专利名称：在动物中促进生长的活体细菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物生长促进领域。尤其是，本发明涉及了表达F4(或K88)附着因子的非致病大肠杆菌菌株的应用，用以促进动物生长或在一群动物实现均一化生长。
背景技术：
对于农业和饲养业专家来说生长促进是至关重要的课题，在屠宰前或为了研究目的他们主要是寻找健康动物的优化生产。在产肉动物的情况下，这种关注引导他们使用对动物以及对人体都是有益的生长促进产品。
在农业和饲养环境中的主要应该注意的是体重丢失、伴生疾病反复发作的低生长速率、药物成本和死亡率，其引起了动物产量的降低和最终导致可观的经济损失。这种情形中，断奶后或孵化后动物特别容易受到阻止生长试剂的攻击。
例如，由非卫生条件或者动物间过度亲近而导致的传染是导致上述结果的最普遍因素。
用于解决这种问题的常规方法是在饲料中使用抗生素生长促进剂。但是，抗生素生长促进剂的使用也有很大的争议，因为众所周知，即使使用亚治疗剂量，抗生素的持续使用也可以导致在接受处理的动物中对抗生素抗性菌菌株的筛选(Arnold S等人；Wegener HC等人和Schwarz S等人)。事实上，最近十年，已经出现了致病性更强的和抗生素-抗性更强的大肠杆菌菌株，和/或管理的改变(较早断奶)，和/或一些新的欧洲规章，其禁止将抗菌剂作为生长促进剂或者进行预防处理(疾病的预防)以及禁止使用高水平的重金属，如饲料中的氧化锌的使用。在动物生产中断奶时期与高抗生素的使用特别相关。
因此，由于抗生素抗性的复发和对抗生素残余的过敏反应，以及对耕地土壤的污染，目前越来越限制抗生素生长促进剂和重金属的使用。
另一个农业和饲养专家必须面对的问题是一群动物中生长的不均一性。尤其是，在以优化肉产品为目的时，例如，农民希望生产出一致的动物群，其在屠宰前显示最大的均一化生长速率可能性，以避免增加成本。但是，动物一般表现出不同的生长速率并且尤其对感染剂表现出不同的易受攻击性。
因此，就不断需要创新药剂，其促进动物生长并且进一步有利于对动物生长的均一化和优化作出贡献。
发明概述本发明的一个目的是有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株促进动物生长的应用。
本发明的另一个目的是有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株在一群动物实现均一化生长的应用。
本发明进一步的目的是提供一种促进动物生长的方法，所述方法包括向所述动物喂养有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株的步骤。
本发明的另外一个目的是提供在一群动物中实现均一化生长的方法，所述方法包括向所述动物喂养有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株的步骤。
由于F4+非致病大肠杆菌菌株的使用，本发明发现一个对特别需要动物的快速生长促进和生长均一化的有利之处。例如，F4+非致病大肠杆菌菌株在产肉动物饲养中的使用，与没有进行处理的对照相比，其可使这些动物在较短的时间内达到市场体重或屠宰体重。
本发明进一步发现一种促进实验室动物(例如，大鼠和小鼠)生长和均一化生长的有利之处。如可以理解的，使这些实验动物更快地和更均一地达到了给定体重，优选提供了更为均一化和更容易获得的动物样品。
本发明的另一个有利之处是没有借助抗生素用于促进动物生长。所以，对于特别影响断奶后动物的诸如抗生素抗性细菌菌株或者抗生素过敏所引发的问题就被缓解了。
另外，既然重金属如氧化锌没有被添加到动物的饲料中，土壤的污染也避免了。换言之，本发明还提供了环保的应用和方法。
通过本发明方法获得的改进的饲料转化效率，使处理的动物可以在消耗更少食物的情况下达到任意所需的体重(与没有处理的动物达到相同的体重相比)。另外，当实行本发明中方法的时候，在经处理的动物中既没有发现毒副作用也没有发现细菌引起的一般健康状况的降低。
本发明和它的有利之处可以参照附图，通过阅读下述优选实施方案的非限定性说明来更好的理解。
图1显示的是根据本发明所用的优选F4+非致病大肠杆菌菌株的基因组DNA的Xbal-消化的脉冲-电场凝胶电泳图的照片。优选的菌株是coliPROtec菌株。
图2显示的是在用F4+大肠杆菌菌株处理后每个阶段猪的体重增加的百分比的图。
