专利名称：含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防和治疗用生物制品，尤其涉及用硫柳汞作防腐剂的生物制品。
背景技术：
目前很多生物制品采用硫柳汞作防腐剂，其目的在于杀灭在制造过程和/或使用过程中可能出现的偶尔的微生物，或抑制微生物在生物制品中的生长。硫柳汞作为一种抗微生物制剂，含有49.6％的汞，代谢后变成二乙基汞和硫基水杨酸盐。采用硫柳汞作为防腐剂预防生物制品的细菌或其它微生物污染始于20世纪30年代，至今已沿用70多年，根据报道，生物制品中的硫柳汞是接种生物制品后引起迟发性过敏反应和皮肤过敏反应的主要原因之一。但是随着时间的推移，人们开始怀疑使用硫柳汞可能存在某些其它安全隐患。有文献指出高含量的汞在关键的发育期是一种神经毒剂，并且研究表明含有硫柳汞的疫苗会使新生儿体内的汞含量增高(参见《生物制品快讯》，2000年第3期，摘自Vaccine Weekly，2000，May 24，p10)；还有文献指出大剂量硫柳汞可引起神经和肾脏毒性。EPA(美国环境保护管理局)和WHO(世界卫生组织)分别作出关于汞的安全水平规定为0.7μg/kg体重/周和3.3μg/kg体重/周。据统计，在美国，婴儿出生14周内接种3剂百白破疫苗(相当于含75μg二乙汞)、乙肝疫苗(相当于含37.5μg二乙汞)、Hib(B型嗜血杆菌)疫苗(相当于含75μg二乙汞)，二乙汞总量高达187.5μg，超过了各机构界定的高限(参见《国外医学，预防、诊断、治疗用生物制品分册》，2000，23(3)，pp105-107，译自Wkly Epidem Rec 2000；75(2)12-16)。1999年国际疫苗顾问委员会组织的有关硫柳汞的会议认为婴儿缺乏去除汞的能力。2002年的全球疫苗安全咨询委员会第六次会议作出关于疫苗安全的结论中提及乙肝疫苗中的硫柳汞可能与美国加利福尼亚州334名儿童急性淋巴细胞性白血病有关(参见《国外医学》，2002年第3期第128-130页，译自Wkly Epidem Rec 2002；77(47)389-394)。但由于目前还没有经过试验的、有效的和安全的替代品，WHO仍然继续推荐使用含有硫柳汞防腐剂的疫苗，如百白破、白喉破伤风、破伤风类毒素和某些品牌的乙肝疫苗、B型嗜血杆菌疫苗。
FDA(美国食品药品管理局)和EMEA(欧洲药物管理局)要求企业在婴幼儿使用的疫苗中减少或不用硫柳汞，如美国默克公司(Merck)和史克公司(SmithKline Beecham)的无硫柳汞乙肝疫苗。其中史克公司的无硫柳汞乙肝疫苗在生产的前期加入了硫柳汞，在后期为保证最终产品无硫柳汞进行了去除硫柳汞的处理(参见“史克”乙肝疫苗的说明书)。但无硫柳汞的生物制品对生产环境的洁净度和无菌操作要求很高，从而造成生产制作成本高；而另一方面还存在不含硫柳汞防腐剂在使用过程中微生物污染的风险。尤其是在多剂剂型疫苗中，如果在疫苗中停止使用硫柳汞，则多剂疫苗瓶污染的危险性增加，使儿童处于发生中毒性休克综合症的危险之中(参见《国外医学》，2002年第3期第128-130页，译自Wkly Epidem Rec2002；77(47)389-394)。WHO也强调，由于实施上的限制和价格昂贵，美国对新生婴儿使用无硫柳汞疫苗的方案不适合于发展中国家(参见《国外医学》，2000，23(3)译自WklyEpidem Rec 2000；75(2)12-16)。
目前国内的含硫柳汞的生物制品中硫柳汞含量在50-100微克/毫升之间，如取消硫柳汞等防腐剂，现行生物制品将不能同时满足较好的安全性和较低的制作成本的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，在具有足够的安全性的前提下，大幅度降低生物制品中的硫柳汞含量，利用现有的生产条件，提供较为廉价的生物制品。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是，提供一种含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其中硫柳汞防腐剂的含量为0.5-10微克/毫升；优选值为1-5微克/毫升；最优选值为1-2微克/毫升。所述生物制品包括预防用生物制品，如乙型肝炎疫苗，狂犬疫苗、百白破疫苗等，和治疗用生物制品，如乙肝免疫球蛋白，人狂犬免疫球蛋白等。所述的制剂可以单剂剂型或多剂剂型。
