专利名称：：增进作物、植物或种子生长和土壤更新的方法
技术领域：
：本发明涉及Y-聚谷氨酸('卞PGA"，H形式)、其盐(Y-聚谷氨酸盐)、？聚谷氨酸盐水凝胶和/或包含Y-PGA、其盐和/或？聚谷氨酸盐水凝胶的发酵液于增湿土壤、保持水份、溶解钙和镁、剌激作物、植物和种子生长的组合及协同作用以及抗植物病原和/或抗病毒功能。
背景技术：
：在实际植物疾病控制中，合成性抗真菌化合物是主要使用的杀真菌剂。合成杀真菌剂的广谱应用造成降低对天然生物的控制，并对野生生物、农场工人和消费者造成危害。对于许多植物疾病、尤其是与土壤相关的疾病来说，可能涉及病原体复合体，例如涉及腐霉菌(Pythiumsp.)、立枯丝核菌(尺/iz'zo"om'aso/am')和茄病镰刀菌(Fiw。n'wmTO/an!')的大豆根腐病。在目前以及在不远的将来，常规杀真菌剂的选择性使用似乎是实际植物疾病控制中的主要方式。总体来说，可以施用量或施用频率来选择性地使用杀真菌剂。同时使用化学和生物程序以达成可靠的选择性控制的可能性令人感兴趣。作物疾病的范围为从很少发生的疾病到到达流行程度的疾病。谷物白粉病是时常发生且严重的疾病。黑斑病(BlackSigatoka)是与香蕉相关的时常发生且具有破坏性的疾病。温带谷物和全球性高价值作物的尖眼斑病(立枯丝核菌)的发生率表示针对控制所述疾病设计的药剂在商业上是可以成功的。一般相信壳针孢(Septoria)病和霉菌病是与目前由杀真菌剂所控制的大部分重要谷物病原体相关的。存在若干无法有效以杀真菌剂控制的病原体，但其与严重作物损失相关。实例为感染豆类的核盘菌(Sclerotinia)、感染谷物的全蚀病菌(Gaeumannomyces)和感染玉米的镰刀菌(Fusarium)。其他主要病原体包括感染水稻的稻瘟病菌(尸yn'o^m'"gn'wa)、感染温带谷物的小麦白粉病菌(Eo^'phegramim's)和叶枯病菌(Sepforiam'fici)、感染果树树冠的黑星病菌(Vfenfwra!'加egwa/!'s)禾口感染豆类的核盘菌(5Wera"'"i'asc/e柳'or,)。最广泛研究的天然抗真菌剂是植物抗毒素。然而，几丁质酶、葡聚糖、几丁质结合凝集素、玉米素(zeamatin)、硫堇和核糖体失活蛋白质现在被视为真菌入侵的重要调节剂。活体营养性病原体入侵活细胞，而死体营养生物拓殖被入侵的组织。已经发现D-氨基酸是微生物细胞辨(参看SchleiferK.H.和KandlerO.，1972,Peptidoglycantypesofbacterialcellwallsandtheirtaxonomicimplications,jBacfer!'0/0.Zev.36:407-477)、脂肽(参看AssdineauJ.,1966,Thebacteriallipids,Harmann,Paris)、抗生素(参看BycroftB.W.,1969,Structuralrelationshipsinmicrobialpeptides,Wan<re(London).224:595-597)、荚膜和毒素(参看HatfieldG.M.,1975，Toxinsofhigherfungi,LZoyd!:,38:36-55)的组份。己经假定抗生素中的D-氨基酸是在将L-氨基酸并入至立体化学不稳定的中间物(例如环状二肽)之后而从L-氨基酸形成。在形成抗生素期间内，来源于相应L-氨基酸的脱氢氨基酸的组合形式可在活体内立体特异性地转换成D-异构体。氨基酸的外消旋作用可以经由类似机制进行。大部分由杆菌产生的肽抗生素具有抗革兰氏阳性细菌活性。然而，一些化合物几乎专有地对革兰氏阴性细菌具有活性，而例如芽孢菌霉素(bacillomycin)和分枝杆菌素(mycobacillin)的一些其他化合物是抗霉菌和酵母的有效药剂。分枝杆菌素是包含7种不同氨基酸的13个残基的环状肽抗生素(参看SenguptaS.，BanerjeeA.B.，和BoseS.K.,1971，"y-GlutamylandD-orL-peptidelinkagesinmycobacillin,acyclicpeptideantibiotic,￡/ocAem.X，121:839-846)。其分子结构中存在6个D-氨基酸，包括2个D-谷胺酸和4个D-天冬氨酸，和7个其他L-氨基酸。非系统性杀真菌剂通常为多位点抑制剂，其通过破坏若干生物化学过程而引发反应。这是通过其与许多酶所共有的化学基团(例如硫醇部分)结合的能力来达成。抑制固醇生物合成的物质为极为有效的作物疾病控制剂。其为系统性的且提供对抗、治疗和根除性的控制。固醇为维持细胞膜完整性的重要功能组份，且存在于所有真核细胞中。在真菌中，固醇生物合成在大部分真菌中是从乙酰辅酶A重新合成产生主要固醇。通往麦角固醇的合成路径是大部分真菌的特征(例如子囊菌(Ascomycetes)、黑僵菌(Deuteromysetes)和担子菌(Basidomycetes))。