专利名称：角膜中期保存液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种眼科医用制品的改进，具体讲是一种角膜中期保存液。其属于化学组合物技术领域。
背景技术：
在现有技术的角膜活性保存方法中有传统的湿房保存法，该法简单易行，缺点是角膜保存时间太短(仅2天)。有专利文献CN1262866A公开了一种角膜活性保存液，其包括，MEM细胞培养基，硫酸软骨素，低分子右旋糖酐，地塞米松，抗生素和HEEPES液。该保存液虽具有较好的保存效果，但有的组分可能因硫酸软骨素含量较高，使保存液中带负电荷，强电量的负电荷对角膜内皮细胞是有害的。还有一种含透明质酸的角膜保存液，其专利号为ZL97193593.9。该专利角膜保存液，主要成分是透明质酸，其成分单一，在角膜内皮细胞保存15天中代表角膜活性的乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、葡萄糖脱-6-磷酸脱氢酶的活性水平下降，而且较长时间的保存会引起角膜植片水肿，使角膜内皮的有效活性密度下降，致使手术操作困难，也使术后易出现植片内皮功能失代偿。目前临床常用的是美国CHIRON公司生产的Optisol保存角膜内皮细胞活性较好的保存液。该保存液主要配方是Tc-199，MEM，HEPES，庆大霉素，硫酸软骨素和Dextron，其中有的原料价格昂贵，进口角膜保存液20ml/50美元(每瓶)，仅用于保存一个供体角膜。因此我国迫切需要一种具有较好的保存效果，同时具有我国独立知识产权并在经济上适合国情的角膜中期保存液。
以上这些角膜保存液还存在的共同问题，就是只考虑到角膜植片内皮细胞的活性，未涉及角膜上皮细胞的存活情况。一般来讲，保存于上述角膜保存液中的角膜植片上皮细胞存活时间为4～6天，超过7天上皮细胞均发生脱落。虽然角膜植片上皮细胞层不如内皮细胞层重要，一旦角膜植片上皮细胞发生脱落，角膜植片极可能发生水肿，不但影响角膜内皮细胞层的保存质量，同时会影响角膜移植手术的效果。
发明内容
本发明目的就是为了解决上述问题，从而提供一种既经济、保存效果又好的角膜中期保存液的技术方案。
本发明目的是通过如下技术措施实现的，研制了一种角膜中期保存液，其是以1000ml计的保存液中含有RPMI1640培养液4.2-6.2g，硫酸软骨素15-35mg，透明质酸5-25mg，HEPES缓冲液3.76-5.76g，地塞米松5-50mg。还含有低分子量海藻多糖10-30mg，妥布霉素或万古霉素10-150mg；该保存液为淡橘红色、透明轻度粘稠液体，其PH值为7.0-7.6，渗透压300-400mOsm/KgH2O，在2-6℃保存。
所述的保存液中还加入MEM培养基3.7-5.7g。
所述的保存液中还加入氢化可的松0.1-5mg/mL。
所述的保存液中的万古霉素，还与妥布霉素联合应用，其中万古霉素10-80mg，妥布霉素25-50mg。
所述的保存液加入的妥布霉素的规格为25-50万单位。
所述的低分子量海藻多糖，其分子量为25000-100000Da，其包括卡拉胶，绿藻中的石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯，其浓度为2-20mg/mL。
所述的保存液还可加入L-谷氨酰胺0.175-0.575mg/mL，在配制时加入或使用时加入。
本发明的优点在于由于采用RPMI1640培养液4.2-6.2g，硫酸软骨素15-35mg，透明质酸5-25mg，HEPES缓冲液3.76-5.76g，地塞米松5-50mg，低分子量海藻多糖10-30mg和妥布霉素或万古霉素10-150mg作为本发明角膜中期保存液的重要配方。其成份相对简单，由于硫酸软骨素、低分子量的海藻多糖和透明质酸的协同作用，可以减少硫酸软骨素的用量，从而减少角膜中期保存液中负电荷的量，使供体角膜在保存期间不致于水肿增厚。在保存期间离体的角膜发生水肿增厚的机理是由于Na+-K+-ATP酶功能下降，改变了角膜的水合作用，导致角膜内皮细胞功能下降，使角膜基质中的内源性葡萄糖的含量减少，角膜基质的水肿增加。在4℃条件下保存角膜时，内皮细胞功能明显下降，不能对抗角膜基质中存在的聚氨基多糖形成的吸水负压，若在角膜周围环境中不存在一定的胶体渗透压，必然会引起角膜水肿。