-CMS萝卜系的CMS导入与否按品系具有显著的差异。
另一方面，在本发明选择的CMS萝卜系作为杂交亲本时在16种类的所有育种系里出现雄性不育系。而且，和宫重总太JA046、宫重总太JA048、宫重总太JA049、宫重总太JA053、宫重总太1642、宫重总太1921、宫重总太1923、宫重总太1929(一般种，日本)，宫重1706(一般种，日本)，晚抽宫重2004(一般种，日本)，晚抽总太1916、晚抽总太1917、晚抽总太1918(一般种，日本)，美浓2113(一般种，日本)，汉城春1861、汉城春2064(农友BIO，韩国)，圣护院1877、圣护院1947(Sakada，日本)，龙岘1709(一般种，中国)，圆白分离Mn005、圆白分离1935(南京市蔬菜种子公司，中国)，以及总太1946(一般种，日本)的杂交实验里雄性不育系统也达100％。
本发明选择的CMS萝卜系的雄性不育导入率比传统的Ougra-CMS萝卜系更优秀。而且，本发明选择的CMS萝卜系作为生产F1杂交种子的杂交亲本更优秀。
表1按萝卜系CMS导入与否的判别
*S不育性(sterile progenies)，F可育性(fertile progenies)Seg.不育性和可育性都出现(segregating progenies)N.T不进行杂交实验实施例2本发明选择的CMS萝卜系的CMS基因型确认通过和其它品系杂交CMS导入的能力，通过实施例1确认在实施例1里选择的CMS萝卜系比传统的Ougra-CMS萝卜系更优秀。本发明人为了确认上述CMS萝卜系是否和传统的CMS萝卜系同样，或者是是否为新的CMS系，使用Ougra-以及Kosena-CMS萝卜系的选择用引物进行PCR。
2-1)使用Ougra-CMS萝卜系作引物进行PCR。
首先，从本发明选择的CMS萝卜系里分离DNA后，把这些作为模板，利用具有以序列号码7以及8表示的碱基序列的引物进行PCR。PCR使用韩国(株)BIONEER公司的PCR试剂盒(AccuPower Premix)而执行。
反应条件是在95℃里5分钟进行前变性(pre-denaturation)后，在95℃里30秒；在55℃里30秒；以及在72℃里1分钟的周期反复30回后，最终在72℃里10分钟反应。这时作为对照群使用十种类的Ougra-CMS萝卜系，无法确认基因型的CMS系(圆白)，还有2个种类的雄性可育系(MF1以及MF2)，对这些信息记载在表4里。其后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。
其结果，如图1A里所示，在现有的Ougra-CMS萝卜系里检测出540bp大小的带(band)，但是根据本发明的CMS萝卜系里没有检测出。而且，雄性可育系MF1和MF2以及没有明确基因型的雄性不育系圆白里也没有检测出带(band)。
2-2)使用Kosena-CMS萝卜系作引物进行PCR使用具有以序列号码9以及10表示的碱基序列的引物按照和上述参考例2-1)同样的方法进行PCR。这时对照群使用和上述参考里2-1)同样的萝卜系。使用上述引物进行PCR时，报告为Kosena-CMS萝卜系的情况是检测出约250bp大小的带(band)，Ougra-CMS萝卜系的情况是检测出约278bp大小的带(band)(Yamagishi et al.，Theor Appl Genet.，93325-332，1996)。
其结果，如图1B所示，在Ougra-CMS萝卜系里检测出约278bp大小的带，而根据本发明的CMS萝卜系和雄性可育系里没有检测出对Kosena-以及Ougra-CMS系独特的带。
从上述结果可确认本发明的CMS萝卜系和传统的Ougra-以及Kosena-CMS系是不同的品系，把这些命名为“NWB-CMS”。
实施例3NWB-CMS萝卜系的胼胝体诱导以及再分化本发明的NWB-CMS系的种子在1/2MS培养基里平皿接种而培养后，第四天除掉包括一些叶柄的子叶，并把这些在MS培养基(包含玉米素(zeatin)5mg/L，NAA0.1mg/L)里分化后诱导胼胝体。胼胝体在芽诱导培养基里诱导芽后，形成芽的胼胝体转移到根诱导培养基里一星期期间诱导生根。
其后，选择诱导生根的植物体，洗净沾在根里的培养基后，转移到装满已杀菌土壤的花盆后种植。这时一星期里用塑料覆盖花盆而使它慢慢适应环境，约一个星期以后拿掉塑料并完全再分化为植物体。2002年9月18日，本发明者把NWB-CMS萝卜系的胼胝体寄存到韩国生命工学研究院基因银行里(保藏号KCTC 10339BP)。
实施例4利用RFLP方法对NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记通过上述实例1和2，本发明人确认NWB-CMS萝卜系和传统的CMS系完全不同，而且对Ougra-以及Kosena-CMS萝卜系独特的标记无法区分雄性可育系以及未明确CMS基因型的品系(圆白)和NWB-CMS系。由此，本发明人为了开发对NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记而进行RFLP。
4-1)为RFLP的探针制造CMS是细胞质内的线粒体，它不能执行正常的功能且形成非正常的花粉使植物不具备自花授粉能力的现象。对此，本发明人使用在阿拉伯芥里已知的线粒体基因作为RFLP的探针而通过如下的实验制造探针。