同现有技术相比较，采用本发明的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其硫柳汞含量仅为现行标准的几十分之一，将大大降低对使用者特别是对婴幼儿带来的潜在危害，并且可利用现有设备和车间进行生产，制作成本低。
具体实施例方式
以下对本发明作进一步详述。
为了选择、确定生物制品中硫柳汞的合适浓度，我们选择了乙肝疫苗和美国Difco公司的大豆酪素消化培养基(符合USP《美国药典》标准)这两种最具有代表性的基质，加入不同含量硫柳汞来进行灭菌抑菌效果试验，以便从中找出最佳的硫柳汞含量。乙肝疫苗是目前世界上销售量最大的疫苗，仅在中国，每年乙肝疫苗的销售量就达到1亿支以上。而大豆酪素消化培养基则是中国和世界卫生组织GMP《药品生产质量管理规范》验证指南中规定的无菌分装验证用培养基。
一、超低浓度硫柳汞在乙肝疫苗中的灭菌抑菌试验1、试验方法对不同浓度硫柳汞在乙型肝炎疫苗中的灭菌抑菌效力进行挑战性试验测定，试验方法参考美国药典(USP 24 Microbiological Tests/Antimicrobial-Effectiveness Testing)和英国药典(BP2000 1STGALLEY FILE86 C.EFFICACY OF Antimicrobial Preservation)。
2、试验材料准备所述挑战性试验所用菌种、培养基、溶液和生物制品样品1、黑曲霉；2、白色念珠菌；3、铜绿假单孢菌；4、葡萄球菌；5、胰酪胨大豆琼脂平皿及斜面；6、含4％W/V(重量/体积)葡萄糖的沙氏琼脂平皿及斜面；7、含有0.9％W/V氯化钠和有利于分散的0.1％W/V蛋白胨的灭菌悬浮液；8、含有0.9％W/V氯化钠和0.05％W/V聚山梨醇酯80的无菌悬浮液；9、灭菌3.7mM(毫摩尔)硼酸缓冲液；10、自制的无菌无硫柳汞酵母重组乙肝疫苗；11、自制的1％W/V硫柳汞溶液。
3、试验步骤进行含有不同浓度硫柳汞的乙型肝炎疫苗的灭菌抑菌效力试验，包括的步骤有1、准备硫柳汞含量分别为50、30、10、5、2、1、0.5微克/毫升的乙型肝炎疫苗；2、制备试验用菌体浓度为108个/毫升的铜绿假单孢菌、葡萄球菌、黑曲酶和白色念珠菌菌悬液。
3、含有不同浓度硫柳汞乙肝疫苗对不同浓度微生物灭菌抑菌效力试验3a、含有不同浓度硫柳汞(2、1、0.5、0微克/毫升)的乙型肝炎疫苗对低浓度(101、102个/毫升)微生物的灭菌抑菌效力试验将浓度为108个/毫升菌悬液稀释为104个/毫升和103个/毫升；取每一硫柳汞浓度的乙型肝炎疫苗8瓶(20毫升/瓶)，分别接种铜绿假单孢菌、葡萄球菌、黑曲酶和白色念珠菌的104个/毫升和103个/毫升菌悬液，使菌体终浓度达101个和102个/毫升。接种的菌悬液的体积不能超过产品体积的0.5％-1.0％，即0.1-0.2毫升。混合均匀。
接种好避光放置于室温，定期进行无菌试验。
无菌试验方法按照中国《生物制品规程》2000年版所载无菌试验方法进行。
试验结果见表1-4。
3b、含有不同浓度硫柳汞(50、30、10、5、2、1、0.5、0微克/毫升)的乙型肝炎疫苗对高浓度(105-106个/毫升)微生物的抑菌效力试验取每一硫柳汞浓度的乙型肝炎疫苗4瓶(20毫升/瓶)，分别接种铜绿假单孢菌、葡萄球菌，黑曲酶和白色念珠菌的108个/毫升菌悬液，使终浓度达105-106个/毫升。接种的菌悬液的体积不能超过产品体积的0.5％-1.0％，即0.1-0.2毫升。混合均匀。
接种好避光放置于室温。分别于7、14、28天从每一试验容器中取样1毫升，适当稀释，用膜过滤法进行活微生物计数。
