专利名称：：一种农杆菌介导的无抗生素筛选转基因大麦植株的方法
技术领域：
：本发明属于植物转基因
技术领域：
，具体涉及利用农杆菌介导的无抗生素筛选培育大麦转基因植株的方法。本发明还涉及到PMI(磷酸甘露糖异构酶)/甘露糖筛选体系在人麦遗传转化中的应用，以及氯酚红(CPR)显色法在鉴别大麦转基因植物中的应用。
背景技术：
：大麦是世界上最古老的作物之一，是列于小麦、玉米和水稻之后第四位重要的禾谷类作物，主要用作饲料、食粮、啤酒工业原料以及近年引起关注的医药工业原料和保健食品。大麦也是遗传学研究广泛应用的模式植物之一。自1997年Tingay等首次以农杆菌介导法转化大麦成功以来，农杆菌介导的转化方法成为近年来大麦遗传转化中最常用的一种方法(TingayS，McElroyD，KallaR，FiegS，WangM，ThorntonS&BrettellR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.JPlant，1997，111369-1376；McCormacAC，WuH，BaoM，WangY，XuR，ElliottMC&ChenDF.Theuseofvisualmarkergenesascell-specificreportersofAgrobacterium-mediatedT-DNAdeliverytowheat(TriticumaestivumL.)andBarley(HordeumvulgareL.).Euphytica，1998，9917-25；MatthewsPR，WangMB，WaterhousePM，ThorntonS，FiegSJ，GublerF，JacobsenJV.Markergeneeliminationfromtransgenicbarley，usingco-transformationwithadjacent‘twinT-DNAs’onastandardAgrobacteriumtransformationvector.MolBreeding，2001，7195-202；MurrayF，BrettellR，MatthewsP，BishopD，JacobsenJ.ComparisonofAgrobacterium-mediatedtransformationoffourbarleycultivarsusingtheGFPandGUSreportergenes.PlantCellRep，2004，22397-402；WuH，McCormacAC，ElliottMC&ChenDF.Agrobacterium-mediatedstabletransformationofcellsuspensionculturesofbarley(HordeumvulgareL.).PlantCellTiss.Org.Cult，1998，54161-171；TrifonovaA，MadsenS，OlesenA.Agrobacterium-mediatedtransgenedeliveryandintegrationintobarleyunderarangeofinvitrocultureconditions.PlantSci，2001，161871-880；FangYD，AkulaC，AltpeterF.Agrobacterium-mediatedbarley(HordeumvulgareL.)transformationusinggreenfluorescentproteinasavisualmarkerandsequenceanalysisoftheT-DNA::barleygenomicDNAjunctions.JPlantPhysiol，2002，159113l-1138；TravellaS，RossSM，HardenJ，EverettC，SnapeJW，HarwoodWA.AcomparisonoftransgenicbarleylinesproducedbyparticlebombardmentandAgrobacterium-mediatedtechniques.PlantCellRep，2005，23780-789；KumlehnJ，SerazetdinovaL，HenselG，BeckerD，LoerzH.Genetictransformationofbarley(HordeumvulgareL.)viainfectionofandrogeneticpollencultureswithAgrobacteriumtumefaciens.PlantBiotechnolJ，2006，4251-261；等等)。Tingay等采用的方法是用基因枪先轰击愈伤组织，再将具有细小伤口的愈伤组织作为农杆菌转化的受体。虽然其具有转基因低拷贝、遗传稳定等优点，但也加大了实验难度和提高了实验成本。同时，在大麦的农杆菌介导转化中，目前存在的突出问题就是受基因型限制、转化频率不高以及筛选标记单一。