专利名称：一种测定肠上皮紧密连接完整性的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定肠上皮紧密连接完整性的方法，本发明还涉及该方法在肠屏障功能障碍的动物实验研究中的应用。
背景技术：
生物体中，各种上皮细胞通过细胞之间的连接，形成了保护组织的上皮屏障，包括肠上皮屏障、呼吸道上皮屏障等。相邻上皮细胞之间的连接方式有很多种，其中紧密连接是最重要的连接方式之一。它可以调控水、可溶性物质的细胞旁转运，阻止一些毒性大分子和微生物的通过。这种通透性调节在维持上皮屏障方面起着重要作用(见图1)。最近的研究发现，肠屏障功能障碍总是伴随着肠上皮细胞紧密连接完整性的改变。如在克隆氏病和溃疡性结肠炎中，发现病变肠段的紧密连接受到明显破坏，这种紧密连接完整性的改变被认为是肠屏障功能障碍的一个重要特征。因此，肠上皮紧密连接完整性的测定对于肠屏障功能的监测有重要意义。
目前，肠上皮紧密连接完整性的测定主要通过大分子物质通透性试验进行。紧密连接调控这些大分子物质(乳果糖、纤维双糖、EDTA和葡聚糖等)的细胞旁转运，大分子物质通透性的改变可以间接反映紧密连接的完整性。但这种方法也存在缺陷，包括通透性易受血流量、肾功能等因素的影响，个体差异大。从解剖结构上看，不同节段肠上皮紧密连接的完整性是不同的，正常小肠上皮细胞间紧密连接比结肠宽松，而大分子物质通透性试验不能反映不同肠段紧密连接的完整性。
体外培养细胞实验中，上皮电阻抗(TEER)是反映单层细胞紧密连接完整性的一个重要指标。根据生物电阻抗原理，紧密连接完整性的改变会引起上皮电阻抗的改变。TEER可以通过上皮细胞电位仪(EVOM)进行测定。EVOM产生低频电流作用到单层细胞，利用欧姆定律直接测出电阻值。目前，关于利用细胞电位仪(EVOM)测定肠上皮紧密连接完整性的研究，未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、准确、灵敏、有效的测定肠上皮紧密连接完整性的方法。本发明另一个目的是提供该方法在肠屏障功能障碍动物实验中的应用。
本发明技术方案是根据低频率(＜50Hz)下测定的肠上皮电阻抗反映肠上皮细胞间紧密连接完整性的原理。生物组织中，细胞外液的电子感应度比细胞内液大地多，低频率电流无法透过细胞膜进入细胞内液，因此低频率下测定的电阻抗是上皮细胞之间的电阻抗。紧密连接是细胞之间的重要结构，紧密连接的完整性决定了细胞之间电阻抗值的高低。本发明技术利用该电生理特征进行肠上皮电阻抗的测定，从而可以反映肠上皮紧密连接的完整性。
肠上皮细胞紧密连接是肠上皮屏障的重要组成部分，大量研究证明肠上皮屏障功能的破坏总是伴随着紧密连接完整性的改变。因此，肠上皮电阻抗的降低可以反映肠屏障功能的破坏。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种测定肠上皮紧密连接完整性的方法，该方法是通过体外测定动物肠段的肠上皮电阻抗，根据肠上皮电阻抗值的降低反映肠段的肠上皮紧密连接的破坏。
所述的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其中肠上皮电阻抗的测定方法是将细胞培养实验中所用的细胞小室去除聚乙烯膜，改为三脚中空的测试杯，然后将待测定部位的肠组织体外固定在测试杯上用于电阻抗测定。
所述的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其中肠上皮电阻抗的测定方法中肠标本采用3-0丝线沿杯口套扎固定。
所述的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其中肠上皮组织电阻抗的测定方法中采用EVOM单值电流探头和STX2电极测定肠上皮电阻抗。
上述的肠上皮紧密连接完整性的测定方法在肠屏障功能障碍动物实验中的应用。