图3显示的是在用F4+大肠杆菌菌株处理后每个阶段小鼠的体重增加的百分比的图。
发明详述本发明源自F4+非致病大肠杆菌菌株的新的应用。更特别地并且根据第一方面，本发明涉及有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株以促进动物生长的应用。
根据第二方面，本发明涉及有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株在一群动物中实现均一化生长的应用。
根据相关方面，本发明涉及促进动物生长的方法和在一群动物中实现均一化生长的方法。
两种方法包括使用有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株来喂养动物的步骤。
本发明所用菌株的特征在于它表达附着因子F4，它是非致病的。根据本发明优选的方面，F4+非致病大肠杆菌菌株选自coliPROtec(保藏号IDAC 210105-01)，JG1329，M226，P03-7586(175)或pMK005。更优选，本发明构思了使用coliPROtec菌株和/或它的突变体或变异体(详细情况参见实施例I)。
这里所用的术语coliPROtec菌株的“突变体”和“变异体”被用作菌株，其具有coliPROtec菌株的所有识别特征，如实施例I所提供的。突变体或者变异菌株可因具有其基因组或者它的一部分被鉴别，其在高严谨条件下可以与coliPROtec菌株的基因组杂交。
根据本发明上面所提及的方案，上面所说明的菌株以“有效量”来使用。这种“有效量”的描述，它应该被理解为F4+非致病大肠杆菌菌株的如下量，例如，其能够引起研究者或兽医所涉及的组织、系统或动物的生物学反应。换言之，这种F4+非致病大肠杆菌菌株的有效量，其足以促进动物生长以及在一群动物中实现均一化生长。
应该理解，本发明构思的菌株的优选有效量是每个动物中至少大约5E7菌落形成单位(CFU)，并且更优选范围是从大约5E7至大约5E9CFU的目标菌株。“大约”的意思是所述菌株CFU值可以在一个特定的范围内变化，其依赖于评价这种菌株CFU数值所用的方法的误差范围。
所用的有效量可以根据许多因素的而变化，例如，动物的类型，动物初始体重，动物的生长阶段，环境如动物设施，类型和生产管理，设施的卫生条件，断奶或孵化后的应激，所用的饲料和添加剂，动物的健康和伴生疾病或处理，是应当考虑的因素。
如上面所提到的，生长促进和生长均一化的目标被在动物中实现了。如这里所用的，术语“动物”是指任意适用于本发明的年轻的或成年的动物。更优选，术语“动物”是指断奶后或孵化后的动物。
既然在断奶后动物或孵化后动物中，母体喂养和关照不再存在，所以生长促进剂是极其重要的。例如，在为了肉而对动物进行喂养的情况下，这种关注是特别重要的。
在本发明的上下文中，所用的优选的动物可以是下面的任何一种农场动物如猪以及优选是断奶后的猪；家禽如鸡，鸭，鹅，母鸡或火鸡，优选是小鸡，以及更优选是肉鸡；牛如母牛，阉牛，公牛或小牛；比赛动物如鸵鸟或野牛；驯化动物，如猫或狗；以及实验室动物，如小鼠或大鼠。当然这些动物的特征都在于生长促进和生长均一化是期望的特征，尤其当以肉生产为目标的时候。
按照上面的观点，可以理解动物实际上可在整个生长过程中接受本发明的菌株，或者只在生长阶段的一部分时间中，例如早期阶段和/或准备屠宰的阶段中接受。
根据本发明优选的方面，断奶后动物优选是猪，优选在实验开始的时候是从大约10天至大约28日龄。目标猪更优选是17日龄。
根据本发明的另一个优选的方案，断奶后动物优选是小鼠，优选在实验开始的时候是从大约18天至大约28日龄。目标小鼠更优选是21日龄。
根据本发明的另一个优选的方面，孵化后动物优选是小鸡，优选在实验开始的时候是从大约1天至大约7日龄。目标小鸡更优选是1日龄。可以理解表述“大约1日龄”意思是出生或孵化后24小时或更少。
根据本发明优选的方面，可以提供给猪的有效量范围优选是从5E7至5E9CFU/猪，以及更优选大约1E9CFU/猪。
根据本发明另一个优选的方面，可以提供给小鸡的有效量范围从大约5E7至5E9 CFU/小鸡，以及更优选大约5E8 CFU/小鸡。
根据本发明又一个优选的方面，可以提供给小鼠的有效量范围从大约5E7至5E9 CFU/小鼠，以及更优选大约5E8 CFU/小鼠。
在本发明方法的具体上下文中，菌株的有效量可以以单剂量形式喂养动物，或者根据摄生法提供，只要其是有效的。术语“喂养”，应该被理解为将本发明的F4+非致病大肠杆菌提供给处理中的动物，从而菌株可以最终到达肠胃道，以及更优选是肠道。
