专利名称：一种建立中华结缕草成熟胚再生体系的方法
技术领域：
本发明涉及一种建立中华结缕草成熟胚再生体系的方法。属于生物技术领域。
背景技术：
九十年代以来，随着我国城市建设的发展和人民生活水平的提高，我国北方许多城市大力铺植草坪，取得了很好的景观效果，如北京已种植草坪3000公顷，每年都有近300公顷草坪问世；大连市后来居上，每年新增240多公顷(王清奎等，我国草坪业发展回顾及对策，草原与草地，2002，97(7)22-24)。但以冷季型草居多，虽绿期长、色泽优美，但耗水量大、生长迅速需经常修剪，夏季易生病虫害，养护费用高。我国是发展中国家，经济实力有限，且淡水资源缺乏，西北地区尤甚，所以无论是城市绿化还是水土保持工程，都应把开发抗旱、抗病、管理粗放、绿色期长的草坪与地被植物作为重点。而结缕草正好可弥补冷季型草坪草的不足，它具有诸多优良的特性1)耐旱、耐热性极强；2)耐盐碱性强；3)耐磨、耐践踏、弹性好；4)耐修剪；5)具有较好的抗病虫性；6)耐土壤贫瘠；7)耐低水平养护。在与草地早熟禾比较中，结缕草的耗水量比草地早熟禾少30％至40％，而草坪弹力是草地早熟禾的30至40倍，建植和管理费用比草地早熟禾低80％(胡叔良，发展草坪绿地关键问题的探讨，中国草地，1997(2)67-70)。因此，结缕草已成为运动场、开放绿地、边坡绿化以及水土保持的首选草种，是适合我国国情的草坪草种。
中华结缕草(Zoysia sinica Hance)是国产珍贵的优良草坪植物，除具一般结缕草所具备的优良特性外，其叶片质地较细，色泽美，扩展快，其适宜生境土壤的pH值在7.2-9.3，为耐盐碱植物，可作为盐碱地及沿海城市建植草坪的优良植物，开发潜力很大。有专家预测，结缕草，特别是中华结缕草必将成为我国未来草坪业的支柱之一。
但在实际应用中华结缕草还存在一些问题，如抗寒性差，枯黄期过长等。中华结缕草对低温极为敏感，当环境温度低于10℃时即进入休眠，在北方地区每年的绿期平均只有6个月左右，如在大连地区4月中下旬返青，10月中下旬枯黄，绿色期160天左右，而早熟禾为280天(刘建秀等，暖季型草坪草种资源的研究与改良，国外畜牧学—草原与牧草，1996(3)12-21)。这一缺点严重限制了其在北方地区的推广。因而对结缕草进行遗传改良，延缓叶片衰老，选育绿色期延长，且草坪质地优良的新品种(系)，具有重要的理论和实践意义。
直接诱导体细胞变异，或采用基因工程技术，将抗逆功能基因有目的、有针对性地导入特定品种的愈伤组织或原生质体，获得改良的转基因植物，提高草坪草的抗逆性，成为草坪学领域的研究前沿。组织培养(原生质体培养)是现代生物技术不可或缺的组成部分，无论是转基因受体的提供，还是转化细胞的筛选和再生，都需要组织培养技术作支撑，因而建立一套高效的再生体系是转基因技术的必须条件。
草坪草再生体系的建立难度较大，许多草坪草研究仅是获得了再生植株，无法满足遗传转化的需要。而暖季型草坪草比冷季型草坪草更难诱导胚性愈伤组织和再生植株。结缕草属植物属于暖季型草坪草，其组织培养研究已经有十多年。一些日本和韩国学者在这方面的研究较为深入，探讨了结缕草再生过程中2，4-D、NAA和6-BA的作用和配比(Yoo Y K等，Effects of plant growthregulators on callus formation and organogenesis from the shoot cultures of fiveturf-grass species，Journal of the Korean Society for HorticulturalSci.，1991，32(2)237-246；Noh，HeeYoung，Choi，JoonSoo，Ahn，ByungJoon.Plantregeneration through somatic embryogenesis in zoysiagrasses，Journal of the KoreanSociety for Horticultural Science，1995，36(4)582-587；李瑞芬等，结缕草愈伤组织诱导及植株再生，园艺学报，2003，30(3)355-357；等)。
结缕草愈伤组织的诱导多用成熟种子为外植体(Al-Khayri，等.In vitro plant regeneration of zoysiagrass，Arkansas Farm Research，1989，38(2)11；Chai等，Application of biotechnology in turfgrass genetic improvement，Crop Science，1998，381320-1338；Rim等，Callus induction and plant regeneration from seeds of Zoysia japonica Steud，Journal of the Korean Society of Grassland Science，2001，21(2)49-52；等)，在添加不同浓度的2，4-D、NAA和BA的MS培养基(见附表1)或LS培养基(见附表2)上诱导愈伤组织并再生植株。在已有的研究中，结缕草种子愈伤组织诱导率仅为30-50％，其中胚性愈伤组织率通常低于3％。以幼穗和幼果为外植体，也诱导出愈伤组织并获得了再生植株。Inokuma等(Transgenic Japanese lawngrass(Zoysia japonica Steud.)plants regenerated from pro-toplasts，Plant Cell Reports，1998，17(5)334-338)开创了结缕草原生质体培养的先例。