首先，参考如下表2里记载的32个阿拉伯芥的线粒体基因的碱基序列而制造引物，各引物的序列记载在如下表3里。32个基因的碱基序列和这些的基因信息是参考Unseld等的论文(Unseld，M.etal.Nature Genetics，1557-61，1997)以及Genbank的注册号码NC_001284。
其后，从NWB-CMS萝卜系分离DNA后，把这些作为模板进行PCR。PCR是利用(株)BIONEER的PCR试剂盒(AccuPower Premix)而进行的。PCR在94℃里5分钟进行前变性(pre-denaturation)后，在94℃里30秒；在55℃里30秒；以及在72℃里2分钟把周期反复35回以后，在72℃里10分钟最终扩展(extension)后终结反应。其后，把PCR产物通过凝胶洗脱(gel elution)分离。在32个基因如下表3的25号orf240基因是把NWB-CMS萝卜系的DNA作为模板时PCR不能扩大，所以把阿拉伯芥的DNA作为模板进行PCR。
表2在RFLP分析中用探针使用的32个线粒体基因
表3对32个线粒体基因的引物的碱基序列
*F正方向引物，R逆方向引物4-2)RFLP分析作为开发对NWB-CMS萝卜系独特的DNA标记的基础作业，分析十字花科内存在的不同的CMS系之间的RFLP。为了这些，使用包括NWB-CMS系的如下表4的1-8以及15-17号的雄性不育以及雄性可育系作为实验对象。
从各品系中按照当前行业共知的DNA分离方法分离总DNA后，把它们分别用6个限制酶(BamHI，DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII，XbaI)消化。消化的DNA在琼脂糖凝胶里进行电泳后，将其移到尼龙薄膜里并进行Southernblot分析。这时所用的探针是上述实施例4-1)里得到的32个线粒体基因。如此进行RELP而比较对32个基因的RFLP式样。
表4根据本发明的DNA标记选择里利用的萝卜和白菜系
其结果，作探针使用的32个基因里有19个基因没有出现多形性(NWB-CMS萝卜系里独特的带)(未图示结果)。而剩下的13个基因里，除了atp6以及atp9基因的11个基因作为探针的情况是6个限制酶里只有2个以内的限制酶里出现了多形性，由此推定是根据单纯的点突变而出现。
但是，把atp6基因作为探针使用时，6个限制酶中的5个限制酶BamHI，DraI，EcoRI，EcoRV以及XbaI里出现了多形性，其中EcoRV以及XbaI的结果分别显示在图2A和图2B里。
而且，把atp9基因作为探针时，在DraI，EcoRI，EcoRV以及HindIII的4个限制酶里出现了多形性，其中EcoRV以及HindIII的结果分别显示在图3A和图3B里。因此atp6以及atp9基因时出现的多形性不是根据单纯的点突变，而是根据线粒体基因组内的基因再组合，缺失或者插入而出现的。
一方面，各品系的DNA用EcoRI和EcoRV分别酶切后，atp6基因以及nad3基因用作探针并进行Southern blot分析时，在NWB-CMS萝卜系里出现类似大小的带(参照图4A和图4B)。从这些结果推定atp6基因和nad3基因在线粒体基因组里位于互相邻接的位置上。
而且，各品系的DNA用DraII和EcoRV分别酶切后，atp9基因和nad3基因作为探针并进行Southern blot分析的结果是，DraI的情况是在所有品系里出现类似的带形态(参照图5A)，EcoRV的情况是在Ougra-CMS萝卜系里出现类似大小的带(图5B)。从这些结果推定atp9基因和nad3基因也是在线粒体基因组里位于互相邻接的位置上。
实施例5NWB-CMS萝卜系选择用引物的制备本发明者通过上述实例4确认atp6基因和atp9基因的ORF(open readingframe)里发生了变异。而且，nad3基因和atp6基因以及atp9基因分别显示出类似的RFLP式样时，推定nad3基因和atp6基因以及atp9基因在线粒体基因组里位于邻接的位置上。由此，本发明人参考上述3个基因的碱基序列而制备扩大推定为发生变异部分的碱基序列。
首先，制备扩大的atp6基因的5′部分和nad3基因之间的正方向以及逆方向引物。制得的引物分别命名为“ia6f”和“rn3f”，其碱基序列用序列号码1以及2记载。而且，制备扩大的atp9基因的5′部分和nad3基因之间的正方向以及逆方向引物。制作的引物分别命名为“ia9f”和“n31r”，其碱基序列用序列号码3以及4记载。
实施例6利用本发明引物的白菜和作物的PCR分析本发明人为了确认上述实施例5里制得的引物是否扩大对NWB-CMS萝卜系独特的PCR产物而进行如下的实验。所用的实验材料是上述表4里记载的萝卜和白菜的雄性可育以及雄性不育系。
6-1)使用ia6f以及rn3f引物的PCR首先，将在各品系里分离的DNA作为模板，利用具有用序列号码1以及2记载的碱基序列的ia6f以及rn3f引物进行PCR。PCR是利用(株)BIONEER公司的PCR试剂盒(AccuPower Premix)而执行。反应条件是在95℃里5分钟进行前变性后，在95℃里1分钟；在55℃里1分钟；以及在72℃里2分钟的周期反复30回后，在72℃里10分钟最终反应。其后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。其结果，如图6A所示，只在NWB-CMS萝卜系里检测出约1.8kb大小的独特的带。