例如，按照本发明优选的方面，喂养可以通过向目标动物口服喂养菌株来实现。
根据本发明的优选方面，菌株优选以冻干形式喂养动物。根据另一个优选方案，本发明的菌株用稀释剂或载体稀释或悬浮。
根据本发明，F4+非致病大肠杆菌菌株用作在动物中“促进生长”或者“在一群动物中实现均一化生长”。这些表述是指使用大肠杆菌菌株以增加动物生长速率。换言之，目标菌株一经处理，与未处理的对照相比，动物体重增加地更快并且更均一化。更特别地是，表述“均一化生长”，在本发明的上下文中是指对一群动物生长速率的相对控制。这种控制在动物饲养和产肉领域中负有特定的目的，其中给定组中的所有动物通过传统量的饲料以及无毒性生长促进剂必须理想地，在整群动物中以及相对相等的时间内更快达到它们的生长峰值。当这些条件都达到时，饲养成本、屠宰成本和运输成本全部可以被优化。
为了评价生长促进和生长的均一化，可测定本领域内已知的大量参数。更特别的是，这些参数，单独评价或者联合评价，其可以包括i-平均体重(MBW)一组动物中体重的平均值；ii-平均日增重(DWG)在特定的时期内，每组动物每天体重增加的平均值；iii-饲料摄入(FI)在特定的时期内每个动物或每组动物的饲料消耗量；和iv-饲料转化率(FCR)特定时期内每种动物或每组动物的饲料摄入/相同时期内相同动物或相同组动物的体重增加。
有利地，本发明的菌株可以单独使用或与饲料可接受载体结合使用。如这里所使用的，表述“饲料可接受载体”是指任意的载体、稀释剂或赋形剂，其与本发明菌株是相容的并且提供给动物时没有负作用。在本领域中已知的合适饲料可接受载体包括，但是不限于，水、盐、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。这种载体有利地对菌株是无毒的并且对动物是无害的。它也可以是生物可降解的。本领域的技术人员知道如何选择合适的载体，例如对于环境是无害的载体。也优选，这种载体是适当的固体或液体的饲料可接受载体。
合适的固体饲料可接受载体是无毒的可吸收载体。例如，这种固体饲料可接受载体可以是一种普通的固体饲料，例如典型动物饮食中的组分，包括谷物产品，例如大麦粉、玉米粉或小麦饲料，坚果和种子产品，例如剥皮破碎坚果饼或棉籽饼，或提取的棉籽饼，与少量的例如羽粉、海藻粉、骨粉，骨质面粉(bone flour)，化石粉，盐、尿素和维生素一起；或者它也可以是惰性的没有营养价值的固体稀释剂或载体，例如高岭土、云母、碳酸钙、漂白土、活性白土、碾碎的牡蛎贝壳或碾碎的石灰石；或者它也可以是淀粉或乳糖。
适合的饲料可接受载体是，例如，水以及优选为饮用水；牛奶例如全乳或脱脂乳；或者胰酶大豆肉汤(TSB)。
下面的实施例说明了本发明的广阔的潜在应用，并且不试图限制其范围。这里在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行修饰和改变。虽然那些与这里所描述的相似或相等的任意方法和原料也可以应用到测试本发明的实际中，但是这里描述了优选的方法和原料。
实施例实施例I大肠杆菌菌株(coliPROtec)及其克隆的说明根据本发明的优选特征，使用F4+非致病大肠杆菌菌株(下文中称coliPROtec或JFF4菌株)。ColiPROtec菌株于2005年1月21日保藏在加拿大国际保藏单位(International Depositary Authorityof Canada)(IDAC)，给予的保藏号是IDAC 210105-01。
1.来源该菌株是从健康猪的粪便中，由加拿大魁北克省Saint-Hyacinthe，蒙特利尔大学，兽医系的大肠杆菌实验室分离出来的。动物是从位于加拿大魁北克省Monteregie的当地农场购买的。
2.菌株的稳定性coliPROtec菌株的F4菌毛(免疫原蛋白)的表达利用体外途径进行稳定。进行三(3)个连续10L的发酵。每次发酵完成以后，培养液被接种在琼脂上，并且使用玻片凝集测试针对F4菌毛表达进行10个菌落的检测。合并来自F4+菌落的细菌并且用于连续发酵。菌株然后被冻结在加入了20％甘油的胰酶大豆肉汤(TSB)中。融化后，菌株的F4表达不总是稳定，并且需要几个连续发酵(大约10次)以得到稳定的菌株。在从猪中提取后经历大约15次传代之后稳定菌株被冻干。冻干的培养物被用于产生coliPROtec的主要种子。