膜过滤法活微生物计数用孔径0.22微米的滤膜，将样品转移到两个过滤器内，每个过滤器1.0毫升，立即过滤。铜绿假单孢菌、葡萄球菌和白色念珠菌用含0.9％W/V氯化钠和0.1％W/V蛋白胨的灭菌悬浮液洗3次，每次100毫升。黑曲霉用含有0.9％W/V氯化钠和0.05％W/V聚山梨醇酯80的无菌悬浮液洗3次，每次100毫升。将铜绿假单孢菌、葡萄球菌滤膜覆盖在胰酪胨大豆琼脂平皿表面，将黑曲酶、白色念珠菌滤膜覆盖在沙氏琼脂平皿表面。铜绿假单孢菌、葡萄球菌在30-35℃培养3-5天，白色念珠菌在20-25℃培养3-5天，黑曲酶在20-25℃培养5-7天，进行菌落计数。计算两平皿菌落数的平均值，由其计算菌液浓度。
试验结果见表5-8。
(注+代表阳性，表示有活菌生存；-代表阴性，表示无活菌生存)。
表(1)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对低浓度黑曲霉的灭菌抑菌效力
表(2)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对低浓度白色念珠菌的灭菌抑菌效力
表(3)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对低浓度铜绿假单孢菌的灭菌抑菌效力
表(4)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对低浓度葡萄球菌的灭菌抑菌效力
表(5)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对高浓度黑曲霉的灭菌抑菌效力
表(6)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对高浓度白色念珠菌的灭菌抑菌效力
表(7)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对高浓度铜绿假单孢菌的灭菌抑菌效力
表(8)含有不同浓度硫柳汞乙型肝炎疫苗对高浓度葡萄球菌的灭菌抑菌效力
结论美国药典第24版所规定的1A类注射剂微生物挑战性试验的合格标准为与开始试验相比，细菌浓度在第7天要下降1个对数值以上，在第14天要下降3个对数值以上，第28天与第14天相比较，细菌浓度无增长；酵母菌和霉菌则在任何时候与试验开始时相比较，菌体浓度无增长。
从以上试验结论可见，含有50、30、10、5、2、1、0.5微克/毫升硫柳汞的乙型肝炎疫苗均符合美国药典对注射剂微生物挑战试验的标准，对101、102和105个/毫升浓度的黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌的灭菌抑菌效力都大大超过了美国药典的要求。而根据中国和世界卫生组织的GMP(药品质量管理规范)中的百级层流罩洁净度要求和实际分装时间计算，1毫升安瓿瓶装生物制品在分装的过程中，其微生物负荷(每支灌装容器在灌装过程中可能落入的微生物个数)为≤1.0个微生物/支成品。2毫升西林瓶为≤6.7个微生物/支成品，远小于我们此次试验加入菌的数量。因此，在生产环境中，0.5-10微克/毫升的超低含量硫柳汞已经能够满足灭菌抑菌的需要。
二、超低含量硫柳汞在培养基中的灭菌抑菌试验1.简介为进一步考察超低含量硫柳汞在其它生物制品中的灭菌抑菌作用，我们选用了营养成分最丰富，最适合于细菌生长的大豆酪素消化培养基作为基质，加入不同浓度的硫柳汞，然后用在十万级与万级的环境中长时间暴露已被微生物污染的安瓿瓶来进行分装，以此来考察超低含量硫柳汞的灭菌抑菌作用。由于大豆酪素消化培养基比任何生物制品都适合于细菌的生长，国内符合GMP标准的分装车间的百级层流罩环境远好于万级与十万级环境，因此如果含超低硫柳汞的大豆酪素消化培养基的试验结果能够达到生物制品规程对无菌分装过程中微生物挑战试验的安全要求，则相同浓度的硫柳汞对于生物制品就更能起到令人满意的灭菌抑菌作用。
试验按照我国和世界卫生组织GMP验证指南中建议的无菌分装线验证程序进行。
