专利名称：一种水浮莲体外再生及繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养领域，特别是采用离体无菌培养通过愈伤组织诱导获得水浮莲的体外再生及繁殖的方法。
背景技术：
水浮莲(Pistia stratiotes L.)又称大漂，为天南星科植物，是一种漂浮性水生植物，与水葫芦(Eichhornia crassipes)为不同科植物。水浮莲被认为是世界上生长繁殖最快的水生植物，一株植物在90天内可以无性繁殖出25万株，其遗传稳定性好，对人体无毒。水浮莲主要生物量是叶片，经测定含有丰富的蛋白质、胡萝卜素、总黄酮和微量元素等，其中必需氨基酸占50％左右。不仅可作饲料和肥料等多种用途，而且具有极强的抗污染能力，能够净化水体中的N、P、K、酚、氰、有机物和重金属等污染物质，在污水净化和富营养化水体治理中具有十分重要的作用。
由于水浮莲的快速生长特性，利用植物组织培养系统可以研究水浮莲对水体中污染物质的吸收、聚集、降解和转运，阐明净化的生化机制和污染物对水浮莲自身生长代谢的影响以及细胞耐受性等问题，还可以通过植物组织培养系统将外源基因在水浮莲表达，例如，表达富集重金属和其它污染物的降解基因可以用于污染水体的生物修复，对于降低水体的富营养化和保护生态环境等方面都很有意义。此外，还可以将该植物作为生物反应器生产目标蛋白，特别是具有重要应用价值的药用蛋白。因此建立水浮莲的体外再生系统在基础研究和实际应用两方面都有重要意义。
但根据文献报道，目前只有1篇文献涉及水浮莲的体外繁殖。该方法是将水浮莲整株植物消毒后接种在液体培养基进行繁殖。由于该方法没有经过诱导愈伤组织阶段，因此只可以将培养的无菌苗用于生物化学方面的研究，而不能采用该方法进行遗传转化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水生植物水浮莲体外再生及繁殖的方法。该方法采用水浮莲的茎为材料诱导愈伤组织，再通过愈伤组织获得完整再生之植物。该方法可以用于再生之植物的遗传转化与改良，对该植物用于污染环境的生物修复以及生产有用化合物如药用蛋白必将产生深远的影响。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是利用水浮莲的茎诱导愈伤组织，然后通过愈伤组织再生出苗，以及采用液体培养基扩大繁殖。具体包括以下步骤a.外植体消毒选取水浮莲茎，对其洗净和消毒，获得无菌的外植体；b.愈伤组织诱导将茎切成薄片，然后置于含有植物激素2，4-D和BA的MS培养基上诱导形成愈伤组织；
c.植株再生将愈伤组织转移至含有植物激素BA的MS培养基再生为苗，苗进一步生根获得完整的再生植株；d.液体扩大繁殖将再生植株转移到SH液体培养基进行繁殖。
本发明与现有技术相比，具有以下显著效果1.诱导愈伤组织所需要的时间短，能够在2周左右的时间获得愈伤组织。
2.从愈伤组织获得再生完整植株所需要的时间短，且遗传稳定性好。
3.在液体培养条件下生长迅速，生物量大，能够在短期内无性繁殖获得大量的植株。
本发明提供的水浮莲体外再生及繁殖的方法可用于该植物的遗传转化及基因工程研究，通过表达外源基因应用于污染环境的生物修复，以及作为生物反应器生产有用物质如药用蛋白等，具有广阔的应用价值。
图1是从水浮莲茎诱导的愈伤组织。
图2是从图1的愈伤组织再生出丛生苗。
图3是从图2的丛生苗诱导生根形成的完整植株。
图4是再生苗在固体培养基繁殖的情况。
图5是再生苗在液体培养基繁殖的情况。
具体实施例方式
本发明建立了一种通过水浮莲的茎诱导愈伤组织，再通过愈伤组织再生出苗，以及采用液体培养基进行扩大繁殖的全新的水浮莲体外再生的方法，该方法将广泛用于基础及应用研究两方面。
本发明提供的是一种水浮莲体外再生的方法，其包括以下步骤a.外植体消毒选取水浮莲茎，对其洗净和消毒，获得无菌的外植体。消毒步骤是首先在5％的次氯酸钠的消毒液中处理10分钟，再转移到0.1％的升汞溶液中消毒3分钟，随后用无菌水清洗3次。
b.愈伤组织诱导将茎切成薄片，然后置于含有植物激素2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，简称2，4-D)和6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，简称BA)的Murashige和Skoog(简称MS)培养基上诱导形成愈伤组织。所述培养基具体是指含有0.5mg/L2，4-D和0.2mg/L BA的MS培养基。
