专利名称：一种无菌培养沉水植物的方法
技术领域：
本发明涉及生物、园艺、环境生态工程领域，更具体涉及一种无菌培养沉水植物的方法。
背景技术：
随着水体富营养化的加剧而引起有害藻类水华的频繁发生，水生态系统受损，已成为国内外普遍关注的环境问题。治理湖泊污染，恢复湖泊生态系统健康是十分重要而又复杂的问题。业已证明，水生高等植物能有效地净化富营养化湖水。选择生态适应性广，具有一定耐污能力，对水质净化能力强，繁殖、栽培容易的大型沉水植物和挺水植物，进行科学配置，恢复水生植被，提高水生态系统的环境容量和自净能力，以改善水生态环境，已成为一种治理富营养化水体的有效手段。但是由于很多沉水植物种子少、自然条件下难以萌发，一些营养体难以再生，再加上受气候、季节等自然条件的影响以及各种人为因素的干扰，自然繁殖的幼苗数量极为有限，不能满足目前的大量需要。另外，一些科研工作要求能够培养沉水植物的无菌苗，以满足特殊实验如毒理学测试(细菌会分解毒素，故必须用无菌苗)等需要。组织培养由于其苗木繁殖速度快，操作简单，经济实惠等优点已在陆生植物的快繁中得到广泛的应用。
但是沉水植物的生存环境不同于陆生植物和浮游植物，适用于陆生植物的固体培养基由于不能提供充足的水份而不适宜于沉水植物，适用于浮游植物的液体培养基则不能提供沉水植物根系扎根的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无菌培养沉水植物的方法，该方法既能提供沉水植物根系扎根的需要，又能提供沉水植物生长所必需的充足水分和营养，能快速、大量生产沉水植物无菌苗。
为了达到上述目的，本发明采用了一种利用固、液双层培养基来无菌培养沉水植物的方法，具体实施步骤如下A.外植体(任何沉水植物的外植体均适合)的清洗与消毒流水冲洗外植体5-15min，70-95％酒精处理30-90sec，1-3％NaClO浸泡8-30min后，用无菌的蒸馏水洗3～4次，每次用20-30mL无菌水清洗3min-5min；B.固、液双层培养基的配制与灭菌MS液体培养基的配方为KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，MgSO4.7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2.2H2O 440mg/L，MnSO4.4H2O 22.3mg/L，H3BO36.2mg/L，FeSO4.7H2O 8.6mg/L，CoCl2.6H2O 0.025mg/L，ZnSO4.7H2O 8.6mg/L，NaMoO4.2H2O 0.25mg/L，CuSO4.5H2O 0.025mg/L，Na2.EDTA.2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，蔗糖30g/L。MS固体培养基为液体培养基基础上加入0.8％-1.2％的琼脂。培养基的PH值为5.5-6.5。在100ml的三角瓶底层加入20-30mL上述培养基，于120℃湿热灭菌20min。待琼脂凝固后，在固体培养基表面加入10-20ml灭菌过的上述液体培养基；C.外植体的种植在固体培养基表面植入经上述方法消毒过的外植体，每个三角瓶可植入10-30个外植体；D.培养条件的确定与培养把植有外植体的三角瓶置于培养室或光照培养箱中培养，培养条件为温度18-28℃，光暗周期L∶D＝16∶8，光强20-80μE.m-2.s-1；E.待幼苗长到与液体培养基同一水平面时加入10-20mL的液体培养基，每1个月更换培养基1次。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果方法易行，操作简便，安全可靠，既能提供沉水植物根系扎根的需要，又能提供沉水植物生长所必需的充足水分和营养，能快速、大量生产沉水植物无菌苗。
具体实施例方式
一种利用固、液双层培养基来无菌培养沉水植物的方法，具体实施步骤如下以一种沉水植物苦草、马来眼子菜和黑藻为例，说明该方法的具体实施步骤
1.苦草、马来眼子菜和黑藻种子的清洗与消毒流水冲洗苦草、马来眼子菜和黑藻种子10min，75％酒精处理30sec，2％NaClO浸泡10min后，用无菌的蒸馏水洗4次，每次用30mL无菌水清洗3min；2.固、液双层培养基的配制与灭菌MS液体培养基的配方为KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，MgSO4.7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2.2H2O 440mg/L，MnSO4.4H2O 22.3mg/L，H3BO36.2mg/L，FeSO4.7H2O 8.6mg/L，CoCl2.6H2O 0.025mg/L，ZnSO4.7H2O 8.6mg/L，NaMoO4.2H2O 0.25mg/L，CuSO4.5H2O 0.025mg/L，Na2.EDTA.2H2O 37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L。MS固体培养基为液体培养基基础上加入1.0％的琼脂。在100ml的三角瓶底层加入30mL上述培养基，于120℃湿热灭菌20min。待琼脂凝固后，在固体培养基表面加入10ml灭菌过的上述液体培养基，培养基的PH值为6.0；3.种子的种植在固体培养基表面植入经上述方法消毒过的苦草、马来眼子菜或黑藻种子，每个三角瓶可植入30粒种子；4.培养条件的确定与培养把播有苦草、马来眼子菜或黑藻种子的三角瓶置于光照培养箱中培养，培养条件为温度25℃，光暗周期L∶D＝16∶8，光强40μE.m-2.s-1；5.待种子萌发，幼苗长到0.5cm后，再加入20mL的上述液体培养基，每一个月彻底更换培养基一次。
权利要求
1.一种无菌培养沉水植物的方法，它包括下列步骤A、外植体的清洗与消毒流水冲洗外植体5-15min，70-95％酒精处理30-90sec，1-3％NaClO浸泡8-30min后，用无菌的蒸馏水洗3-4次，每次用20-30mL无菌水清洗3-5min；B、固、液双层培养基的配制与灭菌MS固体培养基为MS液体培养基基础上加入0.8-1.2％的琼脂，在100ml的三角瓶底层加入20-30mLMS液体培养基，于120℃湿热灭菌20min，待琼脂凝固后，在固体培养基表面加入10-20ml灭菌过的MS液体培养基，培养基的PH值为5.5-6.5；C、外植体的种植在固体培养基表面植入经上述方法消毒过的外植体，每个三角瓶可植入10-30个外植体；D、培养条件的确定与培养把植有外植体的三角瓶置于培养室或光照培养箱中培养，培养条件为温度18-28℃，光暗周期L∶D＝16∶8，光强20-80μE.m-2.s-1；E、待幼苗长到与液体培养基同一水平面时加入10-20mL的液体培养基，每1个月更换培养基1次。
全文摘要
本说明公开了一种无菌培养沉水植物的方法，该方法包括下列步骤1.外植体(任何沉水植物的外植体均适合)的清洗与消毒；2.固、液双层培养基的配制与灭菌待琼脂凝固后，在MS固体培养基表面加入灭菌过的MS液体培养基；3.外植体的种植；4.培养条件的确定与培养。该培养方法既能提供沉水植物根系扎根的需要，又能提供沉水植物生长所必需的充足水分和营养，能快速、大量生产沉水植物无菌苗，给生产和科研解决了一个难题。
文档编号A01G31/00GK1561687SQ20041001286
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月20日 优先权日2004年3月20日
发明者刘永定, 尹黎燕, 黄家权, 李敦海, 沈银武 申请人:中国科学院水生生物研究所