以上各再生体系建立研究均以日本结缕草(Z.japonica)为材料，且愈伤组织诱导率及再生率仍较低，而有关中华结缕草(Zoysia sinica Hance)组织培养再生体系的建立研究尚未见报道，相关研究均处理探索阶段。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明以中华结缕草成熟种子胚为材料，诱导成熟胚高频率产生愈伤组织，切取愈伤组织，放入继代培养基及植株再生培养基中获得高、频稳定的胚性愈伤组织诱导率和植株再生率。为遗传转化提供良好受体材料。
本发明通过离体培养中华结缕草成熟胚建立了再生体系，外植体取材容易且方便贮存，所获得的再生植株性状均一、稳定，易于遗传工程操作。本发明的培养方法包括四个培养阶段(1)以成熟胚为外植体，离体培养直接诱导愈伤组织，(2)愈伤组织的继代培养，(3)愈伤组织诱导体细胞胚，(4)体细胞胚诱导再生植株，其中(1)(2)为黑暗培养，(3)为200～500勒克斯的弱光培养，(4)为1500～3000勒克斯的光培养，整个培养过程，培养温度为25±3℃，第(1)阶段培养40天转接，第(2)(3)(4)每培养20天换新鲜培养基。
优选为第(1)、(4)阶段的基本培养基为MS培养基，第(2)、(3)阶段的基本培养基是HMS培养基，在第(1)阶段的培养基中所用激素为2.5～6mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA，还添加了核黄素VB2 0.5～2.0mg/L和水解酪蛋白200～500mg/L，在第(2)阶段的培养基中所用激素为0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA。在第(3)阶段的培养基中所用激素为0.05～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.01～2mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA，在第(4)阶段的培养基中含有激动素KT0～0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0～3.5mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.1mg/L。
其中，在第(1)阶段的培养基中添加的碳源为蔗糖20～30g/L，葡萄糖15～25g/L，第(2)、(3)、(4)阶段培养中添加的碳源为蔗糖30～60g/L。HMS培养基的成分为1/2MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐，核黄素(VB2)1.0mg/L，盐酸噻胺(VB1)1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆辛0.5mg/L，肌醇0.1g/L。
本发明建立中华结缕草再生体系的方法包括如下步骤(1)种子先用30％(w/v)的NaOH溶液处理40分钟，打破休眠，(2)然后于室温下自来水中浸泡12～20小时。用70％(v/v)酒精灭菌30秒，无菌蒸馏水清洗3次后，0.1％升汞浸泡10分钟，再用无菌蒸馏水清洗8-10次，(3)将灭过菌的外植体接种于含2.5～6.0 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA、0.5～2.0mg/L核黄素VB2、200～500mg/L水解酪蛋白CH以及20～30g/L蔗糖和15～25g/L葡萄糖的培养基中诱导愈伤组织，温度为25±3℃。外植体去污染率达90％以上。10天后，在种子萌发的芽基部或芽体上产生的，或者是在种子的胚部位开始出现愈伤组织，第15-25天愈伤组织发生达高峰期，40天调查愈伤组织诱导率达70％以上。2，4-D与6-BA以及高浓度碳源在诱导愈伤组织过程有极为重要的作用。(4)无菌条件下，将愈伤组织转入含1.0～4.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～0.5mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的HMS培养基上，培养条件为不见光培养，温度25±3℃。继代培养60天后，愈伤组织体积明显增大，相对生长量为2～4倍，愈伤组织表型可以明显地分成三类一类是外观白色到淡黄色的愈伤组织，兼有软、粘组织和硬粒组织；二类是生长快，外观舒松，内部软、水渍状的愈伤组织；三类是生长慢、色深、褐化的愈伤组织。(5)将组织块分类转接到胚性愈伤组织诱导及植株再生的培养基进行分化培养。第一类即白色到淡黄色、含有硬粒的愈伤组织，分化培养10-15天后即可见到少量芽原基，30-40天后可见到明显的小芽丛，再生率可达30-65％。植株再生以器官发生方式为主，在苗丛形成的同时或随后在基部发出须状根。再生苗在室温下炼苗3天后，移栽成活率95％以上。第二类即软化愈伤组织，在分化培养初期继续生长，随着时间的延长，逐渐褐化死亡。第三类即色深、褐化的愈伤组织，分化培养后多数死亡，只有个别组织块可以形成绿色的愈伤，但很少再生植株。其中(2)(3)为黑暗培养，(4)为200～500勒克斯的弱光培养，(5)为1500～3000勒克斯的光培养，整个培养过程，培养温度为25±3℃，除第(2)阶段外，每培养20天换一次新鲜培养基。
本发明中，愈伤组织是在种子萌发的芽基部或芽体上产生的，或者是在种子的胚部位直接发出，因而可以认为愈伤组织是由种子的成熟胚产生的。
所述的愈伤组织是指从中华结缕草成熟胚诱导产生的膨大的未组织化的分裂细胞构成的细胞团。