6-2)使用ia9f以及n31r引物的PCR除了使用具有以序列号码3以及4记载的碱基序列的ia9f以及n31r引物以外，按照和上述实例6-1)同样方法进行PCR。其结果，如图6B所示，只在NWB-CMS萝卜系里检测出约2.3kb大小的独特的PCR产物。虽然在雄性可育系绿风3和秋强里也检测出PCR产物，但是这些PCR产物与在NWB-CMS萝卜系里出现的PCR产物大小不同，由此可确认在雄性可育系里扩大的PCR产物和在NWB-CMS萝卜系里扩大的PCR产物不同。
实施例7根据本发明的引物扩大的PCR产物的序列分析委托(株)BIONEX公司分析在上述实施例6里得到的2个PCR产物的碱基序列。根据ia6f以及rn3f引物扩大的PCR产物的碱基序列的分析结果是，atp6基因和nad3基因相差大约1290bp距离程度。上述两个引物扩大atp6基因和nad3基因间的距离(参照图7)。根据ia6f以及rn3f引物扩大的PCR产物的整个碱基序列用序列号码5记载。
而且，根据ia9f以及n31r引物扩大的PCR产物的整个碱基序列的分析结果是，上述两个引物和本发明人预想的不同，没有扩大atp9基因和nad3基因间的距离。只是，上述PCR产物的序列里包括n31r引物的碱基序列的附近存在和nad3基因类似的碱基序列(图8的碱基序列中相应2596～2640的序列)(参照图8)。根据ia9f以及n31r引物扩大的PCR产物的整个碱基序列用序列号码6记载。
如以上所述，本发明具有提供新的基因型CMS萝卜系的胼胝体，利用它进行物体和杂种种子的制造方法以及NWB-CMS萝卜系的植物体选择用DNA标记的效果。根据本发明的NWB-CMS萝卜系的胼胝体对F1植物体的雄性不育导入率很高，所以在生产CMS系的杂交种子发面应用广泛。此外，独特的DNA标记而具有检测容易的优点。
序列目录<110>株式会社农牛BIO<120>一种萝卜系胼胝体和用它培育植物体及杂交种子的方法<130>PI034733<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>ia6f primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>1cgcttggact atgctatgta tgaatgag 28<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>rn3f primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>2gacgattgga tttctctatg agtggaaaa29<210>3<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>ia9f primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>3ctctaaccga agctattgca ttgtttg 27<210>4<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223>n31r primer for PCR of DNA marker specific to NWB-CMS<400>4gctagtttct ttgatcctac tcggtgttcc 30<210>5<211>1785<212>DNA<213>Raphanus sativus<400>5cgcttggact atgctatgta tgaatgagat tttctatttt ataggggctc ttggtccttt 60atttatagtt cttgcattaa ccggtctgga attaggtgta gctatattac aagcttatgt120ttttacgatc ttaatctgta tttacttgaa tgatgctata aatctccatt aaagttcttc180tttctttcat ttagatttat aattgaacaa aagcgaggga tgagagtagt gttatttaga240gcagttacac agcccctctc cttgcagtcg agttgctaaa gcacctctcc tttgctgttc300gagtaaacaa gaaatgctcg agttactaaa caacccctag ggggcccctc tctgataagg360aaaaaaacga aaaaatctca aatttatgaa aaatcgactc caatggctgt tacccctgct420cggtagtttg atcggtttcg ttttcagacg ttttctagaa tcagaaggaa gcgctattct480gaccactacg tgcgtttcat tcttcgcgct agtgagcttc tccttttgtt ttagtcactt540tcgtttgaaa ggaccactga gggggattct caatctcttc ttactctttt ccgctgggtt600cgtgggatct ttcatacgga ttgaagtcat ccacctactg ggtggtcagg ctttgcccct660cctgttggga ccttttgttt ggaaggccgt agtaggggaa gcacttcctt ctacgggccc720taacggggcg gagagctcct ccacgtggga ggaggatccg tttgaactgg acgttctcga780ggaatcattc tcggactccc cccggcaggg agtcccagac