3.生化分析菌株的鉴定使用API系统进行。获得的鉴定编码5544572被认为是大肠杆菌菌株。
4.致病分型coliPROtec菌株的致病分型通过菌落杂交和/或聚合酶链式反应(PCR)进行。致病分型结果显示coliPROtec菌株对F4是阳性的，而对下列毒素是阴性的LT，STa，STb，STaH，Stx1，Stx2，VT2vp1，VT2vh，Aero，Tsh，CDT3，CDT4，CNF1，CNF2，HlyA，HlyC，Ehx，East1。
另外，coliPROtec菌株对下列粘着素或推定粘着素是阴性的F5，F6，F18，F41，F17，P菌毛，AIDA，AFA，SFA，CS31a，daaE，Paa，aggR，ARF/1，Eae，CFAI，CFAII(CS1coo)，CFAII(CS3cst)。
5.DNA指纹图谱coliPROtec菌株通过脉冲-电场凝胶电泳来表征(图1)。
通过反复体外传代，选择F4菌毛表达在发酵后稳定之特殊的菌株克隆。
6.表格和数据表的概述下面试验所用到的菌株在下面的表1和数据表详细说明。
表1F4+非致病性野生型大肠杆菌菌株
F4+非致病性重组大肠杆菌
F4-阴性非致病性大肠杆菌
实施例II乳猪口服F4+非致病大肠杆菌菌株对猪的生长的影响A-ColiPROtec对乳猪重量增加的影响1.大肠杆菌菌株将活体大肠杆菌F4+非致病菌株coliPROtec悬浮在TSB中以口服形式喂养乳猪。这个菌株在实施例I中进行了介绍。
2.实验2.1动物对总共45只处理的和45只未处理的猪进行五(5)次试验。这些猪来自于不同的商业农场。
2.2试验这个试验在蒙特利尔大学兽医系按照下面的程序进行。
2.2.1试验组
2.2.2试验程序
2.2.3评价参数在本检验中，评价参数是第1组和第2组在第5天和第20天，乳猪的重量和每天增加的重量。
3.结果coliPROtec菌株的无害研究中，在动物体重增加方面观察到了对产品的正面效果。如表2和3所示，在断奶后开始利用单一口服剂量coliPROtec处理过的猪，与未处理的动物相比，每日体重增加高53g。尤其是，处理两周以后，经处理的猪比未处理的猪重849g。
表2动物的重量
表3日增重量
4.分析与结论在断奶后第5天，给予coliPROtec，第1组和第2组(未处理和用coliPROtec处理)不具有统计学上的差异。但是在断奶后第20天(处理后15天)，与未处理的动物相比，处理过的动物重849g并且日增加重量多53g。这些差异具有统计学上的显著性。
注意，传统抗生素生长促进剂一般体重增加3.3至8.8％(Doyle，M.E.，Food Research Institute，University of Wisconsin，2001)。正如这里所显示，coliPROtec菌株在单剂量给药两周后使日增加重量增长了11％。
B-口服活体F4+非致病大肠杆菌菌株对乳猪生长的影响1.大肠杆菌菌株所用菌株在实施例I中进行了介绍。
2.实验2.1动物四十九(49)只17日龄的乳猪(其来自于干净、常规养猪场)用于本试验。小猪的体重是5±1Kg。
2.2试验2，2.1试验分组在断奶时，猪被转移至动物设施中，封闭的房间，加拿大魁北克省Saint-Hyacinthe Laboratoire d’Hygiène Vétérinaire etAlimentaire。实验分析是在加拿大魁北克省Saint-Hyacinthe EcLLaboratory，FMV进行。
2.2.2试验程序
2.2.3参数评价试验中，猪可以随意进食饲料和水。它们每天被观察两次确定一般健康状况和是否有痢疾存在。从第0天至14天，猪被喂养含有23％蛋白质没有加入氧化锌或者抗生素的商购启动饲料。在最后3天，饲料含有19％蛋白质。
3.结果3.1猪的F4+大肠杆菌和病原性ETEC状态试验的开始，即在处理之前，所有组中的一些猪被植入带有毒素STb的F4+菌株(表4)。对照组(第1组)和利用F4-大肠杆菌菌株(第2组)处理的组中的所有猪，在第9天植入F4STb菌株(表5)。尽管该菌株(O45F4STb)不是通常在猪中导致断奶后腹泻的ETEC菌株，但是我们不排除它是致病性的。但是试验中没有动物证明临床征兆与断奶后腹泻相关。
由于对照组都被植入F4+菌株，所以很难评价检测的F4+菌株在动物生长过程中的影响。
表4处理前关于F4+大肠杆菌菌株排泄物的猪之状态的鉴定(第1天；粪便PCR分析)
*1处理第1组；对照，第2组；在第1天和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至7组；在第1和第4天F4+菌株。