2.试剂和培养基2.1.硫柳汞Merck(默克)产，符合USP标准。
2.2.1％的硫柳汞溶液1克硫柳汞溶于100毫升硼酸缓冲液中，0.22μm滤膜除菌过滤。
2.3.大豆酪素消化培养基干粉Difco产，符合USP标准。
3.步骤3.1.培养基的配制根据说明书要求，配制大豆酪素消化培养基，灵敏度测试合格后，分别加入终浓度为0、0.5、1、1.5、2、5微克/毫升的硫柳汞，以无硫柳汞培养基作为对照。对无硫柳汞的培养基进行无菌试验培养基灵敏度试验和无菌试验，结果合格。
3.2.将灭菌安瓿暴露于万级与十万级区域将至少36000支灭菌安瓿分为12份，标为对照1、2；A样品1、2；B样品1、2；C样品1、2；D样品1、2；E样品1、2。对照1和样品1对称地平置于万级的分装间地面，暴露半小时(因为在实际分装时安瓿在分装机百级层流罩下敞口时间通常不超过半小时)，期间分装操作人员的活动如常，同时质检部门进行环境监测，监测项目包括1)沉降菌；2)浮游菌；3)尘埃粒子，采样时间与安瓿暴露时间一致。将暴露后的安瓿运回层流罩待用。然后将对照2和样品2平置于十万级洗瓶间的地面，暴露半小时并同时进行环境监测，暴露期间分装洗瓶人员活动如常。
操作人员的着装按不同洁净级别的相应规定执行，敞口安瓿在运送和存放过程中不叠放。
3.3.模拟分装用对照1和对照2分装无硫柳汞的培养基，0.5毫升/支，各3200支；用A样品1、2分装含0.5微克/毫升硫柳汞培养基0.5毫升/支，各3200支；用B样品1、2分装含1微克/毫升硫柳汞培养基0.5毫升/支，各3200支；用C样品1、2分装含1.5微克/毫升硫柳汞培养基0.5毫升/支，各3200支；用D样品1、2分装含2微克/毫升硫柳汞培养基0.5毫升/支，各3200支；用E样品1、2分装含5微克/毫升硫柳汞培养基0.5毫升/支，各3200支；。
3.4.培养和观察取对照1和样品1各14支，分成两份，每份7支，一份每支加＜100个的枯草杆菌，置30-35℃培养7天，一份每支加＜100个的白色念珠菌，置20-25℃培养7天。将其余安瓿上下颠倒，使培养基接触整个安瓿内表面，安瓿置培养箱中，30-35℃培养7天，然后20-25℃培养7天，观察微生物生长情况。
4.结果安瓿暴露期间环境监测结果和模拟灌封培养基的培养结果分别见表9和表10。不含硫柳汞的培养基在万级和十万级染菌率分别为0.5％和2.28％，加入0.5微克/毫升硫柳汞，染菌率为0％和0.06％，加入1.5微克/毫升硫柳汞，染菌率为0％和0.03％，其它含硫柳汞的样品染菌率均为0％。
表(9)安瓿暴露区域的环境监测结果
合格标准参见“药品生产质量管理规范”(1998年)表(10)无硫柳汞和含不同浓度硫柳汞的培养基模拟灌封后的培养结果比较
* 污染率％＝生长安瓿总数×100/安瓿总数5.结论根据中国和世界卫生组织GMP验证指南的相关规定，在进行无菌分装线的验证时，在培养基无菌分装试验中，分装容器的污染率应＜0.1％(分装容器数量不少于3000支)。从本次培养基灌封试验的结果来看，在万级和十万级区域内的无硫柳汞培养基对照的污染率已大大超出上述标准，达到0.5％和2.25％，而含0.5-5微克/毫升硫柳汞培养基的污染率却低于0.06％，说明培养基中0.5-5微克/毫升硫柳汞就可以起到足够的灭菌抑菌效果。因大豆酪素消化培养基是我国和世界卫生组织GMP指南中用于验证无菌分装线的培养基，含有丰富的营养，合适的pH值，在适宜的温度下，比一般生物制品更适于微生物的生长。而无菌注射剂分装机百级层流罩的中国GMP标准和WHO的GMP标准分别为浮游菌＜5个/立方米(中国GMP标准)、＜1个/立方米(WHO的GMP标准)，平均沉降菌＜1个/皿·0.5小时，较万级与十万级区域要少2个数量级，而据此推算出来的1毫升安瓿和2毫升西林瓶的微生物负荷分别为≤1个和6.7个/支成品。因此可以推断，在一般生物制品中，0.5-5微克/毫升硫柳汞就能起到足够的灭菌抑菌效果。
