专利名称：：角膜中期保存液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种角膜中期保存液。
背景技术：
：现有角膜的活性保存方法，根据保存时间的不同，可分为短期保存、中期保存和长期保存。短期保存是将全眼球消毒杀茵处理后，在湿房4°C条件下保存，此方法的优点是方法简便，有效可行，尤其适合于基层医院开展角膜移植。缺点是保存时间较短，一般都在48小时内有效，有时因不能及时找到患者，材料已过期而弃用。长期保存是将角膜片经特殊处理后在-196°C的液氮中冷冻保存。冷冻保存的最大优点是为临床随时提供优质活性角膜，但是这种方法需特殊设备，技术难度高。中期保存一般采用角膜片组织保存液4。C保存，这一方法不仅可以提供较高质量的角膜，而且使角膜移植手术在时间安排方面得以改善。目前，最常用的几种角膜中期保存液是K-S0K,CSM，Dexsol和Optisol。这些保存液基本功能相似，但组成的成份及浓度不同。它们存在一个共同的问题是它们都进口产品，其价格昂贵。近年来，为了向社会提供物美价廉的角膜中期保护液，我国学者在这方面作了不少研究，如中国专利文献CN1162389、CN1262866和CN1631138所公开的角膜保存液均较好地解决了这个问题。
发明内容本发明的目的是克服上述问题，向社会提供一种新的物美价廉的角膜中期保护液。本发明的技术方案是提供一种角膜中期保存液，其是以1000ml的保存液中含有DMEM培养基O.5-1.5g,羟丙基甲基纤维素1-10g,2-巯基乙醇0.l-10ml，右旋糖苷(分子量40000)10-20g，非必需氨基酸l-3ml，Hepes緩冲液10-32mmol，地塞米松0.01-0.05mmol,庆大霉素50-70mg;该保存液的pH值为7.2-8.0,渗透压为350—400mmol/LH20。所述庆大霉素50-70mg可用50-70mg链霉素代替。所述庆大霉素50-70mg可用20-40mg链霉素和庆大霉素20-40mg代替。本发明由DMEM培养基，羟丙基曱基纤维素，2-巯基乙醇，右旋糖苷，非必需氨基酸等成份加蒸镏水配制而成。它不同于其它角膜中期保存液，其中羟丙基曱基纤维素可以保护角膜不受外力的伤害，而且羟丙基曱基纤维素本身是一种惰性物质，可以降低细胞代谢速度，对细胞无毒害作用，可以提高胶体渗透压；2-巯基乙醇对细胞生长有很重要的作用，它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞的增殖作用，2-巯基乙醇的活性部分能使保存液中氧化的谷胱甘肽成为还原型谷胱甘肽，从而诱导细胞增殖。本发明由于采用了价格比较低廉的羟丙基曱基纤维素和2-巯基乙醇，使得本发明不仅具有好的角膜保存质量，同时还具有优良的性价比的优点，是一种广泛适用于国内外眼库使用的角膜中期保存液。图1是本发明角膜中期保存液保存5d的人角膜内皮细胞台盼蓝-萏素红染色xl00。图2是Optisol-GS液保存5d的人角膜内皮细胞台盼蓝-萏素红染色xioo。图3是本发明角膜中期保存液保存8d的人角膜内皮细胞台盼蓝-茜素红染色xl00。图4是0ptiso1-GS液保存8d的人角膜内皮细胞台盼蓝-茜素红染色x100。图5是本发明角膜中期保存液保存14d的人角膜内皮细胞台盼蓝-茜素红染色xioo。图6是Optisol-GS液保存14d的人角膜内皮细胞台盼蓝-茜素红染色xioo。图7是本发明角膜中期保存液保存8d的人角膜组织切片。图8是本发明角膜中期保存液保存14d的人角膜组织切片。图9-图IO是本发明角膜中期保存液保存10d的人角膜内皮细胞中央及周边扫描电镜^见察x1000。图11-图12是Optisol-GS液保存10d的人角膜内皮细胞中央及周边扫描电镇7见察xi000。图13是本发明角膜中期保存液保存14d的人角膜内皮细胞扫描电镜观察x1000。图14是Optisol-GS液保存14d的人角膜内皮细胞扫描电镜观察x1000。图15是本发明角膜中期保存液保存14d的人角膜内皮细胞透射电镜观察x5200。图16是Optisol-GS液保存14d的人角膜内皮细胞透射电镜观察x5200。具体实施例方式本发明中所采用的DMEM培养基(液体)是由美国GIBCO公司生产的，其含有1000mg/L葡萄糖，584mg/L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸，3700mg/L碳酸氢钠，pH值为L2-7.4,它是一种非常适合于许多哺乳动物细胞培养的培养基。