在实际工作中，必须改进现有技术体系的缺陷和不足。本发明从愈伤组织培养和转化程序入手，并通过PMI/甘露糖筛选体系在大麦遗传转化中的应用，进一步克服愈伤组织在转化过程中由于长时间的筛选继代影响分化的问题，从而建立一种高效的农杆菌介导的大麦遗传转化方法。PMI/甘露糖筛选系统对人体和环境安全、筛选试剂价格低廉、不影响转化植株的生长发育、筛选效率高。氯酚红(CPR)显色法是利用植物进行甘露糖代谢会使培养基酸化的原理。pH指示剂氯酚红在pH6.0时呈红色，随着pH下降转变成黄色。该方法是PMI活性检测的最常用方法，在转基因小麦、玉米和甜橙检测上均有应用(BoscariolRL，AlmeidaWAB，DerbyshireMTVC，MouroFilhoFAA，MendesBMJ.TheuseofthePMI/mannoseselectionsystemtorecovertransgenicsweetorangeplants(CitrussinensisL.Osbeck).PlantCellRep，2003，22122-128；WrightM，DawsonJ，DunderE.Efficientbiolistictransformationofmaize(ZeamaysL.)andwheat(TriticumaestivumL.)usingthephosphomannoseisomerasegene，pmi，astheselectablemarker.PlantCellRep，2001，20429-436；GaoZ，XieX，YanL，MuthukrishnanS，LiangGH.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedsorghumransformationusingamannoseselectionsystem.PlantBiotechnolJ，2005，3591-599；DegenhardtJ，PoppeA，MontagJ，SzankowskiI.Theuseofthephosphomannoseisomerase/mannoseselectionsystemtorecovertransgenicappleplants.PlantCellRep，2006，251149-1156；LuccaP，YeXD，PotrykusI.Effectiveselectionandregenerationoftransgenicriceplantswithmannoseasselectiveagent.MolBreeding，2001，743-49；等等)，在大麦的遗传转化中还尚未有报道。与GUS组织染色相比，氯酚红显色法无需昂贵试剂，干扰反应少，结果可靠。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，研制一种高效的农杆菌介导的无抗生素筛选培育大麦转基因植株的方法，利用PMI(磷酸甘露糖异构酶)/甘露糖筛选体系和氯酚红(CPR)在大麦的遗传转化和鉴别大麦转基因植物中的应用，以提高大麦基因转化的效率。本发明通过以下技术方案实现1、引物设计与载体构建根据Genebank公布的DNA序列，设计一对大肠杆菌manA基因的特异引物，该引物的编号及结构如下1)PMIP15’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’；PMIP2’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’。2)从大肠杆菌基因组中PCR扩增manA基因，测序后作为选择标记基因用于载体构建。将克隆到pUC18-manA的基因，用BamHI酶切，同时从中间载体pMBL-3及pBAR(由德国马普研究所郭岩博士惠赠)中分别以HindIII及BamHI-HinIII酶切获得玉米泛素启动子及相关序列，克隆连接到以pUC8为基础的载体上，构建形成了pMBL-5植物表达载体。其具体的构建路线见图2。将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌。2、利用农杆菌介导的无抗生素筛选的大麦遗传转化，它包括以下步骤1)、愈伤组织的诱导以宽约0.5mm～1.5mm，颜色半透明的大麦幼胚作为外植体。先将未成熟大麦种子用70％乙醇灭菌30秒，无菌水冲洗1遍，再用0.1％升汞灭菌8分钟，无菌水冲洗3遍，每遍3分钟。剥取所述的外植体，将外植体盾片向上接种到诱导培养基上，在25℃黑暗的条件下培养，诱导出愈伤组织。