而且水肿的角膜组织可引起更多的组织内成分如聚氨基葡萄糖的降低。所以针对上述角膜离体保存期间增厚的机理，本发明的角膜中期保存液中利用具有与水形成粘稠凝胶，有润滑和保护细胞作用的透明质酸，具有增加并维持胶体渗透压作用的低分子量的海藻多糖和具有渗透脱水作用的硫酸软骨素，三者的协同组合作用，而且这种协同组合作用作为一种抗氧化剂防止细胞膜脂类的过氧化反应。尤以加入的海藻多糖，能够延长保存液中角膜植片上皮的存活时间，防止因上皮脱落引起的角膜植片水肿的发生。本发明的角膜中期保存液中充分利用硫酸软骨素、透明质酸、海藻多糖三者的协同组合而产生一定的胶体渗透压，以维持细胞膜的稳定性，减轻内皮细胞的自溶。因此，这种协同组合作用可明显提高本发明的角膜中期保存液的胶体渗透压，形成内皮细胞的特殊基质，维持其特定的生化环境，有利于维持理想的角膜厚度，提高角膜内皮细胞活性的保存效果。
实验证明，本发明的角膜存活保存液确实具有提高角膜内皮细胞活性和延长角膜上皮脱落时间的保存效果，在保存期间和手术中可维持近乎生理的角膜厚度。再配合加入地塞米松和/或氢化可的松，其可以稳定细胞的溶酶体膜及其他生物膜，增强细胞对毒素和损害的抵御能力，更好地保持内皮细胞的形态和功能。本发明在保存液应用前加入L-谷氨酰胺，可减少角膜上皮和内皮细胞的氧化损害，补充上皮和内皮细胞代偿的必需氨基酸，延长上皮的脱落时间和保存内皮的活性改变。本发明的角膜中期保存液中加入有效的万古霉素或万古霉素与妥布霉素联合应用，可以防止供体携带的病原菌或保存液制作过程中的操作污染引起的微生物感染。
本发明可使角膜活性的保存时间达2周以上，存放期间内皮细胞活性稳定、变化小，在角膜植片内皮细胞的保存方面可与美国CHIRON公司生产的Optisol相媲美，而且在上皮细胞的保存时间方面优于Optisol。酶组织化学检查显示随保存时间的延长，本发明的角膜存活保存液可比美国CHIRON公司生产的Opthiol维持更高的内皮细胞代谢功能。经临床应用，角膜保存7天以上后再使用，术后1-4周植片内皮细胞数均超过2000个/mm2。本发明的角膜中期保存液所需原料易得，价格低廉，经济性好，适合国内中期保存法，可成为当前我国眼库中一种理想的中期角膜保存液，填补国内空白。
具体实施例方式
为能清楚地说明本发明角膜中期保存液的技术方案，现通过具体实施例表，对其进行详细阐述。本发明的实施例见表1。
表1角膜中期保存液的配方 本发明的角膜中期保存液用于猫角膜上皮脱落时间的研究分别将保存于各液5天、7天、15天的猫角膜各10只，进行穿透性角膜移植，观察术后不同时间角膜植片上皮的存活情况。结果发现Optisol保存液中上皮细胞的存活时间维持在4～6天。而在本发明的角膜保存液中保存的角膜植片上皮细胞存活时间超过7天，最长可达到10天。
本发明的角膜中期保存液应用于兔角膜内皮活性试验在125只兔角膜中各取25只，分到保存于本发明的4个配方和Optisol各10ml保存液中，冰箱4℃保存，保存时间分别是5天、7天、10天、15天和20天。每次各取5只，行0.25％锥兰加1％茜素红联合染色，用双目显微镜观察内皮细胞活性密度和活性率，结果见表1。由表1看出，本发现四个配方均具有较好的角膜内皮细胞活性保存效果，与Optisol相接近。但对角膜上皮细胞的保存时间明显比Optisol长。同时还看出本发现的角膜内皮细胞活性率随时间的变化较小，性质稳定，存放20天的活性率达90.5％以上。
本发明的角膜中期保存液应用于兔角膜内皮细胞酶组织化学染色在行锥兰染色前，取保存于各液7天、15天的兔角膜各4只，切片，另取正常兔角膜4只切片作对照组，行酶组织化学染色，即测琼脂酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和葡萄糖-6一磷酸脱氧酶三种酶，测每种酶时，从每只角膜各取切片4张，同一种孵育液孵育。三种酶染色均呈现反应。每种酶的透光密度值(OPTDM值)与酶的活性呈反比。由表2可看出，随保存时间的延长，本发明可较Optisol维持更高的内皮细胞代谢功能。
本发明的角膜中期保存液临床应用于对人角膜进行保存的实验
先后对67位角膜病患者(均为单眼发病}进行角膜移植术，使用67只人角膜，保存于本发明和美国CHIRON公司生产的Optisol中的角膜分别为37只和30只，其中有2只因全角膜移植，没有剩余边缘角膜进行内皮染色观察。