在谷物白粉病中，主要的固醇是24-甲基胆固醇。麦角固醇在维持膜功能扮演重要角色，并且降低麦角固醇的可利用性会导致膜破坏及电解液渗漏。表面活性素(参看ArimaK.，KakinumsA.和Tamura,G.，1968，Surfactin，aCrystallinePeptidelipidSurfactantProducedbyjBac"Zwjwto'Z!、Isolation,CharacterizationandItsInhibitionofFibrinClotFormation,5!'op/i;ys.Wes.Ccwwim.31:488-494)是由枯草杆菌(fiad/Zww&!7!'s)和枯草杆菌纳豆菌(5flc!7Zt^^&!7"nao)所产生的环状縮酚肽，其含有P-羟基脂肪酸和7个氨基酸，包括2个D-亮氨酸。其具有有效的抗真菌活性、抗肿瘤活性、对抗艾利希腹水(Ehriichascite)癌细胞和抑制纤维蛋白凝块形成。两性脂肽表面活性素与脂膜双层外层的物理化学相互作用引起严重的离子通道渗透性改变，而导致膜系统的破坏。表面活性素也抑制质子-ATP酶的病毒酶活性，其为一些病毒进入细胞中所i^、需(参看CarrascoL.，1994，Entryofanimalvirusesandmacromoleculesintocells,F￡fi>SLe".350:151-154)，可由表面活性素类似物普米拉丁(pumilacidin)对于胃H+、K+-ATP酶的抑制所证明(参看NaruseN.，TenmyoO.，和KobaruS.，1990,Pumilacidin,acomplexofnewantiviralantibiotics:Production,isolation,chemicalproperties,structureandbiologicalactivity,Japan,43:267-280)。已经证明了表面活性素对广谱不同病毒的抗病毒活性(参看VollenbroichD.,PaulG.，OzelM.和VaterJ.，1997，Antimycoplasmapropertiesandapplicationoncellculturesofsurfactin，alipopeptideantibioticfromfiac!'肠^幽，AppZ.￡"vz>wz.M/craWoZ.63:44-49)，包括塞米斯基森林病毒(Semiskiforestvirus)、单纯疱疹病毒、猪疱疹病毒(suidherpesvirus)、水泡性口炎病毒、猿免疫缺陷病毒、猫卡力西病毒(felinecalicivirus)、鼠科脑心肌炎病毒、包膜病毒、反转录病毒等。伊枯草菌素(iturin)(参看PeypouxF"Gui,dM"MichelG"DelcambeL.,DasB.C.禾口LedererE.，1978，StructureofiturinA，apeptidolipidantibioticfrom5ac"Ziws由"!i，所ocAeAn/^7，17:3992-3996)是由枯草杆菌菌株产生的抗真菌脂肽，其含有包括3个D-a氨基酸和4个L-a氨基酸的环状七肽和具有14到16个碳原子脂族侧链的亲脂性P-氨基酸。伊枯草菌素对各种植物病原真菌、酵母和细菌在活体外及活体内都具有广范围的抑制功效(参看NamaiT.,HatakedaK.禾卩AsanoT.，1985,Identificationofabacteriumwhichproducessubstanceshavingantifungalactivityagainstmanyimportantphytopathogenicfungi,7b/zoib</4gr/c.36:1.-7和GueldnerR.C.，ReileyC.C.,PuseyP.L.，CostelloC.E.，ArrendaleR.F.，CoxR.H.，HimmelsbachD.S.，CrumleyF.G和CutlerH.G.，1987，IsolationandidentificationofiturinasantifungalpeptidesinbiologicalcontrolofpeachbrownrotwithBacillussubtilis,丄Agn'c.FoodCZem.,36:366-370)。极性肽部分赋予伊枯草菌素两性特性，并且作用模式涉及与目标膜的相互作用。所述伊枯草菌素与胆固醇之间存在强烈相互作用引起等分子复合体的形成。伊枯草菌素也与麦角固醇反应。所述伊枯草菌素与植物病原细胞膜的固醇之间的相互作用有效地改变膜渗透性和脂质组成，因此引起K+离子释放通道的放大和各种细胞化合物的损失，这就导致细胞微丝的分解和抑制新细胞孢子的出芽。根据美国食品及药物管理局(U.S.FDA)的分类，枯草杆菌种被分类于可用于产生动物饲料等级的消化酶(包括蛋白酶、碳水化合物和脂酶)的微生物GRAS列表下。