ggaagagagt gaaccctcgg840tcaatcgacg tagctcgagg caccccaaac ggaagagggt gaaccctcgg taaatcggcg900gggtcccagg aagctgggcc tgcgctccag ctaatccagt cccttccggg gggacgaagc960tgggccatct gtctcctatc cctacagaag ggatgaaatg attggggggg atagcgtgga1020ggcgatagaa cgccgccttc tggctcgatt tgcttatccc ttatactcgg acatccaatt1080agcccacatt caagccgaaa gactcttcga ggtcaaggta gagattgtga aggtaatggc1140tggccttgat ccaacggggg attggatggg gcggggagct cgggccctcg acaatccccg1200taccgccacg ggagagcact ccgtgaagca gttataccac ctgttaagtg ctctaaatga1260gcgcggtaaa gaggccccag aatttcagga actcaaaaat agagtgttcc tcaagaaagg1320cggccctggg ggggactcta tcgcataagt aagcaagcta cctttcggga tgggcttttg1380cttctttctt tatttttcga tatgccgctt cttcgccagc aaggagcgag aaaacaaagt1440gggctgtaat gatgtcagaa tttgcaccaa tttctatcta tttagtgatt agtctgctag1500tttctttgat cctactcggt gttccttttc catttgcttc caatagttct acctacccag1560aaaaattgtc ggcctacgaa tgtggtttcg atccttccgg tgatgccaga agtcgtttcg1620atatacgatt ttatcttgtt tcaattttat ttttaatccc tgatctggaa gtcacctttt1680tctttccttg ggcagtacct cccaacaaga ttgatctgtt tggattttgg tccatgatgg1740cctttttatt tattttgacg attggatttc tctatgagtg gaaaa1785<210>6<211>2379<212>DNA<213>Raphanus sativus<400>6ctctaaccga agctattgca ttgtttgccc caatgatggc ctttttgatc ttattcgtat 60tctgatcgaa gaaggaaggt ttcattcagt ctcataaagc aagcacctct ttcacataag 120aaagtggagg caggcttgga tacgatctaa aatgattcca catgaaagag gaccgggcaa 180tcgccctctt gagtaatggg aagcgggcta gtccccgaaa atgcccgtta atcaagcaag 240ttggggaaca aaatcttcct tgttagttac tcatttcttc ggtcgagcgt tctccggacg 300tcgagaaatc tatcactcaa tcgctggccg ctctgtcatt gtctgatttt aggtttctga 360tcacactcga aattatgtat ctacttatcg tatttttacc cctgctcggt agttccgtag 420caggtttttt cggacgtttt ctaggatcag aaggaagcgc tattctgacc actacgtgcg 480tttcattctt cgcactggtg ggcttcctat ttggatttca catttcttcc tttcgtttga 540aaggaccact gagggggatt ctcaatctct tcttgctctt tttcatcgcc gtagtaatat 600ctttgatacg gatcaaagtc atccacctac tgggtggtca ggctttgccc ctgttggagc 660ccattatatg ggctgcagta ggagggggag cacttccttc tacgggccct aacggggcgg 720agagggacgc catgtgggag gaggatgact ttgaactttg agttctcgag gaatcattct 780cggactcccc cccggcaggg agtcccagac ggcagagggt gaacctcggt caatcagctt 840cctccccagg aagctgggcc atctgtcccc tatcaggacc agggcctacc tactgatagg 900aatggtaacc cgatggatct taatgctcgg ccctccctct cgtcgttgta caacgaaata 960gagagttccg actctttacg agcgcggaat ctccaattgg gggaggatct ggagcgaatc1020catgaaatgg aacggaacct