所述的胚性愈伤组织是指无组织化的分裂细胞团经进一步培养后，细胞团表面或内部部分细胞内含物增加，并出现极性，进一步发育经历球形胚、鱼雷胚及子叶形胚后即形成体细胞胚，在适宜条件下可直接分化成完整植株。其发育过程类似受精后的子房发育过程。
本发明以中华结缕草成熟胚为外植体，建立的遗传转化受体体系克服了结缕草属植物普遍存在的愈伤组织诱导率低及植株再生率低的缺点，其特点在于(1)愈伤组织诱导显著增高，最高达70％以上；(2)再生植株诱导率高，且稳定。(3)取材不受季节限制。
图1胚性愈伤组织图2开始形成胚性愈伤组织图3非胚性愈伤组织图4胚性愈伤组织分化成芽点图5体细胞胚萌发图6从胚性愈伤组织诱导不定芽再生图7中华结缕草成熟诱导再生植株
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例1愈伤组织诱导试验材料中华结缕草成熟种子。
试验设计及培养基按照L9(4×3)正交表设计。所用的培养基为HMS培养基，蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，pH 5.8。
培养条件培养温度为25±1℃，无光照。
试验步骤种子用30％(w/v)的NaOH溶液处理40min，可打破休眠，7天发芽率达89.9％。然后于室温下自来水中浸泡20小时。用70％(v/v)酒精灭菌30秒，无菌蒸馏水清洗3次后，0.1％升汞浸泡10分钟，再用无菌蒸馏水清洗8次然后接种于含2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 2.5mg/L、萘乙酸NAA 0.5mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.25mg/L、VB11.0mg/L和蔗糖30g/L、葡萄糖20g/L的MS培养基中，不见光培养，温度为25±1℃。10天后，在种子萌发的芽基部或芽体上产生的，或者是在种子的胚部位开始出现愈伤组织，第21天愈伤组织发生达高峰期。40天调查愈伤组织诱导率达70％以上。2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA及碳源在诱导愈伤组织过程起极为重要的作用。
实施例2愈伤组织继代培养愈伤组织诱导同实施例1。将愈伤组织接种到含6-苄基氨基腺嘌呤6-BA为0.1mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D为1.6mg/L的HMS培养基上，愈伤组织多呈白色，有的组织块中带有少量淡黄色愈伤，愈伤组织几乎不发生褐化。继代培养60天后，愈伤组织相对生长量为3.2倍，但没有明显的芽原基分化。当6-BA浓度为0.25mg/L时，组织块逐渐变硬，形成白色到淡黄色的小芽，组织块褐化率为10.3％。当6-BA浓度为0.5mg./L，褐化率达25％。说明在愈伤组织的继代培养中6-苄基氨基腺嘌呤6-BA浓度应≤0.1mg/L。当6-BA浓度高时容易引发器官分化，不利于愈伤组织生长。
继代培养基中2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D浓度在2.5mg/L、6-苄基氨基腺嘌呤6-BA浓度为0.1mg/L时，愈伤组织继代培养60天后，愈伤组织相对生长量为3.6倍，各2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D浓度处理间愈伤组织的相对生长量差异均不显著(P＝0.05)。根据愈伤组织表型可以明显地分成二类(见
)一类是外观白色到淡黄色的愈伤组织，兼有软、粘组织和硬粒组织；二类是生长快，内部软、水渍状的愈伤组织；其中以第一类为主。说明2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D浓度为2.5mg/L利用愈伤组织生长质量的保持。
实施例3再生植株诱导试验材料继代培养60天的愈伤组织，获得方法同实施例1、2。
培养基所用的培养基为不加植物生长调节剂的MS基本培养基，蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，pH 6.0。
培养条件培养温度为25±3℃，光照强度为2000勒克斯，光照时间为12小时/天。
选取其中结构较致密的白色或淡黄色愈伤组织，接种到含1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的培养基中分化培养15天后即可见到少量芽原基，30天后可见到明显的小芽丛，再生率可达70％。植株再生以器官发生方式为主，在苗丛形成的同时或随后在基部发出须状根。再生苗在室温下炼苗3天后，移栽成活率95％以上。
附表1MS基本培养基(Murashige & Skoog，1962)成分
附表1MS基本培养基(Murashige & Skoog，1962)成分
权利要求
1.一种建立中华结缕草再生体系的方法，其特征在于以中华结缕草成熟胚为外植体，进行离体培养。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述方法包括四个培养阶段(1)以成熟胚为外植体，离体培养直接诱导愈伤组织，(2)愈伤组织的继代培养，(3)愈伤组织诱导体细胞胚，(4)体细胞胚诱导再生植株，其中(1)(2)为黑暗培养，(3)为200～500勒克斯的弱光培养，(4)为1500～3000勒克斯的光培养，整个培养过程，培养温度为25±3℃，第(1)阶段培养40天转接，第(2)(3)(4)每培养20天换新鲜培养基。