全世界所采用的大部分杀真菌剂仅用于控制由12种真菌所引起的疾病。尽管大部分杀真菌剂对于哺乳动物相对无毒，但是例如含水银化合物的一些杀真菌剂极具毒性，且当其使用不当时会导致人类灾害。一些杀真菌剂的应用己经导致由其他未经控制病原体所引起的疾病的增加。举例来说，用于控制花生叶斑病的一些杀真菌剂增加花生的茎腐病(白绢菌(Sc/eraf!'"AnroZ/w'!'))的发生，并且苯菌灵(benomyl)的应用导致黑麦由立枯丝核菌所引起的尖眼斑病、草莓果实腐烂病(根霉菌(Rhizopus))和豇豆湿茎腐烂病(菜豆绵腐病菌(/^/u'"mapAanWe/"m幼'ww))的发病率增加。使用两种和三种不同特异性的杀真菌剂接近由广效毒剂所达成的作用。已知植物生长激素为真菌疾病的拮抗剂。由于植物生长素在细胞壁结构上作用，其对于抗枯萎病尤其具有活性。其他生长调节剂(例如植物生长素转运抑制剂和赤霉素生物合成抑制剂)也降低番茄和棉花中镰刀菌和轮枝菌(Verticillium)枯萎病的严重性。生物合成抑制剂矮壮素(chlormequatchloride)抗基腐病菌(Pherpotrichoides)的拮抗剂活性可能是由于施用这一生长阻滞剂所引起的茎强度增加，而不是由于对真菌活性的直接作用。细胞分裂素激动素具有抗真菌病原体(包括链格菌(A"eman'a印p.)和白粉菌目(Erysiphales)的成员)的拮抗剂活性功效，其可能是通过降低病原体所诱导的蛋白质和核酸降解的速率来达成。
发明内容我们的研究显示除了其对人体无毒、生物可降解性和其降解产生对环境友善的终产物(谷氨酸)等优点外，Y-PGA、其盐(即，聚谷氨酸盐)(Na+、K+、NH4+、Mg^和Ca++形式)、Y-聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+、K+、NH4+、Mg^和(:3++形式的？聚谷氨酸盐制备)和/或包含Y-PGA、其盐和/或Y-聚谷氨酸盐水凝胶的发酵液具有多种功能性，包括高度吸水性及保水性、长期持续有效率的良好控制释放能力、螯合及包裹有毒重金属离子以解毒、与钙和镁形成协同离子复合体以获得更佳的营养生物可用性、以及良好的抗植物病原活性。由于所有所述组合及协同功能性，Y-PGA、其盐和/或7-聚谷氨酸盐水凝胶显然为用于更新土壤品质的极好成分，可以刺激农作物及其他植物和种子生长以及保护其免受植物病原影响。整合植物营养、土壤pH、土壤中的水活性和杀真菌剂复合体功效的方法显然为预防由土壤传播的植物病原体所引起的症状和植物疾病的正确方向和较佳选择。附困说明图1展示(A)Y-PGA(H形式)、(B)K+形式的，聚谷氨酸盐、Na+形式的y-聚谷氨酸盐和NH4+形式的Y-聚谷氨酸盐和(C)<:3++形式的"7-聚谷氨酸盐和1^^++形式的1聚谷氨酸盐的化学结构。M(I)=K+、Na+或NH/,]\4(11)=03++或Mg++。图2展示在中性pH的D2C)中和3(TC的温度下，(A)Na+形式的"y-聚谷氨酸盐、(B)K+形式的Y-聚谷氨酸盐和(C)NH4+形式的Y-聚谷氨酸盐的400MHz巾-NMR光谱。以ppm单位测量相对于内部参考的化学位移。X指示杂质峰。图3展示在中性pH的D20中和3(TC的温度下，(A)K+形式的？聚谷氨酸盐、(B)Na+形式的，聚谷氨酸盐、(C)03++形式的1聚谷氨酸盐和(D)Mg++形式的T■聚谷氨酸盐的UC-NMR光谱。以ppm单位测量相对于内部参考的化学位移。图4展示KBr颗粒中(A)Na+形式的Y-聚谷氨酸盐和(B)NH4+形式的y-聚谷氨酸盐的红外线(FT-IR)吸收光谱，图5展示在25。C下，(A)用0.2NNaOH滴定10%y-PGA、(B)用Ca(OH)2滴定2%，PGA和(C)用5NNH4OH滴定4%y-PGA的pH-滴定曲线。具体实施例方式本发明涉及增进作物、植物或种子生长、同时加固植物茎和干、增加作物产量并且改进对植物病原疾病的抑制的方法，所述方法包含对作物、植物或种子或者用于生长作物、植物或种子的田地施用含有Y-PGA和/或其盐(Na+、K+、NH4+、Ca—或1\48++形式)、Y-聚谷氨酸盐水凝胶、包含Y-PGA、其盐和/或Y-聚谷氨酸盐水凝胶的发酵液或其混合物的物质。PGA、Y-聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、1^++和03++形式)和？聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+、K+、NH4+、Mg+m(^++形式的？聚谷氨酸盐制备)具有格外强的吸水性及结合能力，并且可以有效地保持且缓慢释放所保持的水以达到长期持久作用，这对于农业田地且尤其是对于干燥土地或温暖/炎热天气条件下的区域来说是重要的。高度保水性可以有效地改进土壤中用于微生物增殖的水活性，并且也有助于生长所需的营养向植物种子或根转运。