专利名称：一种角膜中期保存液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种角膜材料保存液，尤其是涉及一种治疗角膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱 烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、免疫性疾病如Stevens-Johnson综合征(SJS)、 眼部类天疱疮、单纯疱疹病毒性角膜白斑、角膜移植排斥反应等致盲性眼病的角膜中期保存 液及其制备方法。
背景技术：
据世界卫生组织报告，角膜病是引起视力丧失的第二位主要病因，每年因角膜溃疡、眼 外伤等造成的新增角膜盲为150 200万，儿童盲的主要病因是麻疹导致的角膜白斑。治疗角 膜盲的唯一有效方法是角膜移植术。但是由于宗教信仰、风俗习惯的影响，身故后捐献角膜 者甚少；加上人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒可以通过植片传 播、角膜屈光手术、人口老龄化等原因使角膜供体材料严重不足，极大地限制了角膜盲患者 脱盲。目前我国的眼库常常是有库无眼，远远不能满足角膜复明手术对供体角膜的需要。角 膜移植手术技术的普及和眼库建设在全国各地很不均衡，有能力开展角膜移植的单位往往得 不到充足的角膜供体，而有些单位有机会拿到角膜供体却不具备开展角膜移植手术的条件。 因此，将供体角膜保存起来，在单位间、地区间合理流动，对于充分合理的利用珍贵的角膜 供体资源具有非常重要的意义。国内采用的角膜中期保存液-Optisol GS保存液(Chiron Ophthalmics， Irvine, Calif)来源于进口，是目前公认的最好的角膜中期保存液，但其配方复 杂，价格昂贵，尚未获得在我国的使用权，不适合在我国推广使用。随着角膜外伤、肿瘤、 化学烧伤(碱烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、免疫性疾病、角膜移植排斥反 应等患者人数的增多，角膜的保存，尤其是角膜内皮细胞的活性保存，也就成为目前眼科医 生存在的一个棘手的问题。如何高质量、长时间保存目前稀有的角膜供体材料，寻找一种较 为理想相对廉价的角膜中期保存液也成了当前眼科界研究的一个热点。
由于角膜内皮不可逆的损伤将导致角膜混浊，透明度下降，然而对于需要角膜移植患者 来说，这无疑影响着患者视功能的恢复和视力的提高。寻找一种对内皮损伤极小的保存液来 保存角膜供体材料就显得尤为重要。1953年，Stocker (4、 STOCKER FW. The endothelium of the cornea and its clinical implications.Trans Am Ophthalmol Soc. 1953;51:669-786)发5见CEC是维持角膜透明的基础，因此角膜保存的关键是保护CEC，这一发现为后来的角膜保存技术确 立了质量标准及研究方向,也使角膜保存由原来的非活性保存转变为活性保存。活性保存能使 CEC存活率达到70%以上,可用于穿透性角膜移植。1973年美国McCary和Kaufman(5、 Bigar F, Kaufinan HE, McCarey BE， Binder PS.Improved corneal storage for penetrating keratoplasties in man.Am J Ophthalmol. 1975 Jan;79(l):115-120; 6、 Kaufman HE.Comeal cryo-preservation and its clinical application.Arch Ophtahnol Rev Gen Ophtalmol. 1975 Feb;35(2):201-210; 7、 Meyer RF, McCarey BE, Valenti J, Gravenstein N， Kaufinan HE.Scanning electron microscopy of postoperative M-K and moist chamber-stored corneas.Invest Ophthalmol. 1976 Apr;15(4):260-266) 发明了第一代角膜保存液,即M-K液,开创了角膜中期保存的先河。1990年Kaufman和 Lindstrom (8、 Improved storage methods for epikeratoplasty.Barrett GD, Degebrodt AM, Walker LN.Refract Corneal Surg. 1990 Nov-Dec;6(6):418-423)研制出新一代Optisol角膜中期保存液， 是目前公认的较理想的保存液。此外，有研究发现在保存液中加入透明质酸钠可延长角膜保 存时间，加入抗氧化剂具有减轻角膜组织损伤、保持细胞活性的作用,两者联合可显著提高保 存效果；加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在角膜中期保存液中有促进细胞增殖、保持角 膜细胞活性的作用,角膜水肿较轻、皱褶较少、透明度较高,角膜内皮细胞形态结构和活性较好， 并且角膜上皮、基质和内皮层有PCNA (单克隆抗增殖细胞核抗原)阳性细胞等。
发明内容
本发明的目的是提供一种与现有的角膜中期保存液相比，保存时间更长、质量更高、无 污染、成本相对较低的角膜中期保存液及其制备方法。
本发明所述角膜中期保存液含有培养液、增稠剂、牛血清、氨基酸、抗生素、酸碱调节 剂和细胞营养成分。
按体积百分比，牛血清5% 15%,氨基酸0.5% 2%，酸碱调节剂1% 5%，细胞营养 成分0.5% 2%，抗生素0.5%~2%，余为培养液；最好为牛血清9.5% 10.5%，氨基酸0.8°/o 1.2%，酸碱调节剂2% 3%,细胞营养成分0.8% 1.2%，抗生素0.8% 1.2%，余为培养液。
所述培养液最好采用M199 (Medium 199)培养液或/和MEM (Minimum Essential Medium ,Gibco， invitrogen， American)培养液等。M199培养液和MEM培养液是两种常用 的细胞培养液，也是中期保存液的基础培养液，其成分包含了细胞生长发育所需的大部分营 养成分，可以满足保存期间角膜内皮细胞的营养需要。
所述增稠剂最好选自硫酸软骨素、右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、壳聚糖等中的至少一种。
所述渗透压缓冲剂最好选自氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖等中的一种。
所述渗透压缓冲剂及增稠剂的用量参照眼科制剂标准.