ccagaacgag agggatcccg accgtcgtcg ggaagtagcc1080gcgcgcatag atcgggaggt gcgcgagctg gagcgacaaa tttcctctgt caaacccggg1140atgcagttcg ggatgatcaa ctggacgtat ggagggaggg gctttatgag gaattagcaa1200cgcaagggga gaaacaggcc cgccttacgt tactaaattc gtggctcaag gtgatcatcc1260atacacggaa tcaccaaccc cccaaaaact aaagctttcg ttctcttctt ttttttttac1320ttgattggca ggtgtacaac aaccttaacc gcgcaagcct gggctgggcc tacctccatc1380cttagaggag ccgtatgagg cggaagcccc acgtacggtt ttgaagccga gcctttccag1440caatggggct tagggaccga tatgatgatt ggtttaggta gggcggccgg cctactacgg1500gcacccgcct gtagggatta gtgcgtgaga ccgcgatcca caaactgacg catgggactc1560accctttact tgagaataaa gaggggaaag atagcatgtc ccaagagcga ggcgagtttt1620ggaaccctac agcgagaggg acgcctcgcg agccgggctt ccagagatga ggccttttgg1680cgaagccaag tttctttcgg gccaccaaac cctgcaactg atgagaaaga aggccctatg1740gggtaaaggg aaaagcgtgt acgttgtcac actccctgcc ttccaaaggt gcctagagga1800cgggccagac gcagcagagc gacaacccgg gagcagattc cccaccggca gggggacagg1860agacggccat 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at 22<210>10<211>22<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>3’primer for PCR of DNA marker specific to Kosena-CMS<400>10agcaattggg ttcacaaagc at
权利要求
1.一种NWB-CMS萝卜系的胼胝体，于2002年9月18日保藏于韩国KCTC，保藏号为KCTC 10339BP，它具有细胞质雄性不育特性，并且包含序列号5和序列号6以及序列号5或序列号6的碱基序列。
2.一种以权利要求1所述的胼胝体进行组织培养而无性生殖的NWB-CMS萝卜系植物体的培育方法。
3.根据权利要求2所述的NWB-CMS萝卜系植物体的培育方法，包括如下几个步骤(a)从第一项的胼胝体诱导芽的阶段；(b)在形成上述芽的胼胝体里诱导生根的阶段；以及(c)形成上述生根的胼胝体经过土壤驯化和再分化过程后形成植物体的阶段。
4.一种CMS萝卜系杂交种子的生产方法，其特征在于，将权利要求2或3制得的NWB-CMS萝卜系植物体和要导入雄性不育的雄性可育萝卜系植物体杂交。
5.根据权利要求4所述的CMS萝卜系杂交种子的生产方法，其特征在于，所述的雄性可育萝卜系选自汉城春1523，汉城春1978，总太1642，晋州大坪340，时无1462，圣护院52，总太1968，总太2015，1934，Mn002，Mn003，YB-1，1825，AD 1002，Mn006，三季春1634，宫重总太JA046，宫重总太JA048，宫重总太JA049，宫重总太JA053，宫重总太1642，宫重总太1921，宫重总太1923，宫重总太1929，宫重1706，晚抽宫重2004，晚抽总太1916，晚抽总太1917，晚抽总太1918，美浓2113，汉城春1861，汉城春2064，圣护院1877，圣护院1947，龙岘1709，圆白分离Mn005，圆白分离1935以及总太1946组成的群组。
6.一种NWB-CMS萝卜系植物体的选择用DNA标记，具有用序列号码5或者序列号码6表示的碱基序列。
7.一种扩大权利要求6的DNA标记的引物。
8.根据权利要求7所述的引物，其特征在于，所述的引物为在序列号码1至序列号码4里用任意一个表示的碱基序列为特点的引物。
9.一种NWB-CMS萝卜系植物体的选择试剂盒，包括权利要求7或8的引物和PCR反应混合物。
全文摘要
本发明涉及一种NWB－CMS萝卜系的胼胝体，它具有新的基因型细胞质雄性不育(CMS)特性，并且包含序列号5和序列号6以及序列号5或序列号6的碱基序列。本发明还涉及将上述胼胝体诱导，利用组织培养而无性生殖的NWB－CMS萝卜系植物体的制造方法，以及使用上述植物体和导入雄性不育植物体杂交为特点的有关杂种种子的制造方法。
文档编号A01H1/02GK1488243SQ0315555
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月28日 优先权日2002年10月10日
发明者闵炳桓, 南奭铉, 李熙正, 李时雨, 梁承均 申请人:株式会社农牛Bio