此外，Y-PGA和y-聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、Mg+，BCa^形式)可以经由浸没发酵过程从L-谷氨酸产生(参看KubotaH.等人，1993，Productionofpolyglutamicacidby5。c〃/"jF-2-0/,5!',!'.5/o"c/z.i5/。c/zew，57(7),1212-1213和OgataY.等人，1997，Efficientproductionofy-polyglutamicacidby5ac!7/"sswto'Z!'sinjarfermentation,Biosci.Biotech.Biochem.,61(10)，1684-1687)。？PGA和y-聚谷氨酸盐具有极好的吸水特性，并且探究其聚阴离子特性以应用于在水性系统中溶解并稳定Ca++、Mg++、Mn++、Zn++、Se+"+和0+++金属离子。y-PGA和y-聚谷氨酸盐(Na+、K+和NH4+形式)尤其易与钙盐或镁盐在中性条件下反应(参看Ho，G.H.，2005,y-PolyglutamicacidproducedbySac!7/iswto'/Zsvar.Structuralcharacteristicsanditsindustrialapplication,5!o!W,，第16巻，第3期，172-182)以形成水溶性且稳定的y-聚谷氨酸钙或？聚谷氨酸镁。Y-聚谷氨酸钙与Y-聚谷氨酸镁的离子性复合体提供立即可用的Ca++离子和1^8++离子以供种子生长的营养需要，并且更为有效地转运至生长植物的根，从而引起植物种子、植物根、作物及其他植物的生长全面性的加强。在Y-PGA上的金属吸收涉及两个可能的机制(1)金属离子与羧基位点直接相互作用，和(2)通过由COO—基团所产生的静电势场保持移动形式的重金属相对离子。除了与羧酸根互相作用之外，酰胺键也可以提供弱的相互作用位点。除了？PGA的构象结构和离子化作用外，了解存在于水溶液中的经水解金属物种的类型也是重要的。各种不同物种的形成可以导致金属离子的不同吸收能力。图1展示Y-PGA和Y-聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、(V+和Mg—形式)的分子结构，图2、3和4分别展示典型^-NMR、'C-NMR和FT-IR光谱。表1总结光谱数据和分析数据。图5展示pH-滴定曲线。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>Y-PGA是具有1,000到20,000范围内的聚合度的谷氨酸聚合物，并且仅在谷氨酸部分之间以？肽键形成。Y-PGA含有末端胺和多个oc-羧酸基团。聚合物通常以若干构象状态存在a-螺旋(a-helix)、无规巻曲(randomcoil)、P-折叠(e-sheet)、螺旋-巻曲转变区和包裹聚结(envelopedaggregation),这取决于环境条件，例如pH、离子强度及其他阳离子物质。螺旋形式的存在量通常由为圆二色分光光谱仪(circulardichroism,"CD")于222nm下的光谱量值函数来测量。游离形式的Y-PGA于约pH3-5的均匀水溶液中发生螺旋-巻曲转变，并且于更高的pH5-7变换为键联形式。当用某些二价和-些更高价金属离子螯合时，经由y-PGA的急剧构象改变，发生从无规巻曲转变成包裹聚结。与在大部分蛋白质中所发现的每3.6单位氨基酸残基中仅有1个氢结合相比，Y-PGA在每三个连续谷氨酸部分中可以形成四种类型的氢结合(参看RydonH.N.,1964，Polypeptides,PartX,Theopticalrotarydispersionofpolyy-D-glutamicacid,/CTiem.Soc.,1928-1933)，并且因此具有格外强的亲水性。其构象状态也起着作为许多其他生物功能(包括抗植物病原活性)的载剂和刺激物的重要作用。结合所有上述特性，Y-PGA及其盐和/或Y-聚谷氨酸盐水凝胶可以用于土壤调节或土壤更新以有助于农作物的生长，并且同时在植物病原体控制中作为农业杀生物剂。在本发明的一个实施例中，，聚谷氨酸盐水凝胶是从Na+形式的？聚谷氨酸盐、K+形式的？聚谷氨酸盐、NH/形式的？聚谷氨酸盐、1^^++形式的丫-聚谷氨酸盐、Ca"形式的Y-聚谷氨酸盐、或其混合物与二甘油聚縮水甘油基醚、聚甘油聚縮水甘油基醚、山梨醇聚缩水甘油基醚、聚氧化乙烯山梨醇聚縮水甘油基醚、聚山梨醇聚缩水甘油基醚或聚乙二醇二縮水甘油基醚或其混合物交联制各而来。在本发明的另一个实施例中，聚谷氨酸盐水凝胶是从Na+形式的？聚谷氨酸盐、K+形式的，聚谷氨酸盐、NH/形式的y-聚谷氨酸盐、1^§++形式的，聚谷氨酸盐、<:3++形式的1聚谷氨酸盐或其混合物通过用丫射线或电子束照射而得以交联制备而来。根据本发明，含有？