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，第(1)、(4)阶段的基本培养基为MS培养基，第(2)、(3)阶段的基本培养基是HMS培养基，所用植物生长调节剂为从生长素类物质2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA和细胞分裂素类物质6-苄基氨基腺嘌呤6-BA、激动素KT和玉米素ZT的组合中选择出的任何一种、两种或三种，在第(1)培养基中还添加了核黄素VB2，蔗糖和葡萄糖。第(1)培养阶段添加了水解酪蛋白CH或乳蛋白LH。整个培养过程所用的培养基pH值为5.5～6.2。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，HMS培养基的成分为1/2MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐，核黄素VB21.0mg/L，盐酸噻胺(VB1)1.0mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆辛0.5mg/L，肌醇0.1g/L。
5.按照权利要求3所述的方法，涉及的MS为基本培养基，其成分见附表1。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，在第(1)阶段的培养基中所用激素为2.5～6mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA，还添加了核黄素VB20.5～2.0mg/L和酶水解酪蛋白200～500mg/L，在第(2)阶段的培养基中所用激素为0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA。在第(3)阶段的培养基中所用激素为0.05～5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.01～2mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA，在第(4)阶段的培养基中含有激动素KT 0.1～0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D1.0～3.5mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.1mg/L。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，在第(1)阶段的培养基中添加的碳源为蔗糖20～30g/L，葡萄糖15～25g/L。第(2)(3)(4)阶段的培养基中添加剂的碳源为蔗糖30～60g/L。
8.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，在第(2)阶段用于愈伤组织继代培养及保持其生长质量的培养基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0～4.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～0.5mg/L。
9.按照权利要求2所述的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)外植体灭菌后接种于含2.5～6mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA、核黄素VB20.5～2.0mg/L、酶水解酪蛋白200～500mg/L以及蔗糖20～30g/L和15～25g/L葡萄糖的培养基中培养40天；(2)诱导获得的愈伤组织接种于添加0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的培养基中；(3)继代的愈伤组织在含1.0～4.0mg/L 2，4-二苯氧乙酸2，4-D，0.1～0.5mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA的培养基中培养；(4)继代培养过的愈伤组织接种于含0.1～0.3mg/L激动素KT、1.0～2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.1mg/L 6-苄基氨基腺嘌呤6-BA及30～60g/L蔗糖的培养基中培养诱导胚性愈伤组织及体细胞胚；(5)诱导得到的体细胞胚接种于含激动素KT0～0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D1.0～2.0mg/L，6-苄基氨基腺嘌呤6-BA0.1mg/L的培养基诱导再生植株，其中(1)(2)为黑暗培养，(3)为200～500勒克斯的弱光培养，(5)为1500～3000勒克斯的光培养，整个培养过程，培养温度为25±3℃，第(1)阶段培养40天转接愈伤组织，第(2)(3)(4)阶段，每培养20天换一次新鲜培养基。
全文摘要
本发明公开一种建立中华结缕草成熟胚再生体系的方法，主要步骤包括以中华结缕草成熟种子为材料，在诱导培养基中培养获得愈伤组织，经继代培养后，在胚性愈伤组织诱导培养基及再生培养基中高频诱导体细胞胚及再生植株。在诱导愈伤组织培养基通过添加一定配比的2，4－D和6－BA以及高浓度碳源有效地提高了愈伤组织的诱导率。在继代培养到再生培养过程，通过不断改变植物生长调节剂浓度配比及核黄素等含量，使植株再生率明显提高，达60％以上。
文档编号A01H4/00GK1746294SQ20051008773
公开日2006年3月15日 申请日期2005年8月8日 优先权日2005年8月8日
发明者孙振元, 韦善君, 韩蕾, 钱永强, 巨关升 申请人:中国林业科学研究院林业研究所