2)、愈伤组织的预培养从步骤1)得到的愈伤组织中挑取生长旺盛的接种到预培养培养基上，在25℃黑暗的条件下培养5小时；3)、愈伤组织的浸梁将经过预培养的愈伤组织转入农杆菌悬浮培养基中，置于摇床上振荡(100转/分钟)浸染30分钟；4)、愈伤组织和农杆菌共培养将愈伤组织从农杆菌悬浮培养基中夹出，置于无菌滤纸上稍微吹干，接种至共培养培养基，在25℃黑暗条件下培养2天；5)、愈伤组织的恢复培养将愈伤组织转入含有500mg/L头孢霉素的无菌水中，置于摇床上振荡(100转/分钟)浸泡30分钟，在无菌滤纸上稍微吹干，最后接种到恢复培养基(以达到抑菌和恢复培养的目的)上25℃黑暗培养7天；6)、愈伤组织的筛选培养将抑菌良好的愈伤组织接种到筛选培养基，25℃黑暗条件下筛选培养3周；7)、愈伤组织的分化挑选筛选后新生长和未褐化死亡的愈伤组织接种到分化培养基，25℃，2000Lux，光照培养至分化出绿色芽点；8)、再生植株的再筛选将分化产生的绿色芽点或小苗接入含有甘露糖的壮苗培养基，25℃，2000Lux，光照培养至移栽，得到候选的转化植株。3、利用氯酚红液体检测培养基检测转基因植株磷酸甘露糖异构酶(PMI)活性，具体步骤是选上述得到的候选转化植株主茎上最新长出来的一片叶，剪取约0.3cm×0.5cm面积大小的叶尖段，将叶段浸入氯酚红液体检测培养基中，于25℃避光培养4天后观察培养基颜色变化。同时按照相同要求剪取未转化植株的叶段，分别浸入氯酚红液体检测培养基和氯酚红液体对照培养基中，于25℃避光培养4天作为对照。在本发明中，下列培养基是至关重要的，各类培养基组分及其配方如下1、诱导培养基(编号MS2)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.8。2、预培养培养基(编号MS3)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，0.4mol/L甘露醇，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.83、农杆菌浸染时的液体悬浮培养基(编号MS11)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，100μmol/L乙酰丁香酮，30g/L麦芽糖，补充水分至1L，pH5.84、共培养培养基(编号MS4)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，100μmol/L乙酰丁香酮，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.8。5、恢复培养基(编号MS5)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，500mg/L头孢霉素，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.86、筛选培养基(编号MS6)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，223mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，2mg/L2，4-D，500mg/L头孢霉素，10g/L麦芽糖，20g/L甘露糖，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.8。7、分化培养基(编号MS7)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，1.25mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，300mg/L头孢霉素，30g/L麦芽糖，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.8。8、生根培养基(编号MS8)950mg/LKNO3，825mg/LNH4NO3，85mg/LKH2PO4，185mg/LMgSO4·7H2O，220mg/LCaCl2·2H2O，13.9mg/LFeSO4·7H2O，18.65mg/LNa2·EDTA，0.415mg/LKI，3.1mg/LH3BO3，11.15mg/LMnSO4·4H2O，4.3mg/LZnSO4·7H2O，0.125mg/LNa2MoO4·2H2O，0.625mg/LCuSO4·5H2O，0.0125mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，0.5mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，690mg/L脯氨酸，250mg/L肌醇，1000mg/L水解酪蛋白，1mg/LNAA，10g/L麦芽糖，20g/L甘露糖，200mg/L头孢霉素，6g/L琼脂，补充水分至1L，pH5.8。9、氯酚红液体检测培养基(编号MS9)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸，100mg/L肌醇，0.1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，15g/L甘露糖，100mg/L氯酚红，补充水分至1L，pH6.0。