pga和/或其盐、y-聚谷氨酸盐水凝胶、包含y-pga、其盐和/或t"聚谷氨酸盐水凝胶或其混合物的物质可以用作杀生物剂、用于土壤调节和更新的增湿剂、用于在植物叶片上喷雾的生长刺激物、用于移除存在于作物、植物或种子所生长的田地中的重金属的螯合剂和/或用于形成可溶性钙和/或镁的络合剂。当将上文所述的本发明的物质应用于种子时，其为包被于种子上。此外，上文所述的物质可以溶解在极性溶剂中，例如乙醇或甲醇或水，并且将pH调节成从5.0到8.0的范围。极性溶剂或水中的Y-PGA和/或其盐的浓度为从0.001重量％到15重量％的范围。此外，上文所述的物质具有为90%:10%到10%:90%、优选为65%:35%到35%:65%的D-形谷氨酸和/或谷氨酸盐与L-形谷氨酸和/或谷氨酸盐的比率。本发明的实验方法工业用量的Y-PGA及其盐，聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、Ca"和Mg"形式)可以通过使用L-谷氨酸和葡萄糖作为主要原料，以枯草杆菌、枯草杆菌纳豆菌变种(Sac!'/Z"ssw6"7!\yvar.natto)(参看NaruseN.,TenmyoO.禾l.lKobaruS.，1990,Pumilacidin,acomplexofnewantiviralantibiotics:Production,isolation,chemicalproperties,structureandbiologicalactivity,/.Ara"Wo[/a/'an,43:267-280)或地衣芽孢杆菌(Bac!'Z/wsZ!'cAemybrm!i)(参看VollenbroichD.，PaulG.,OzelM.和VaterJ.,1997,Antimycoplasmapropertiesandapplicationoncellculturesofsurfactin，alipopeptideantibioticfrom5ac"/"ssw6f!7/s,A///.五/zv!7w！.M!'craWoZ.，63:44-49)在浸没发酵过程中生产。微生物培养基含有适当量的碳源、氮源、无机矿物质及其他营养物。通常L-谷氨酸的使用量为3到129fc范围内的浓度。5-12%浓度的葡萄糖和0.2到2%浓度的柠檬酸可以作为部分碳源。使用蛋白胨和硫酸铵(或者尿素或NH3)作为氮源。使用酵母提取物和生物素作为营养源。使用Mn++、Mg++和NaCl作为矿物质源。在适当通风和搅拌下，将培养物维持在30到4(TC的温度下，并通过使用尿素溶液、NH3或氢氧化钠溶液将pH维持在6-7.5。培养时间通常持续48至84小时。Y-PGA及其盐Y-聚谷氨酸盐会在细胞外积累。通常通过一系列程序从发酵液中提取？PGA及其盐、Y-聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、0&++和！4§++形式)，所述程序包括超速离心或加压过滤以分离细胞，随后加入3到4倍乙醇以沉淀出Y-PGA及其盐。将沉淀物再溶解于水中，并使用另一部分乙醇来沉淀出Y-PGA及其盐。重复溶解-沉淀步骤数次以回收纯的Y-PGA及其盐。通常将Y-PGA和其盐、Y-聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、Ca++和Mg++形式)溶解于适当溶剂(例如水、乙醇或甲醇)中，并将pH调节成从5.0至7.5的范围。在持续搅拌下，将经适当选择的多功能化学交联剂(例如聚甘油聚缩水甘油基醚、以山梨醇为基础的聚縮水甘油基醚、聚乙二醇二縮水甘油基醚或三羟甲基丙烷三丙烯酸酯)加入溶液中，剂量率在"Y-PGA及其盐重量的0.01到20%范围内，这取决于交联剂的类型和所需水凝胶的品质。取决于所用设备和条件，胶凝反应通常是在50到120'C的反应温度下在1到4小时内完成。随后冷冻干燥所形成的水凝胶以产生千燥的经交联的，pga及其盐、y-聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+、K+、NH4+、Ca+1卩1^^++形式的丫-聚谷氨酸盐制备)，其具有极好的吸水能力，为非水溶性的，且当完全在水中膨胀时形成无色、透明且生物可降解的水凝胶。可以通过在经特定选择的pH、温度、反应时间和y-PGA浓度的反应条件下由受控制的酸性水解来产生具有5,000到900,000范围内分子量的Y-PGA及其盐，聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、03++和1^++形式)。可以用例如HC1、H2S04或其他有机酸的适当酸化剂将pH从2.5调节成6.5，水解温度可以控制在50到IOO'C范围内，反应时间为0.5到5小时，且具有lxloe和更高分子量的？PGA的浓度可视需要为任何适当的浓度。在反应完成之后，必须进一步以透析或膜过滤纯化和千燥以产生所需要的高纯度小分子量和中等分子量的？