所述牛血清最好釆用胎牛血清，尤其是特级胎牛血清，特级胎牛血清是在无菌条件下通 过心脏穿刺的方式采血取到，经过40nrn正压气流过滤的胎牛血清，具有极佳的促细胞生长 作用及产品稳定性，内毒素含量《10EU/ml，血红蛋白含量《10mg/dl。按体积百分比，所述 牛血清的浓度为1% 15%，最好为10%。
所述氨基酸最好釆用非必需氨基酸，非必需氨基酸为除8种必需氨基酸外的多种氨基酸 的组合，所述非必需氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸等中的至少一种。
所述抗生素选自庆大霉素、链霉素、妥布霉素等中的一种，最好采用妥布霉素。
所述酸碱调节剂选自碳酸钠一碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠一磷酸二氢钠缓冲对、HEPES (英文名为2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]ethanesulfonic acid，中文名为羟乙基哌嗪乙硫 磺酸，分子式为C8H18N204S)、硼酸一硼砂缓冲对等中的一种，最好选用作用较强的HEPES。
所述细胞营养成分选自谷氨酰胺或丙酮酸钠等，最好用丙酮酸钠。
本发明所述角膜中期保存液的制备方法包括以下步骤
按角膜中期保存液的配方，将增稠剂、牛血清、氨基酸、抗生素和细胞营养成分加到培 养液中混合均匀，用酸碱调节剂调pH值为7.2 7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350 380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得角膜中期保存液。
使用时需再加入碳酸氢盐，调pH值为7.3 7.4，每一标本最好为20ml，用前可适当加 入所需的生长因子等。
与现有的角膜保存液相比，本发明具有以下优点(1)制作流程简单、可靠，且易于实 施；(2)角膜中期保存液成分简单，成本相对较低，配制方便；(3)病原菌培养、生物学性 质检测及显微结构观察发现较长时间保存(2周)的角膜添加抗生素后无污染，内皮细胞成 活率极高，并将应用于人穿透性角膜移植术中，术后发现其角膜透明，平均角膜内皮细胞密 度及形态良好，平均活性率都达到70%以上，能够在一定时间内高质量保存角膜植片，远期 效果理想；(4)本发明加入了牛血清，无病原微生物，低内毒素，低补体，可以显著减少使 用其他血清的不良反应，平均角膜内皮细胞活性率略高于无血清的Optisol GS，可能是由于 有血清环境更适合角膜内皮细胞生存；(5)本发明不仅有利于优化动物基质脱细胞条件，同 时将为组织工程角膜产业化时产品保存提供重要的技术支持。
尤其是硫酸软骨素是一种高分子物质，其大分子基团带有负电荷，可与角膜内皮形成共
5价结合，从而在角膜内皮表面形成一个保护层。实验证明这一保护层对角膜内皮具有保护作 用，可以显著地提高保存角膜内皮的活性。低分子右旋糖酐也是一种高分子化合物。溶液中 的硫酸软骨素与低分子右旋糖酐一起产生胶体渗透压，使得保存角膜保持脱水状态，维持正 常的角膜厚度，有利于手术操作。特级胎牛血清含有丰富的营养成分及多种生长因子。血清 中丰富的营养成分给角膜特别是内皮细胞生存生长提供近似于体内的环境。血清中含有多种 生长因子和激素，可以提高内皮细胞的代谢，增进内皮细胞的核酸合成，利于细胞分裂增殖。 使用的特级胎牛血清无病原微生物，低内毒素，低补体，可以显著减少使用血清的不良反应。
本发明所述的角膜中期保存液可在治疗角膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱烧伤)、血管化严 重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、免疫性疾病、角膜移植排斥反应等角膜病变的角膜材料中得 到应用，可用于各种需要角膜移植疾病的供体材料的中期保存，能被广大患者接受并应用于 临床。
图1为经过本发明所述角膜中期保存液保存7天的角膜片的内皮细胞苔盼蓝和茜素红联 合染色的照片(100X)。
图2为经过Optisol角膜中期保存液保存7天的角膜片的内皮细胞苔盼蓝和茜素红联合 染色的照片(100X)。
图3为经过本发明所述角膜中期保存液保存7天的角膜片的内皮细胞的电镜照片(2000X)。
图4为经过本发明所述角膜中期保存液保存14天的角膜片的内皮细胞的电镜照片(2000X)。
图5为经过Optisol角膜中期保存液保存7天的角膜片的内皮细胞的电镜照片(2000X )。 图6为经过本发明所述角膜中期保存液保存7天的角膜片行穿透性角膜移植术后11月 的照片。