临床观察结果可看出，对保存于本发现保存液中的37只角膜平均保存6.5天，均获透明愈合效果，其植片内皮细胞活性率均在90％以上，对术后1-4周内皮细胞进行了检查，植片内皮细胞数平均达2204.56个/mm2。
本发明保存的角膜移植术后1-4周内，植片内皮细胞数全在1500个/mm2以上。
表2兔角膜内皮细胞保存活性率比较(％)
注本发明的角膜中期保存液实例配方4未加入海藻多糖，所以加入的硫酸软骨素及透明质酸的量相对较多，可能导致角膜保存液中的负电荷含量增加，影响了角膜内皮细胞的活性。由于海藻多糖的缺乏，角膜植片上皮的存活时间缩短，并因上皮脱落导致角膜植片水肿发生。实例配方4与美国CHIRON公司生产的Optisol相比，不同时间的角膜内皮细胞保存活性率均有所降低。
本发明的角膜中期保存液实例配方8和实例配方9中均未加入地塞米松或氢化可的松，导致角膜细胞的溶酶体膜及其他生物膜稳定性降低，对毒素和损害的抵御能力下降。实例配方8和实例配方9与美国CHIRON公司生产的Optisol相比，各时间的角膜内皮细胞保存活性率均有所降低。
本发明的角膜中期保存液实例配方12和实例配方13中均未加入L-谷氨酰胺，与美国CHIRON公司生产的Optisol相比，虽然各时间的角膜内皮细胞保存活性率没有明显改变，但是角膜植片上皮脱落的时间缩短，可能与L-谷氨酰胺的缺乏导致角膜上皮细胞的氧化损害有关。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
1.一种角膜中期保存液，其是以1000ml计的保存液中含有RPMI1640培养液4.2——6.2g，硫酸软骨素15——35mg，透明质酸5——25mg，HEPES缓冲液3.76-5.76g，地塞米松5——50mg，其特征在于还含有低分子量海藻多糖10——30mg，妥布霉素或万古霉素10-150mg；该保存液为淡橘红色、透明轻度粘稠液体，其PH值为7.0——7.6，渗透压300-400mOsm/KgH2O，在2——6℃保存。
2.根据权利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液中还加入MEM培养基3.7-5.7g。
3.根据权利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液中还加入氢化可的松0.1-5mg/mL。
4.根据权利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液中的万古霉素，还与妥布霉素联合应用，其中万古霉素10——80mg，妥布霉素25——50mg。
5.根据权利要求1或4所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液加入的妥布霉素的规格为25-50万单位。
6.根据权利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的低分子量海藻多糖，其分子量为25000-100000Da，其包括卡拉胶，绿藻中的石莼多糖，褐藻中的褐藻多糖硫酸酯，其浓度为2-20mg/mL。
7.根据权利要求1所述角膜中期保存液，其特征在于所述的保存液还可加入L-谷氨酰胺0.175-0.575mg/mL，在配制时加入或使用时加入。
全文摘要
本发明是角膜中期保存液有RPMI1640培养液，硫酸软骨素，透明质酸，HEPES缓冲液，地塞米松，低分子量海藻多糖，妥布霉素或万古霉素组成；该保存液为淡橘红色、透明轻度粘稠液体。该液可使角膜活性的保存达2周以上，存放期间内皮细胞活性稳定、变化小，在角膜植片内皮细胞的保存方面可与美国的Optisol相媲美，上皮细胞的保存时间长。酶组织化学检查显示随保存时间的延长，比美国的Opthiol维持更高的内皮细胞代谢功能。经临床应用，角膜保存7天以上后再使用，术后1－4周植片内皮细胞数均超过2000个/mm
文档编号A01N1/02GK1631138SQ20041009100
公开日2005年6月29日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者董晓光, 谢立信, 史伟云 申请人:山东省眼科研究所