PGA及其盐Y-聚谷氨酸盐(Na+、K+、NH4+、Ca—和Mg"形式)。在较低pH、较高温度和较高y-PGA浓度下酸水解速率较快。可以通过将所选？PGA与所选金属离子(Na+、K+、NH4+、<:3++和Mg++)的碱性氢氧化物溶液或氧化物反应来产生y-聚谷氨酸盐，并且视需要将pH调节成所需的5.0到7.2。实验实例为了进一步详细解释本发明，下文呈现实验实例以展示可以用本发明来达成主题目的。然而，本发明的范畴并不受这些实验实例的限制。实验实例l制备含有0.5%酵母提取物、1.5%蛋白胨、0.3%尿素、0.2%K2HPO4、10%L-谷氨酸单钠、8呢葡萄糖且pH6.8的3()0L培养液，并加入600L发酵罐中，且随后按照标准程序蒸气灭菌。随后接种枯草杆菌，并用10呢NaOH溶液来控制pH。继续在37'C下发酵96小时。培养液中"y-PGA含量达到40g/1。取15克培养液的等分试样，并将其各自转移到三个具有盖子的50ml样品瓶中。随后取600jil量的以甘油为基础或以山梨醇为基础的聚縮水甘油基醚，并将其转移到装有培养液的样品瓶中，并盖上盖子。随后在中速旋转的振荡培养箱中使反应混合物在6(TC下反应24小时。随后从20ml样品瓶中取出经反应的混合物，并在4T:下于足量水中浸泡过夜。在水合和膨胀之后形成水凝胶。随后用80目金属筛过滤水凝胶，并排水至干燥。测量并记录无明显游离水的经膨胀水凝胶的重量。在相同烧杯中于4'C下，在足量水中再浸泡凝胶过夜。连续5天重复相同程序。测得的吸水率如表2所示。渊定Y-聚谷氨酸盐水凝胶的吸水率将经称重的干燥水凝胶样品(W,)在过量水中浸泡，并将其留在水中肿膨胀过夜以达成最高水合作用。用80目金属筛过滤水合水凝胶以除去游离水并排水至干燥。随后称重干燥水凝胶(W2)。吸水量(W)被定义为如下差值W-W2-W,。吸水率，x=w/wt=(w2-wo/w,表2:从发酵液由不同交联剂制得的T"聚谷氨酸盐水凝胶(Na+形式)的吸水率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验实例2根据实验实例1所示的方法，在另一组实验中使用5%PGA钠溶液的样品和二甘油聚縮水甘油基醚作为聚縮水甘油基交联化合物。进一步将pH调节到表3所示值。将反应混合物置于中速旋转的培养振荡器中。使反应继续在60'C下进行24小时。在反应完成之后，测定吸水率，其结果展示于表3中。表3:在不同pH值下产生的Y-聚谷氨酸盐水凝胶(Na+形式)的吸水率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验实例3根据实验实例1所示的方法，在另一组实验中使用5%Y-PGA钠溶液的样品和二甘油聚縮水甘油基醚。将溶液调节到pH6.0。将不同量的二甘油聚縮水甘油基醚用于交联反应。使反应继续在60'C下进行24小时。测定各种水合时间下样品的吸水率，其结果展示于表4中。表4:4.Cy聚谷氨酸盐水凝胶(Na+形式)的不同膨胀及水合率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验实例4根据实验实例1所示的方法，接种枯草杆菌，并以与实验实例1所示相同的方式培养。在不同生长时间下，从发酵罐取出培养液样品以用于本组实验。以二甘油聚縮水甘油基醚作为交联剂。将溶液调节到pH6.0。使反应继续在6(TC下进行24小时。按照实验实例1中所进行的相同方法。不同培养时间下的吸水率结果展示于表5中。表5:在不同发酵时间下从微生物培养物制造的Y-聚谷氨酸盐水凝胶(Na+形式)在4'C下的吸水率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实验实例5Y-聚谷氨酸钙在中性pH和接近中性pH下的高溶解性及良好pH缓冲能力(在pH4到7.0范围内)可以由下图(即图5B)中的pH-滴定曲线得知，其在土壤调节中有助于种子、根和植物的生长。研究Y-聚谷氨酸盐(Na+形式)和？聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+形式的Y-聚谷氨酸盐制备)抗农业病原生长或者抑制农业病原数的效率。接着进行标准马铃薯右旋糖琼脂方法(PDA培养皿)。测量病原体生长的抑制。在抑制研究中使用1%到5%范围内的卩聚谷氨酸盐(Na+形式)和"Y-聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+形式的？聚谷氨酸盐制备)浓度。制备病原体样品溶液将所选病原体样品接种于纯马铃薯右旋糖琼脂("PDA")培养皿的中心处，随后在使用之前在25'C下培育3到9天，这取决于病原的种类。用4mm灭菌穿孔器从完全生长的病原PDA培养皿取出4mm直径的样品，并将其放在新PDA培养皿的屮心，且储存在25'C培养箱中作为备用样品来源。