图7为Optisol角膜中期保存液和本发明所述角膜中期保存液术前与术后角膜内皮细胞密 度比较。在图7中，a为Optisol角膜中期保存液，b为本发明所述角膜中期保存液；横坐标 为术前、术后，纵坐标为平均细胞密度(个/mm2)。
图8为Optisol角膜中期保存液和本发明所述角膜中期保存液术前与术后角膜内皮细胞平 均活性率比较。在图8中，a为Optisol角膜中期保存液，b为本发明所述角膜中期保存液； 横坐标为术前、术后，纵坐标为平均活性率(％)。
具体实施方式
实施例1
以100ml保存液计，以84.5ml MEM培养液为基础培养液，含有胎牛血清10ml、非必 需氨基酸0.1 mmol、丙酮酸钠0.1 mmol、妥布霉素0.1 g、 HEPES 25 mmol、硫酸软骨素2.5g 和低分子右旋糖酐lg， pH值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L。
制备方法l:将2.5g硫酸软骨素、1 g低分子右旋糖酐加入到含lOml胎牛血清、lOOmM 非必需氨基酸lml、 100 mM丙酮酸钠lml、 1M HEPES 2.5 ml、 10%妥布霉素1 ml及84.5 ml MEM培养液中混合均匀，调pH值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L，经0.2pm膜过 滤除菌，20ml分装后4'C保存即得本保存液。用时需再加碳酸氢钠，调pH值为7.3 7.4。每 一标本20ml，用前可适当加入所需的生长因子等。
制备方法2:将10 ml特级胎牛血清、lOOmM非必需氨基酸lml、 100 mM丙酮酸钠lml、 1M HEPES 2.5 ml、 10%妥布霉素0.5-2 ml及34.5 ml MEM培养液中混合，然后将2.5 g硫酸 软骨素和1 g低分子右旋糖酐加入混合液中，然后继续加50mlMEM培养液混合均匀，调pH 值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L，经0.2pm膜过滤除菌，20ml分装后4'C保存即 得本保存液。用时需再加碳酸氢钠，调pH值为7.3 7.4。每一标本20ml，用前可适当加入 所需的生长因子等。
实施例2
以100 ml保存液计，以84.5ml M199培养液为基础培养液，含有特级胎牛血清10 ml, 非必需氨基酸0.1 mmol，丙酮酸钠0.1 mmol，妥布霉素0.1 g， HEPES 25 mmol等，还可以含 有将硫酸软骨素2.5g、低分子右旋糖酐lg， pH值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L。
制备方法l:将2.5g硫酸软骨素、1 g低分子右旋糖酐加入到含10 ml特级胎牛血清、 lOOmM非必需氨基酸lml、 100 mM丙酮酸钠lml、 1M HEPES 2.5 ml、 10。/。妥布霉素lml及 84.5 ml M199培养液中混合均匀，调pH值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L，经0.2pm 膜过滤除菌，20ml分装后4'C保存即得本保存液。用时需再加碳酸氢钠，调pH值为7.3 7.4。 每一标本20ml，用前可适当加入所需的生长因子等。
制备方法2:将10 ml特级胎牛血清、100mM非必需氨基酸lml、 100mM丙酮酸钠lml、 1M HEPES 2.5 ml、 10%妥布霉素1 ml及34.5 ml M199培养液中混合，然后将2.5 g硫酸软骨 素和1 g低分子右旋糖酐加入混合液中，然后继续加50mlM199培养液混合均匀，调pH值 为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L，经0.2pm膜过滤除菌，20ml分装后4'C保存即得 本保存液。用时需再加碳酸氢钠，调pH值为7.3 7.4。每一标本20ml，用前可适当加入所 需的生长因子等。实施例3
以100 ml保存液计，以42.25ml MEM培养液和42.25ml M199培养液为基础培养液，含 有特级胎牛血清10 ml，非必需氨基酸0.1 mmol，丙酮酸钠0.1 mmol，妥布霉素0.1 g， HEPES 25mmol等,还可以含有将硫酸软骨素2.5g、低分子右旋糖酐lg， pH值为7.2 7.4，渗透压为 350 380mOsm/L。