表5试验中关于F4+大肠杆菌菌株排泄物的猪之状态的鉴定
*1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
3.2基本健康状况和腹泻分析试验中所有动物健康状况良好。第2，3，4，6和7组中的一些动物出现轻度腹泻，但是只有一天。
3.3生长情况分析表6使用F4+大肠杆菌菌株处理后猪的重量
*1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
利用重复测量的线性模型，以天数作为主题内因素，以组作为主题间因素，显示处理对于猪的生长没有影响(p＝0.90)。利用对照分析(post hoc)每天检查每个处理组(第2至7组)和对照组(第1组)之间的差异(表6)。只有在第9天，第7组的重量显著高于对照组(p＝0,045)。其它重量差异不显著。
此外，第3和第7组(分别利用JFF4和重组菌株进行处理)在第4和9天具有更高的体重，但是随后各组间体重很相似(表6)。在试验的第一个阶段(第0至4天)，第3和第7组重量增加的百分比分别是18和15％，而对照组都为11％(第1和第2组，图2)。在第一阶段第4组观察到较低的重量增加，原因是其中3只猪体重减少了。
在第二阶段(第4至9天)，第2，4，6和7组体重增加的百分比高于未处理的组(第1组)。在第三阶段(第9至14天)体重增加的百分比更为均一化，并且在最后阶段第2和第3组比第1组高。
实施例III产肉小鸡口服形式的活体F4+非病原大肠杆菌对产肉小鸡生长的影响1.大肠杆菌菌株所用菌株在实施例I中进行了介绍。
2.实验2.1动物63只雄性1日龄Cobbs产肉小鸡，来自于一个干净的、常规养鸡场。孵化后小鸡被转移至动物设施。
2.2试验2.2.1试验分组孵化后小鸡被转移至动物设施，封闭房间，位于加拿大魁北克Saint-Hyacinthe，Facultéde médecine vétérinaire。实验室分析是在加拿大魁北克Saint-Hyacinthe，FMV，EcL Laboratory的指导下进行的。
2.2.2试验程序
2.2.3评价参数平均体重(MBW)，平均日增重(DWG)，饲料摄入(FI)，和饲料转化率(FCR)在本次分析中均被评价。
在试验中，小鸡可以随意进食饲料和水。它们每天被观察两次确定一般健康状况和腹泻的出现与否。从第0至第24天，小鸡接受标准商业鸡饲料(没有抗生素)。从第24天至第28天它们接受标准成长商业饲料(没有抗生素)。
3.结果3.1小鸡的F4+大肠杆菌和病原性ETEC状态处理前，在第0天没有排泄物样品呈F4、STa、STb或者LT阳性。F4+大肠杆菌的排泄物在处理组(第3至7组)在第2天和4天被检测到，但是随后消失。
3.2一般健康状况和腹泻分析在实验中动物处在良好健康状态并且没有观察到腹泻现象。第7组中的三(3)只动物在第23或第25天因为它们一般健康状况恶化而被安乐处死。在这些鸡中没有观察到胃-肠临床症状。来自病理学院(加拿大魁北克省，Saint-Hyacinthe，Facultéde médecine vétérinaire)的关于这些鸡的尸检报告显示这些鸡死于腹水综合症，一种常见的非感染性疾病，一般与产肉小鸡的心肌功能不全有关系。
3.3.成长情况分析表7利用F4+大肠杆菌菌株处理后小鸡的体重 *1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
*23只安乐死动物被排除。
表8利用F4+大肠杆菌菌株处理后小鸡日增重 *1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
*23只安乐死动物被排除。
JFF4菌株利用菌株JFF4处理的第3组的MBW在第9、14、18天比未处理的组(第1组)和利用F4-阴性菌株处理过的组(第2组)高(表7)。利用菌株JFF4处理的第3组的DWG在第二次处理之后的时间(第4和9天之间的阶段)和第四阶段(第14至18天；表8)时比两个对照组(第1和第2组)高。
其它F4+菌株第5，6和7组的MBW在第6、14、18和23天比两个对照组(第1和第2组)高。相对比，它只在第9天比第4组高(表7)。
所有利用F4+菌株处理过的组的DWG在处理后的阶段(第4至9天)都比两个对照组高，在第四阶段(第14至18天)第5组高(表8)。