制备10%>聚谷氨酸盐(Na+形式)溶液样品将3克，聚谷氨酸盐(Na+形式)样品转移到200ml锥形烧瓶中，并加入27ml无菌水以制得IO倍稀释的样品溶液。随后在3(TC下，用往复振荡器在200rpm下振荡样品烧瓶1小时。随后将烧瓶置于6(TC下水浴中进一步培养，并在使用之前在温度达到6(TC之后保持另外30分钟。制备50免y聚谷氨酸盐(Na+形式)发酵液样品将50ml新鲜培养液样品转移到无菌烧瓶中，并加入50ml无菌水，充分混合，并Ca(OH)2(g)实验实例6在10,000rprn下超速离心30分钟以分离细胞。随后使上清液通过0.4pm微量过滤膜以制得50%发酵液溶液。为了测试每个样品浓度的效力，制备100mlPDA培养基，其中含有100ppm新霉素(neomycin)硫酸盐以防止任何环境微生物相的污染。以仅含有100ppm新霉素硫酸盐的PDA培养基的培养皿用作对照。将100mlPDA培养基等量分配到5个9cm直径的培养皿中。固化之后，将4mm病原体样品片接种于每个PDA培养皿的中心处。随后将病原体样品面朝下在25'C下培育。使用5个多重复组。直到对照培养皿完全生长有病原体时，记录每个样品浓度的生长直径(mm)。营养琼脂("NA")对峙培养用于致病细菌抑制实验制备具有cfu/ml浓度的致病细菌，将0.1ml转移到每个NA培养皿中并均匀分布。随后，放置2片含有不同浓度测试样品的l.Ocm直径滤纸。使用测试的三重复组。将不含有测试样品的滤纸用作对照。在25。C下培育NA培养皿2-4天。记录生长区域的直径。接着，分别测试由Y-聚谷氨酸盐(Na+形式)、，聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+形式的"y-聚谷氨酸盐制备)和Y-聚谷氨酸盐(Na+形式)发酵液引起的农业病原体生长抑制。结果分别展示于表6、7、8、9和10中。表6:由？聚谷氨酸盐(Na+形式)引起的病原体生长抑制48小时菌丝体生长的抑制，培养Y-聚谷氮酸盐(为Na+形式)的浓所测试的病原体于PDA度，分子量-500k道尔顿<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表7:由Y-聚谷氨酸盐(Na+形式)发酵液引起的病原体生长抑制48小时菌丝体生长的抑制，培养Y-聚谷氨酸盐(Na+形式)发酵液所测试的病原体_于PDA_的浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表8:由？聚谷氨酸盐(Na+形式)发酵液(在营养琼脂上以滤纸片对峙培养)引起的病原体生长抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表9:由Y-聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+形式的，聚谷氨酸盐制备)引起的病原体生长抑制48小时菌丝体生长的抑制，培养Y-聚谷氨酸盐水凝胶(Na+形式)所测试的病原体于PDA的浓度表10:由？聚谷氨酸盐水凝胶(从Na+形式的？聚谷氨酸盐制备)引起的病原体生<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>长抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注意抑制区域*=(经处理滤纸片的抑制区域)-(空白滤纸片或PGA圆盘的区域，0.5cm)实验实例7在西蠊(Silo)农场的开放农田中黛安娜(Diana)西瓜的生长研究通过20cm宽x25cm高的沟渠将1000M2(lOMxlOOM)的开放农田划分成2个5Mxl00M相等地块。将地块指定为地块A和地块B。将地块A用于对照组，并将地块B用于实验组。在两块地块中以1m的间距种植2株1周龄的黛安娜西瓜植株。遵循标准计划和程序使用常规肥料和灌溉，采用台湾肥料公司(TaiwanFertilizer)有机肥料第39号(12-18-12)，并对地块A进行3次灌溉，且以0.75kg/500M2的剂量率对地块B应用富集含有3.5呢"PGA(Na+形式)的"PGA发酵液的灌溉液体，y-PGA发酵液稀释大约300倍。进行三次灌溉，期间间隔20天。地块A和地块B同时以自动控制水泵进行灌溉，并对地块A和地块B应用等量流体。在60天结束后收获黛安娜西瓜，并评估结果且展示于表11中。表ll.含有3.5免，PGA(Na+形式)的y-PGA发酵液对黛安娜西瓜生长的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注意随机取IO个黛安娜西瓜样品的平均尺寸实验实例8在嘉义(Chia-Yi)农场的开放农田中甜椒的生长研究在与实验实例7所示相似的开放田地研究中，使用1周龄甜椒植株以代替黛安娜西瓜。在种植之后60天收获甜椒。评估结果并展示于表12中。表12.