c.植株再生将愈伤组织转移至含有植物激素BA的MS培养基再生为苗，苗进一步生根获得完整的再生植株。MS培养基是指含有1mg/LBA的MS培养基。
d.液体扩大繁殖将再生植株转移到Schenk和Hildebrandt(简称SH)液体培养基进行扩大繁殖。
下面结合具体实验对本发明提供的方法作进一步说明。
实验一.愈伤组织的诱导选取水浮莲叶片和茎用无菌水洗净，首先在5％的次氯酸钠的消毒液中处理10分钟，再转移到0.1％的升汞溶液中消毒3分钟，随后用无菌水清洗3次，将叶片切成1厘米左右的小块，将茎切成薄片，置于MS基本培养基附加植物激素0.5mg/L2，4-D，0.2mg/L BA诱导愈伤组织。其中叶片在该培养基上不能形成愈伤组织，而茎在培养2星期后形成淡黄色的愈伤组织(见图1)。在本实验过程中消毒方法起非常关键的作用。我们尝试了不同的消毒方法及消毒时间，发现消毒如果不彻底，外植体容易产生污染而得不到愈伤组织；如果消毒时间过长，外植体则会被杀死，也不能够诱导出愈伤组织。
实验二.植株再生实验一诱导的愈伤组织转到含有1mg/L BA的MS培养基，2-3星期后从愈伤组织形成绿色的丛生苗(见图2)。这些丛生苗再转移到相同的MS培养基后，可以形成完整的植株(见图3)。
实验三.固体及液体扩大繁殖将实验二获得的完整植株转移到不添加任何植物激素的MS固体培养基上，可以形成新的植株，但繁殖速度慢(见图4)。为了快速繁殖，将实验二获得的完整植株转移到SH液体培养基，其繁殖速度可以大大提高(见图5)。
实验四.液体扩大培养条件的优化为了进一步提高液体扩大繁殖的速度，从实验三液体培养选择无菌苗，置于不同的液体培养基培养，其中含有2倍大量元素的SH培养基(简称2×SH培养基)生长效果最好(见附表1)。进一步试验了不同pH条件下在2×SH液体培养基的生长情况，发现pH在6.0左右最适合水浮莲无菌苗的生长繁殖，无论是再生的新植株数量还是鲜重都比其它pH要高(见附表2)。
附表表1不同液体培养基再生效果比较
表2液体培养基不同pH对植物繁殖的效果
权利要求
1.一种水浮莲体外再生及繁殖的方法，其特征是一种利用水浮莲的茎诱导愈伤组织，然后通过愈伤组织再生出苗，以及采用液体培养基繁殖的方法，包括以下步骤a.外植体消毒选取水浮莲茎，对其洗净和消毒，获得无菌的外植体；b.愈伤组织诱导将茎切成薄片，然后置于含有植物激素2，4-D和BA的MS培养基上诱导形成愈伤组织；c.植株再生将愈伤组织转移至含有植物激素BA的MS培养基再生为苗，苗进一步生根获得完整的再生植株；d.液体扩大繁殖将再生植株转移到SH液体培养基进行繁殖。
2.根据权利要求1所述的水浮莲体外再生及繁殖的方法，其特征在于水浮莲外植体的消毒步骤是首先在5％的次氯酸钠的消毒液中处理10分钟，再转移到0.1％的升汞溶液中消毒3分钟，随后用无菌水清洗3次。
3.根据权利要求1所述的水浮莲体外再生及繁殖的方法，其特征在于所述的诱导愈伤组织的培养基是指含有0.5mg/L 2，4-D和0.2mg/L BA的MS培养基。
4.根据权利要求1所述的水浮莲体外再生及繁殖的方法，其特征在于所述的植株再生的培养基是指含有1mg/L BA的MS培养基。
全文摘要
本发明是一种水浮莲体外再生及繁殖的方法，具体是一种利用水浮莲的茎诱导愈伤组织，然后通过愈伤组织再生出苗，以及采用液体培养基扩大繁殖的方法。其步骤包括选取水浮莲茎对其洗净和消毒，获得无菌的外植体；将茎切成薄片，然后置于含有植物激素2，4－D和BA的MS培养基上诱导形成愈伤组织；将愈伤组织转移至含有植物激素BA的MS培养基再生为苗，苗进一步生根获得完整的再生植株；将再生植株转移到SH液体培养基进行扩大繁殖。本发明诱导愈伤组织和从愈伤组织获得再生完整植株所需要的时间短，且遗传稳定性好，能够在无菌条件下短期内无性繁殖获得大量的植株。
文档编号A01G31/00GK101023736SQ20071005170
公开日2007年8月29日 申请日期2007年3月20日 优先权日2007年3月20日
发明者陈士云, 张勇, 杨宝玉, 王瑶, 王友如 申请人:中国科学院武汉病毒研究所