显然，上述DMEM培养基也可以用具有相同或相近组份的DMEM培养基干粉，通过计算其组份的重量后，直接用干粉DMEM培养基代替液体的DMEM培养基。本发明中的羟丙基曱基纤维素(Hydroxypropyimethyleeilulose，HPMC)是由美国D0W公司生产的。本发明中的2-巯基乙醇、右旋糖苷和HEPES緩冲液均由美国Sigma公司生产。本发明中的非必需氨基酸是由美国HyClone公司生产的非必需氨基酸溶液(10mM,IOO倍)，其含有七种非必需氨基酸，每种各10mM(可溶于MEM培养基)。2-8。C保存。庆大霉素、链霉素，地塞米松、氢化可的松均为国产。表1为本发明角膜中期保存液的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>分别将表l中的各角膜中期保存液及0pUsol-GS液，各用8只人角膜，分别用5天、8天和14天进行保存试验，在深圳市眼科医院进行穿透性角膜移植，结果发现本发明的1-12实施例中的在保存8天以内的各项技术指示与Optisol-GS液相当，完全可以取代进口的Optisol-GS液。在保存第14天时，其中的第4、5、6和12号实施例的数据还略好于0ptisol-GS液。经试验，将表1中的庆大霉素或链霉素50-7Omg用20-40mg链霉素和庆大霉素20-40mg代替，可以起到同样的抗菌效果。将表1中的第6号角膜中期保存液保存的一只人角膜与Optisol-GS液保存的一只人角膜进行切片比较的结果如下。1、保存角膜内皮细胞活性率见表2。经统计学处理，在两种保存液中保存不同时间内皮细胞活性率比较，差异无显著性(P>0.05)(见图1-6)。表2两种保存液中保存不同时间人角膜内皮细胞活性率比较<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、角膜厚度测量结果见表3。在本发明角膜中期保存液中保存14d的植片平均角膜中央厚度为649.2um，在Optisol-GS液中保存14d的植片平均角膜中央厚度为655.1卩m。两组比较差异无显著性(p>0.05)。表3两种保存液中保存不同时间人角膜厚度变化(um，3f士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、组织学观察:保存5、8、12、14天角膜片组织结构清晰(保存8天，角膜层间结构清晰，内皮层完整、无水肿。保存12天起，可见角膜基质层轻水肿，但上皮、内皮层保持完好(见图7~8)。4、扫描及透射电镜观察扫描电镜4全查两组保存液保存10天的角膜内皮细胞六角形镶嵌结构正常，细胞连接较为紧密，Y型连接无断裂，胞体较大，部分细胞核突起明显；保存14天的角膜内皮细胞连接仍较紧密，细胞膜出现散在个别微小裂孔。透射电镜观察两组保存液保存14天的角膜内皮细胞膜尚完整，部分线粒体胂胀，细胞内有空泡(见图9-16)。5、微生物培养观察两组保存液在保存过程中，液体澄清，送检样本，菌检均为阴性。权利要求1、一种角膜中期保存液，其特征在于其是1000ml的保存液中含有DMEM培养基0.5-1.5g，羟丙基甲基纤维素1-10g，2-巯基乙醇0.1-10ml，右旋糖苷(分子量40000)10-20g，非必需氨基酸1-3ml，Hepes缓冲液10-32mmol，地塞米松0.01-0.05mmol，庆大霉素50-70mg；该保存液的pH值为7.2-8.0，渗透压为350-400mmol/LH2O。2、根据权利要求1所述的角膜中期保存液，其特征在于所述庆大霉素50-70mg可用50-70mg链霉素代替。3、根据权利要求1所述的角膜中期保存液，其特征在于所述庆大霉素50-70mg可用20-40mg链霉素和庆大霉素20-40mg代替。全文摘要一种角膜中期保存液，其是以1000ml的保存液中含有DMEM培养基0.5-1.5g，羟丙基甲基纤维素1-10g，2-巯基乙醇0.1-10ml，右旋糖苷(分子量40000)10-20g，非必需氨基酸1-3ml，Hepes缓冲液10-32mmol，地塞米松0.01-0.05mmol，庆大霉素50-70mg；该保存液的pH值为7.2-8.0，渗透压为350-400mmol/LH<sub>2</sub>O。本发明不仅具有好的角膜保存质量，同时还具有优良的性价比的优点，是一种广泛适用于国内外眼库使用的角膜中期保存液。文档编号A01N1/02GK101524063SQ20091013400公开日2009年9月9日申请日期2009年3月23日优先权日2009年3月23日发明者莉于,亮吴,周艳丽,姚晓明,林宝涛,肖爱明,袁凤波,谢柏林,阿衣努尔·吐尔地申请人:姚晓明