以下结合图2对本发明作详细的描述1、肠标本的获取和固定。首先将细胞培养实验中的细胞小室的聚乙烯膜去除，改为三脚中空的测试杯。将测试肠段(约1cm长)在充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液(Krebs-Ringer bicarbonate buffer)中沿系膜缘剪开，小心浸洗去除肠内容物，暴露肠粘膜面，保持组织平展，粘膜面向外固定在测试杯杯口上，然后将测试杯倒置于培养池中。肠组织将培养池分为上室和下室，分别加入200μl和1ml的37℃充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液。
本发明所用的测试杯杯口直径为6.5mm，面积为0.33cm2。肠标本固定采用3-0丝线沿杯口套扎固定。培养池采用Transwell24孔培养板。
2、EVOM测定肠组织电阻抗。采用EVOM单值电流探头和STX2电极。测试前，将STX2电极用70％酒精浸泡，再用消毒的PBS冲洗。将STX2长电极插入下室，短电极插入上室，肠组织位于两个电极之间，保持位置恒定。测定三次取平均值。测得的电阻抗计算公式TEER＝(Rtotal-Rblank)×A(Ω·cm2)公式中Rtotal为实测电阻值，Rblank为未固定肠组织的空白的电阻值，A为肠上皮面积。
3、该测定方法在肠屏障功能障碍实验中的应用。通过建立肠缺血缺氧、缺血再灌注损伤、炎性肠病、肠道细菌易位等动物模型，测定肠屏障功能损伤时肠上皮电阻抗的变化，结合电镜观察紧密连接结构，从而反映紧密连接完整性的改变。
本发明的有益效果本发明将EVOM用于肠上皮电阻抗的测量。这是简单方便的，非破坏性的，可靠的检测方法。本发明采用EVOM单值电流探头和STX2电极，产生低频交流电流作用到肠上皮组织，对组织不会造成损伤，电阻抗值在紧密连接受损时变化灵敏准确，可以真实反映不同部位肠段紧密连接的完整性。本发明从动物的少量肠组织标本中能够有效检测出数据，仅需几分钟，所用样本量小，实验操作简单方便，不受血流量和机体代谢的影响。
紧密连接完整性的重要性在肠缺血缺氧、缺血再灌注、炎性肠病、创伤应激、肠道细菌异位等肠屏障功能障碍的研究中得到证实，已成为当今肠屏障功能研究中的热点。本发明方法通过测定肠上皮电阻抗，为紧密连接完整性的检测提供了新的方法和指标，可用于肠屏障功能障碍的动物实验研究。
图1是肠上皮紧密连接示意图。
图2是EVOM测定肠上皮电阻抗示意图。
图3是肠组织标本固定的实物图。
图4是EVOM测定肠组织电阻抗的实物图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
以下实施例所用的实验材料为250-300g雄性SD大鼠，KRB缓冲液(NaCl 119mM，KCl 4.74mM，CaCl22.54mM，MgCl21.19mM，Na2HPO41.19mM，NaHCO325mM，HEPES 10mM，Glucose 5.5mM，PH7.4)，单层细胞小室(Transwell Insert，Corning，USA)，24孔细胞培养板(Transwell，Corning，NY，USA)，EVOM细胞电位仪(WPI，Aston，England)，STX2电极(WPI，Florida，USA)，动物手术器械，3-0丝线，氯胺酮。
实施例1测定正常大鼠不同部位肠上皮电阻抗值1、将SD大鼠肌注盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉，剑突下腹部中线切口开腹，迅速取近端空肠(距屈氏韧带2cm)、末端回肠(距盲肠2cm处)、横结肠各1cm，保存在4℃充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液中，20分钟内送至实验室。
2、将单层细胞小室的聚乙烯膜去除，改造为三脚中空的测试杯。在充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液中将测试肠段沿系膜缘剪开，小心浸洗去除肠内容物，暴露肠粘膜面，粘膜面向外平展在测试杯杯口上，3-0丝线沿杯口套扎固定，剪去多余肠组织，然后将测试杯置于37℃充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液中保持组织活性。(见图3)3、将固定好的测试杯杯口向下倒置于培养池中，测试杯杯脚悬挂在培养池外壁，肠组织将培养池分为上室和下室，分别加入200μl和1ml的37℃充满95％O2/5％CO2的KRB缓冲液。