制备方法l:将2.5 g硫酸软骨素、1 g低分子右旋糖酐加入到含10 ml特级胎牛血清、 100mM非必需氨基酸lml、 100 mM丙酮酸钠lml、 1M HEPES 2.5 ml、 10。/。妥布霉素lml、 42.25ml MEM培养液和42.25ml Ml99培养液中混合均匀，调pH值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L，经0.2pm膜过滤除菌，20ml分装后4'C保存即得本保存液。用时需再加碳酸氢 钠，调pH值为7.3 7.4。每一标本20ml，用前可适当加入所需的生长因子等。
制备方法2:将10 ml特级胎牛血清、100mM非必需氨基酸lml、 100mM丙酮酸钠lml、 1M HEPES 2.5 ml、 10%妥布霉素1 ml及34.5 ml MEM和M199 (1:1)的培养液中混合，然 后将2.5 g硫酸软骨素和1 g低分子右旋糖酐加入混合液中，然后继续加50 ml MEM和M199 (1:1)的培养液混合均匀，调pH值为7.2 7.4，渗透压为350 380mOsm/L，经0.2pm 膜过滤除菌，20ml分装后4'C保存即得本保存液。用时需再加碳酸氢钠，调pH值为7.3 7.4。 每一标本20ml，用前可适当加入所需的生长因子等。
参见图1 5，在目前公认最好的角膜中期保存液Optisol GS角膜中期保存液，其4'C保 存，可维持角膜内皮活性长达14d，在这段保存期可容许眼库工作人员对供体角膜进行详细 的检査，以排除恶性肿瘤、传染性疾病，从而为临床提供健康、优质的角膜片；还可方便临 床医生工作，使其能够从容地组织病人，安排手术。但这种角膜中期保存液配方复杂，价格 昂贵，需要进口，不适合在我国推广使用。本发明所述的角膜中期保存液的成分简单，配制 方便，成本较低，经苔盼兰和茜素红联合染色7d(图1)及扫描电镜7d(图3)和14d(图4)检査证 实其保存人角膜的效果(保存时间、角膜内皮细胞平均密度及平均角膜内皮细胞活性率)与 相应天数的Optisol液(图2和5)相当。
图6是经过本发明所述角膜中期保存液保存7天的角膜片在临床应用上的一个具体实施 例。经过本发明角膜中期保存液保存7天的角膜应用于穿透性角膜移植的患者经过11个月的 长期随访，其角膜厚度及透明度、角膜内皮细胞密度，平均活性率均与目前应用进口的Optisol 角膜中期保存液保存过的角膜片效果相当。
实施例4
以下给出一种优化的角膜中期保存液制作方法及在角膜移植的临床初步研究目的研制一种配方简单、适应性强的角膜中期保存液。
方法人角膜27片、23片分别保存于角膜中期保存液与Optisol GS液，保存结束取周 边角膜行苔盼兰和茜素红联合染色，计算角膜内皮细胞密度及角膜内皮细胞活性率，保存7d 和14d各取2片角膜进行扫描电镜检査，比较两组数据。取8片角膜保存于中期保存液，所 保存角膜用于临床角膜移植，对患者定期进行裂隙灯检査，角膜内皮照相。
结果角膜中期保存液组角膜内皮细胞平均密度为2743.48±366.54个/mm2， Optisol GS 液组角膜内皮细胞密度为2568.95士245.47个/mm2，两组比较，差异无统计学意义；角膜中期 保存液组的内皮细胞平均活性率(96.65±2.59%)高于Optisol GS液组(93.47±3.81%)，差异 具有统计学意义。临床使用的角膜植片保存7d以内平均角膜内皮细胞密度为2493.33±390.04 个/mm2，内皮细胞平均活性率为96.93±1.62%，术后复诊时间长达2 11月，角膜植片透明， 全部角膜内皮细胞计数均维持在2000个/mm2以上。
结论角膜中期保存液可活性保存人角膜片长达2周，其保存效果与Optisol液相似，初 步临床使用显示了较好的效果。
图7为两种角膜中期保存液在术前、术后角膜平均内皮细胞密度情况。术前中期保存液 保存角膜时间最短ld，最长14d，平均8.39d， Optisol液保存角膜时间最短4d，最长9d，平 均7.58d。中期保存液保存角膜内皮细胞密度最低2000个/mm 最高3440个/mm气平均 2743.48±366.54个/mm2; Optisol液保存角膜内皮细胞密度最低1980个/mm2，最高3100个/mm2, 平均2568.95±245.47个/mm2， p〉0.05，两组比较差异无统计学意义。临床使用的角膜植片保 存7d以内平均角膜内皮细胞密度为2493.33±390.04个/mm2，高于Optisol液保存 2448.46±354.36个/mm2。说明经过本发明保存的角膜材料能应用于人穿透性角膜移植术中， 术后角膜透明，平均角膜内皮细胞密度及形态良好，能够在一定时间内高质量保存角膜植片。