F4-阴性菌株利用F4-阴性菌株处理过的组的MBW和DWG非常接近或低于未处理的组。
利用重复测量的线性模型，以天数作为主题内因素，以组作为主题间因素，显示处理对于小鸡生长没有影响(p＝0.97)。进行对比分析每天检查每个处理组(第2至第7组)和未处理组(第1组)之间的差异。每天观察到的每个处理组和未处理组的重量没有显著差异。在描述性分析中所观察到的差异不显著，可能是因为每组小鸡体重的超过预期的高可变性造成的，尤其是对于未处理组。
3.4饲料摄入(FI)表9利用F4+大肠杆菌菌株处理后小鸡的饲料摄入(24小时时间段) *1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
*22只安乐死动物。(n＝7而不是9)。
菌株JFF4第3组(JFF4)的FI在第2天和第17天比未处理组(第1组)和用F4-阴性菌株处理的组(第2组)低(表9)。
其它F4+菌株FI比两个对照组(第1和2组)低的只有第4组(第2，9，17天)和第6组(第17天)。
F4-阴性菌株用F4-阴性菌株处理组的FI在第9、17和24天比未处理组(第1组)低。
线性的模型显示处理对于小鸡的饲料消耗没有影响(p＝0.77)。
3.5饲料转化率(FCR)表10利用F4+大肠杆菌菌株处理后小鸡的饲料转化率 *1第2天；该组在第0至第4天总的DWG/第2天的FI，第9天；该组在第4至第14天总的DWG/第9天的FI，第17天；该组在第14天至第23天总的DWG/第17天的FI，第24天；该组在第18至第28天总的DWG/第24天的FI。
*2处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至第7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
*32只安乐死动物(n＝7而不是9)菌株JFF4第3组(JFF4)的FCR，在第2和第17天比未处理组(第1组)和用F4-阴性菌株处理的组(第2组)低(表10)，与FI相似(表9)。比率只有在第9天比未处理组低。
其它F4+菌株FCR比两个对照组(第1和第2组)低的是第7组(第2天)，第3和4组(第9和17天)，和第3和6组(第17天；表4)。
F4-阴性菌株用F4-阴性菌株处理组的FCR只在第17天比未处理组(第1组)低。
线性模型显示处理对小鸡饲料转化率没有影响(p＝0.68)。
4.分析与结论结果显示F4+非致病大肠杆菌菌株，包括JFF4菌株，增加了小鸡的生长情况。生长情况被正面影响，尤其是在第二次治疗后紧跟着的日子里，在第4至9天期间所有处理组的DWG均比未处理组高。对于两个F4+菌株，包括JFF4菌株，在第14至18天其也具有比两个对照组高的DWG。在处理后紧跟着的日子(第4至9天)里生长情况的改进导致直到第18天(对于某些组，直到第23天)用F4+菌株处理的组都比两个对照组具有更高的重量。
在处理后的短期阶段所观察到的高DWG正面影响了处理组的MBW直至第18或第23天，这依赖于菌株。处理组较大的重量与较高的饲料摄入之间没有关联。此外，处理组的FI有时比未处理组的低，因此降低饲料转化率。
既然利用F4-阴性大肠杆菌菌株处理没有显示这种影响并且与未处理组具有相似的生长情况，因此这种对生长情况的影响与F4决定因子或表达F4决定因子的菌株是相关的。
实施例IV断奶小鼠口服形式活体F4+非致病性大肠杆菌菌株对断奶小鼠生长的影响1.大肠杆菌菌株所用菌株在实施例I中进行了介绍。
2.实验2.1动物七十(70)只健康的21日龄断奶小鼠。在断奶期，小鼠被转移至动物设施。
2.2试验2.2.1.试验分组在断奶时，小鼠被转移至动物设施，一个封闭的房间，位于加拿大魁北克省的Saint-Hyacinthe，Laboratoired’Hygiéne Vétérinaireet Alimentaire。试验依然在加拿大魁北克省的Saint-Hyacinthe，FMV，EcL Laboratory指导下进行。
2.2.2试验进程
变量评价平均体重增量(MBW)，饲料摄入(FI)和饲料转化率(FCR)。
试验中，小鼠可以随意进食饲料和水。它们每天被观察两次以确定基础健康状况和腹泻的存在与否。
3.结果3.1.小鼠的F4+大肠杆菌和致病性ETEC状态在第0天没有排泄物F4、STa、STb或者LT呈阳性。在利用F4+菌株进行第二次处理后的第1天至第10天，在第3，4，5和7组中检测到F4。试验中任何时间都没有没有检测出STa、STb或LT。