上述的一般生物制品可以是单剂剂型，也可以是多剂剂型；可以包括百日咳疫苗，或白喉疫苗，或破伤风疫苗，或吸附霍乱类毒素疫苗，或I型肾综合症出血热疫苗，或II型肾综合症出血热疫苗，或狂犬疫苗，或乙型肝炎疫苗等预防用生物制品，这些生物制品可以是单价疫苗，也可以是二价及多价疫苗，其中乙型肝炎疫苗可以是酵母重组乙型肝炎疫苗或者CHO(中国仓鼠卵巢细胞)重组乙型肝炎疫苗；还可以包括注射用人免疫球蛋白，或注射用人乙肝免疫球蛋白，或人狂犬病免疫球蛋白，或人破伤风免疫球蛋白，或治疗用疫苗等治疗用生物制品，其中治疗用疫苗包括治疗用乙型肝炎疫苗。
以上所述之最佳实施例意在具体说明本发明的设计思路在确保安全性的前提下，利用现有生产工艺、设备和环境，大幅度降低生物制品中的硫柳汞含量。本发明之实施，并不限于以上最佳实施例所公开的方式，凡基于上述设计思路，进行简单推演与替换，得到的具体的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，都属于本发明的实施。
权利要求
1.一种含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于其中硫柳汞防腐剂的含量为0.5-10微克/毫升。
2.如权利要求1所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于其中硫柳汞防腐剂的含量的优选值为1-5微克/毫升。
3.如权利要求2所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于其中硫柳汞防腐剂的含量的优选值为1-2微克/毫升。
4.如权利要求1至3任一所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述生物制品是单剂剂型或多剂剂型。
5.如权利要求4所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述生物制品包括预防用生物制品。
6.如权利要求5所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述预防用生物制品包括百日咳疫苗，或白喉疫苗，或破伤风疫苗，或吸附霍乱类毒素疫苗，或I型肾综合症出血热疫苗，或II型肾综合症出血热疫苗，或狂犬疫苗，或乙型肝炎疫苗。
7.如权利要求6所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述乙型肝炎疫苗包括酵母重组乙型肝炎疫苗或者CHO重组乙型肝炎疫苗。
8.如权利要求4所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述生物制品包括治疗用生物制品。
9.如权利要求8所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述治疗用生物制品包括注射用人免疫球蛋白，或注射用人乙肝免疫球蛋白，或人狂犬病免疫球蛋白，或人破伤风免疫球蛋白，或治疗用疫苗。
10.如权利要求9所述的含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其特征在于所述治疗用疫苗包括治疗用乙型肝炎疫苗。
全文摘要
一种含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，其中硫柳汞防腐剂的含量为0.5－10微克/毫升。所述生物制品包括预防用生物制品和治疗用生物制品，可以是单剂剂型或多剂剂型。同现有技术相比，本含超低浓度硫柳汞防腐剂的生物制品，大大降低了硫柳汞给使用者特别是婴幼儿带来的潜在危害，可利用现有工艺和设备进行生产，制作成本低。
文档编号A01N59/16GK1562371SQ200410026719
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月30日 优先权日2004年3月30日
发明者汪恩浩, 朱征宇, 张岚, 罗翀, 郑礼群, 王军 申请人:深圳康泰生物制品股份有限公司