4、测试前，将STX2电极用70％酒精浸泡，再用消毒的PBS冲洗。将EVOM细胞电位仪打开，测试档调在R，量程调至2000Ω，调零后将STX2长电极插入下室，短电极插入上室，肠组织位于两个电极之间，保持位置恒定。测定三次取平均值，得到肠上皮电阻抗。(见图4)测得的电阻抗计算公式TEER＝(Rtotal-Rblank)×A(Ω.cm2)公式中Rtotal为实测电阻值，Rblank为未固定肠组织的空白的电阻值，A为肠上皮面积。
本实验中，空白对照电阻抗为100Ω，肠上皮面积为0.33cm2。
5、根据结果(见表1)可以得出正常大鼠不同节段肠上皮的电阻抗，符合文献报道的正常小肠上皮细胞间紧密连接比结肠紧密连接宽松的解剖特点。
表1 正常SD大鼠不同部位肠上皮电阻抗测定结果
实施例2测定肠缺血再灌注损伤后大鼠肠上皮电阻抗的变化1、选用250-300g雄性SD大鼠，随机分为四组(每组10只)对照组，缺血再灌注损伤1小时、2小时、4小时组。
2、将试验组大鼠肌注盐酸氯胺酮(100mg/kg)麻醉，剑突下腹部中线切口开腹，分离肠系膜上动脉，用无创微血管夹将其夹闭使肠缺血。缺血60分钟再次麻醉(肌注50mg/kg盐酸氯胺酮)松开微血管夹，分别于松开血管夹后1小时，2小时，4小时取测试肠段。对照组行假手术。
3、从大鼠体内迅速取近端空肠(距屈氏韧带2cm)、末端回肠(距盲肠2cm处)、横结肠各1cm。按实施例1所述方法测定各组大鼠不同部位肠上皮电阻抗值。对所测得的电阻抗值采用单因素ANOVA统计分析，P＜0.05认为有显著差异，P＜0.01认为有极显著差异。
4、另分别于近端空肠、末端回肠、横结肠各取1cm肠段戊二醛固定，透射电镜观察紧密连接结构改变。
5、根据结果(见表2)可以发现大鼠肠上皮电阻抗值随缺血时间延长而降低，回、结肠电阻抗值变化较空肠更为明显。肠上皮电阻抗的改变和电镜下紧密连接结构的破坏程度相符。该实验证实了肠上皮电阻抗随着紧密连接完整性的破坏而降低，且不同部位肠上皮紧密连接破坏程度不同。
表2 缺血再灌注损伤大鼠肠上皮电阻抗测定结果
*P＜0.05，**P＜0.0权利要求
1.一种测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其特征在于通过体外测定动物肠段的肠上皮电阻抗，根据肠上皮电阻抗值的降低反映肠段的肠上皮紧密连接的破坏。
2.根据权利要求1所述的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其特征在于肠上皮电阻抗的测定方法是将细胞培养实验中所用的细胞小室去除聚乙烯膜，改为三脚中空的测试杯，然后将待测定部位的肠组织体外固定在测试杯上用于电阻抗测定。
3.根据权利要求2所述的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其特征在于肠上皮电阻抗的测定方法中肠标本采用3-0丝线沿杯口套扎固定。
4.根据权利要求1所述的测定肠上皮紧密连接完整性的方法，其特征在于肠上皮组织电阻抗的测定方法中采用EVOM单值电流探头和STX2电极测定肠上皮电阻抗。
5.权利要求1所述的肠上皮紧密连接完整性的测定方法在肠屏障功能障碍动物实验中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种测定肠上皮紧密连接完整性的方法及其应用。该方法通过体外测定动物肠段的肠上皮电阻抗，根据肠上皮电阻抗值的降低反映肠段的肠上皮紧密连接的破坏。该方法操作简单方便，所用样本量小，不受血流量和机体代谢的影响，可有效反映不同节段肠上皮紧密连接的完整性。该方法可用于肠屏障功能障碍的动物实验研究。
文档编号A61D99/00GK1883385SQ20061004079
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者李宁, 王萌, 李秋荣, 黎介寿 申请人:中国人民解放军南京军区南京总医院