3.2.一般健康状况和腹泻评价试验中所有动物健康状况良好并且没有观察到腹泻。
3.3.生长情况的评价表11用F4+大肠杆菌菌株处理后小鼠的平均体重
*1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至第7组；在第1和第4天F4-阳性菌株。
各组之间没有观察到体重差异。利用重复测量的线性模型，以天数作为主题内因素，以组作为主题间因素，显示处理对于小鼠生长没有影响(p＝0.99)。进行对比分析每天检查每个处理组(第2至第7组)和对照组(第1组)之间的差异。每天观察到的每个处理组和未处理组之间的体重没有差异。
所有组在28天的试验阶段里体重增加的百分比相似。另一方面，第1，2和3组只有在第4天有轻微的增加(图3)。
3.4饲料摄入(FI)
表12用F4+大肠杆菌菌株处理后小鼠的饲料摄入 *1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株，第3至第7组；在第1和第4天F4+菌株。
JFF4菌株第3组(JFF4)的FI，在处理后的早期第4至第9天比未处理组(第1组)和用F4-阴性菌株处理组(第2组)低。但是，它在后面阶段的大多数时间，除了第14至18天外都低于未处理组但是与F4-阴性菌株处理组相近(表12)。
其它F4+菌株所有其它F4+菌株的FI，在处理后的早期第4至第9天都比对照组(第1和第2组)低(表12)。随后，FI的变化依赖于菌株(表12)。
F4-阴性菌株用F4-阴性菌株处理组(第2组)的FI直到第9天都与未处理组(第1组)观察到的相近，并随后低于后者。因此，第2组在处理后观察到的FI的减少比用F4+菌株处理组观察到的晚。
线性模型显示处理对饲料摄入有显著影响(p＜0.0001)。对比Dunnett’s测试显示对照组(第1组)的饲料消耗比分别用862、JFF4、JG1329和pmK005菌株处理的第2，3，4和7组的消耗高(表12)。对于这些组，小鼠吃较少饲料达到相同的重量。
3.5饲料转化率(FCR)
表13用F4+大肠杆菌菌株处理后小鼠的饲料摄入
*1处理第1组；对照，第2组；在第1和第4天F4-阴性大肠杆菌菌株；第3至第7组；在第1和第4天F4+阳性菌株。
尽管差异并不显著，但是在第0天至第14天用JFF4处理组的FCR比其它任意处理组都低。随后，各组之间的FCR更为不同。线性模型显示处理对FCR没有显著影响。
4.分析与结论F4+大肠杆菌对生长的影响看起来不如在猪和小鸡中观察到的那么重要。但是，观察到了对FI和FCR的影响，尤其是在小鼠的成长阶段(前14天)。既然CD-1小鼠不是遗传选择用于进行生长情况研究，如本研究中所用的鸡和猪的情况，可能是由于小鼠迅速达到最大体重增加量，并且因此缩小了F4+菌株对体重增长的影响范围，因而只影响了饲料摄入。
Bernardeau等人报道了在使用常规加富饮食进行过量进食的小鼠中没有发现乳酸杆菌对生长促进的影响，但是在喂养亚-标准饮食(例如以大麦为基础的)的小鼠中益生素给药的效果得到了提高。
参考文献Arnold S.，Gassner B.，Giger T.和Zwahlen R，禁止抗菌生长促进剂在饲料中使用没有导致在猪的饲养中增加抗生素在加药饲料中的治疗使用(Banning antimicrobial growth promoters infeedstuffs does not result in increased therapeutic use ofantibiotics in medicated feed in pig farming.)Pharmacoepidemiology and Drug Safety 2004；13323-331。
Wegener HC，Aarestrup FM，Bogo Jensen L，Hammerum AM和Bager F.，欧洲食用动物中抗菌生长促进剂的使用以及肠球菌对治疗型杀菌剂药物的抗性(Use of antimicrobial growth promoters infood animals and Enterococcus faecium resistance to therapeuticantimicrobial drugs in Europe.)Emerging Infectious Diseases1999；5(3)329-335。