含有3.5呢"y-PGA(Na+形式)的y-PGA发酵液对甜椒生长的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注意*---随机取IO个甜椒样品的平均尺寸。实验实例9在台中(Taichung)农业站的开放农田中黄贫(AstragalusMerabranaceus)的生长研究在与实验实例7所述相似的开放田地研究中，使用古代东方药用草本黄芪以代替黛安娜西瓜。使用1周龄黄芪幼株。首先用富集2%可溶性镁的有机肥料Champion280(12-8-10)对土壤进行施肥。在种植幼株之后，在距离植株20cm处的两侧挖开两个1.5英寸直径及10cm深度的小孔以用于在后期加入额外肥料和含有3.5%Y-PGA(Na+形式)的"PGA发酵液。这2个孔位于植株彼此相对的侧面。在种植幼株之后以24天间隔加入两次额外的肥料。对于每次加入肥料来说，每孔使用60g台湾肥料公司有机肥料第39号(12-18-12)以及500ml经300倍稀释的含有3.5%y-PGA(Na+形式)的y-PGA发酵液。在96天后，收获黄芪树，并收集根且加以洗涤。评估新鲜根和叶片，且结果展示于表13中。表13.含有3.5免y-PGA(Na+形式)的y-PGA发酵液对黄芪生长的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>权利要求1.一种增进作物、植物或种子生长、同时加固植物茎和干、增加作物产量并且改进对植物病原疾病的抑制的方法，所述方法包含对所述作物、植物或种子或者生长所述作物、植物或种子的田地施用含有γ-聚谷氨酸(“γ-PGA”，H形式)和/或其盐、γ-聚谷氨酸盐水凝胶、包含γ-PGA、其盐和/或γ-聚谷氨酸盐水凝胶的发酵液或其混合物的物质。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐是Na+形式的y-聚谷氨酸盐、K+形式的y-聚谷氨酸盐、NH/形式的，聚谷氨酸盐、1^^++形式的？聚谷氨酸盐或(^++形式的，聚谷氨酸盐。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Y-聚谷氨酸盐水凝胶是从Na+形式的T"聚谷氨酸盐、K+形式的Y-聚谷氨酸盐、NHU+形式的？聚谷氨酸盐、]\^++形式的？聚谷氨酸盐、(^++形式的？聚谷氨酸盐、或其混合物与二甘油聚縮水甘油基醚、聚甘油聚縮水甘油基醚、山梨醇聚缩水甘油基醚、聚氧化乙烯山梨醇聚縮水甘油基醚、聚山梨醇聚縮水甘油基醚或聚乙二醇二缩水甘油基醚或其混合物交联制备而来。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述？聚谷氨酸盐水凝胶是从Na+形式的Y-聚谷氨酸盐、K+形式的？聚谷氨酸盐、NH4+形式的？聚谷氨酸盐、^^++形式的1聚谷氨酸盐、(^++形式的，聚谷氨酸盐或其混合物通过Y射线或电子束照射而得以交联制备而来。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述物质是用作杀生物剂、用于土壤调节和更新的增湿剂、用于在植物叶片上喷雾或用于灌溉所述作物或植物田地的生长刺激物、用于移除存在于生长所述作物、植物或种子的田地中的重金属的螯合剂和/或用于形成可溶性f5和/或镁的络合剂。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述物质是包被于所述种子上。7.根据权利要求l所述的方法，其中所述物质是溶解于极性溶剂或水中，并将pH调节为5.0至IJ8.0范围内。8.根据权利要求7所述的方法，其中？PGA和/或其盐的浓度在0.001免到15%范围内。9.根据权利要求7所述的方法，其中？聚谷氨酸盐水凝胶的浓度在0.001%到10%范围内。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述物质具有为90%:10%到10%:90%的D-形谷氨酸和/或谷氨酸盐与L-形谷氨酸和/或谷氨酸盐的比率。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述比率是65%:35%到35%:65%。全文摘要本发明提供一种增进作物、植物或种子生长、同时加固植物茎和干、增加作物产量并且改进对植物病原疾病的抑制的方法，所述方法包含对所述作物、植物或种子或者生长所述作物、植物或种子的田地施用含有γ-聚谷氨酸(“γ-PGA”，H形式)和/或其盐、γ-聚谷氨酸盐水凝胶、包含γ-PGA、其盐和/或γ-聚谷氨酸盐水凝胶的发酵液或其混合物的物质。文档编号A01P1/00GK101099491SQ20061013865公开日2008年1月9日申请日期2006年11月8日优先权日2006年7月7日发明者何观辉,正杨,杨头雄申请人:东海生物科技股份有限公司