图8为两种角膜中期保存液在术前、术后角膜平均内皮细胞活性率情况。中期保存液保 存角膜内皮细胞活性率最低90.8%，最高99.5%，平均96.65±2.59%; Optisol液保存角膜内皮 细胞活性率最低82.5%，最高97%，平均93.47%±3.81， p〈0.05,两组比较差异具有统计学意 义。临床使用的角膜植片保存7d以内内皮细胞平均活性率为96.93士1.62。/。，高于Optiso1液保 存93.89±1.56%，术后复诊时间长达2 11月，角膜植片透明。说明经过本发明保存的角膜材 料能应用于人穿透性角膜移植术中，术后角膜透明，角膜内皮细胞平均活性率高，能够在一 定时间内高质量保存角膜植片。
权利要求
1. 一种角膜中期保存液，其特征在于含有培养液、增稠剂、牛血清、氨基酸、抗生素、酸碱调节剂和细胞营养成分，按体积百分比，牛血清5％～15％，氨基酸0.5％～2％，酸碱调节剂1％～5％，细胞营养成分0.5％～2％，抗生素0.5％～2％，余为培养液。
2. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于按体积百分比，牛血清9.5%~ 10.5%，氨基酸0.8% 1.2%，酸碱调节剂2% 3%,细胞营养成分0.8% 1.2%，抗生素0.8% 1.2%，余为培养液。
3. 如权利要求1或2所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述培养液为M199培养 液或/和MEM培养液。
4. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述增稠剂选自硫酸软骨素、 右旋糖酐、透明质酸钠、羧丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、 卡波姆、壳聚糖中的至少一种。
5. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述牛血清为胎牛血清，按体 积百分比，所述牛血清的浓度为1% 15%。
6. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述氨基酸采用非必需氨基酸， 所述非必需氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。
7. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述抗生素选自庆大霉素、链 霉素、妥布霉素中的一种。
8. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述酸碱调节剂选自碳酸钠一 碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠一磷酸二氢钠缓冲对、HEPES、硼酸一硼砂缓冲对中的一种。
9. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液，其特征在于所述细胞营养成分选自谷氨酰 胺或丙酮酸钠。
10. 如权利要求1所述的一种角膜中期保存液的制备方法，其特征在于其具体步骤为 按角膜中期保存液的配方，将增稠剂、牛血清、氨基酸、抗生素和细胞营养成分加到培养液中混合均匀，用酸碱调节剂调pH值为7.2 7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350 380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得角膜中期保存液。
全文摘要
一种角膜中期保存液及其制备方法，涉及一种角膜材料保存液。提供一种与现有的角膜中期保存液相比，保存时间更长、质量更高、无污染、成本相对较低的角膜中期保存液及其制备方法。角膜中期保存液含有培养液、增稠剂、牛血清、氨基酸、抗生素、酸碱调节剂和细胞营养成分。按角膜中期保存液的配方，将增稠剂、牛血清、氨基酸、抗生素和细胞营养成分加到培养液中混合均匀，用酸碱调节剂调pH值为7.2～7.4，用渗透压缓冲剂调渗透压为350～380mOsm/L，经膜过滤除菌，即得角膜中期保存液。
文档编号A01N1/02GK101502257SQ20091011126
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月13日 优先权日2009年3月13日
发明者刘祖国, 邹文进 申请人:厦门大学