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Bernardeau M，Vernoux JP和Gueguen M.，益生乳酸菌在促进断奶后瑞士小鼠生长中的安全性和功效(Safety and efficacy ofprobiotic lactobacilli in promoting growth in post-weaningSwiss mice.)International Journal of Food Microbiology 2002；77(1-2)19-27。
权利要求
1.有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株在动物中促进生长的应用。
2.有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株在一群动物中实现均一化生长的应用。
3.根据权利要求1或2的应用，其中所述有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株与饲料可接受载体结合。
4.根据权利要求1至3中的任一项应用，其中所述有效量是每只动物至少大约5E7 CFU的F4+非致病大肠杆菌菌株。
5.根据权利要求4的应用，其中有效量范围是在每只动物中从大约5E7至大约5E9 CFU的F4+非致病大肠杆菌菌株。
6.根据权利要求1至5中的任一项应用，其中F4+非致病大肠杆菌菌株由2005年1月21日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)的大肠杆菌菌株，保藏号IDAC 210105-01，其突变体或变异体组成。
7.根据权利要求1至6中的任一项应用，其中所述动物或多个动物选自断奶后动物和孵化后动物。
8.根据权利要求7的应用，其中所述断奶后动物是大约10日至大约28日龄。
9.根据权利要求7的应用，其中所述孵化后动物是大约1日至大约7日龄。
10.根据权利要求7或8的应用，其中所述断奶后动物是猪。
11.根据权利要求7或8的应用，其中所述断奶后动物是小鼠。
12.根据权利要求7或9的应用，其中所述孵化后动物是家禽。
13.根据权利要求12的应用，其中所述家禽是小鸡。
14.在动物中促进生长的方法，所述方法包括用有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株喂养所述动物的步骤。
15.在一群动物中实现均一化生长的方法，所述方法包括用有效量的F4+非致病大肠杆菌菌株喂养所述动物的步骤。
16.根据权利要求14或15的方法，其中所述动物被口服喂养。
17.根据权利要求14至16中的任一项的方法，其中所述动物是用结合固体或液体饲料可接受载体的F4+非致病大肠杆菌菌株来喂养的。
18.根据权利要求17的方法，其中所述固体饲料可接收载体是普通的固体饲料。
19.根据权利要求17的方法，其中所述液体饲料可接收载体是水。
20.根据权利要求17的方法，其中所述液体饲料可接收载体是牛奶。
21.根据权利要求14至20中的任一项的方法，其中所述有效量是每只动物至少大约5E7 CFU的F4+非致病大肠杆菌菌株。
22.根据权利要求17的方法，其中有效量的范围是每只动物从大约5E7至大约5E9 CFU的F4+非致病大肠杆菌菌株。
23.根据权利要求14至22中的任一项的方法，其中F4+非致病大肠杆菌菌株由2005年1月21日保藏在加拿大国际保藏单位(IDAC)的大肠杆菌菌株，保藏号IDAC 210105-01，其突变体或变异体组成。
24.根据权利要求14至23中的任一项的方法，其中所述动物选自断奶后动物和孵化后动物。
25.根据权利要求24的方法，其中所述断奶后动物是大约10日至大约28日龄。
26.根据权利要求24的方法，其中所述孵化后动物是大约1日至大约7日龄。
27.根据权利要求24或25的方法，其中所述断奶后动物是猪。
28.根据权利要求24或25的方法，其中所述断奶后动物是小鼠。
29.根据权利要求24或26的方法，其中所述孵化后动物是家禽。
30.根据权利要求29的方法，其中所述家禽是小鸡。
全文摘要
本发明涉及F文档编号A23K1/18GK1913787SQ200580003938
公开日2007年2月14日 申请日期2005年2月3日 优先权日2004年2月3日
发明者E·纳多, J·M·费尔布拉泽 申请人:蒙特利尔大学