10、氯酚红液体对照培养基(编号MS10)1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，27.8mg/LFeSO4·7H2O，37.3mg/LNa2·EDTA，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，2mg/L甘氨酸100mg/L肌醇，0.1mg/LVB1，0.5mg/LVB6，0.5mg/LVB5，15g/L蔗糖，100mg/L氯酚红，补充水分至1L，pH6.0上述培养基的高压蒸汽灭菌按照报道的常规方法进行。本发明的有益效果是本发明以生产上广泛推广种植的三个大麦品种(早熟3号、鄂大麦7号和花30，品种来自湖北省农业科学院)为试验材料，在参考已发表的大麦农杆菌转化方法，并结合申请人已得到的大麦甘露糖耐受性研究结果的基础上获得。已报道的大麦农杆菌介导的转化中一般都利用抗生素进行筛选，采用模式品种GoldenPromise作为受体。GoldenPromise是珍贵的酿酒大麦品种，目前大麦遗传转化的工作集中在对GoldenPromise的研究，但其种植成本高昂，在我国并没有广泛种植。同时，Tingay等(TingayS，McElroyD，KallaR，FiegS，WangM，ThorntonS&BrettellR.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.JPlant，1997，111369-1376；)的经典农杆菌转化方法应用基因枪轰击作为辅助手段，提高了实验成本，抗生素的筛选加大了愈伤的死亡率，转化率仅4.2％。本发明克服了现有技术的不足，打破了大麦遗传转化基因型的限制，利用甘露糖为选择剂，研制了一种简便高效的农杆菌转化方法和氯酚红检测方法。本发明所采用农杆菌介导遗传转化的大麦栽培品种转化率最高达到12％(见表1)，用氯酚红显色法筛选转化植株的效率达到100％，即所有经氯酚红显色法检测为阳性的转基因植物，PCR分析均为阳性。氯酚红显色法鉴定结果证实了整合到植物基因组中的基因不仅表达，而且表达的蛋白质能形成具有功能的生物酶。因此氯酚红显色法是一种转基因功能鉴定法。本发明的方法简单，操作简便，结果可靠，具有广泛的应用价值。表1本发明转化的大麦品种与文献报道方法转化的模式品种主要技术参数比较说明a参考文献TrifonovaA，MadsenS，OlesenA.Agrobacterium-mediatedtransgenedeliveryandintegrationintobarleyunderarangeofinvitrocultureconditions.PlantSci，2001，161871-880.b本发明分多批次转化，品种早熟3号共转化了916个幼胚，品种鄂大麦7号共转化了418个幼胚，品种花30共转化了920个幼胚。图1，是本发明的技术流程图。图2，是本发明中植物表达载体pMBL-5物理构建图谱。图3，是本发明中利用农杆菌介导无抗生素筛选转化方法得到的转化植株。图中右上角是已结实的单穗。图4，是本发明中转化植株的CPR检测结果。图中标注A1和A2是氯酚红对照培养基，A2-C4是氯酚红检测培养基，A2和A4是未转化植株的叶片，B1-C4是不同转化植株的叶片。图5，是本发明中转化植株的PCR结果。图中标注M为分子量标记，1-8为转基因人麦，9为阳性对照pMBL-5，10为非转化大麦植株对照，11为空白对照。图6，是甘露糖对大麦品种花30愈伤诱导、继代、分化的影响。具体实施例方式实施例1农杆菌介导的无抗生素的大麦基因转化1、愈伤组织的诱导以宽约0.5mm～1.5mm，颜色半透明的大麦幼胚(品种早熟3号-来自湖北省农业科学院)作为外植体。先将未成熟大麦种子用70％乙醇灭菌30秒，无菌水冲洗1遍，再用0.1％升汞灭菌8分钟，无菌水冲洗3遍，每遍3分钟。剥取所述的外植体，将外植体盾片朝上接种到诱导培养基(参见《
发明内容》部分)上，在25℃黑暗的条件下培养，诱导出愈伤组织。2、愈伤组织的预培养从第一步得到的愈伤组织中挑取生长旺盛的接种到预培养培养基(参见《
发明内容》部分)上，在25℃黑暗的条件下培养5小时；3、愈伤组织的浸染将经过预培养的愈伤组织转入农杆菌浸染时液体悬浮培养基(参见《
发明内容》部分)中，置于摇床上振荡(100转/分钟)浸染30分钟；4、愈伤组织和农杆菌共培养将愈伤组织从农杆菌悬浮培养基中夹出，置于无菌滤纸上稍微吹干，接种至共培养培养基(参见《
发明内容》部分)，在25℃黑暗条件下培养2天；5、愈伤组织的恢复培养将愈伤组织转入含有500mg/L头孢霉素的无菌水中，置于摇床上振荡(100转/分钟)浸泡30分钟，在无菌滤纸上稍微吹干，最后接种到恢复培养基上25℃黑暗培养7天；6、愈伤组织的筛选培养将抑菌良好的愈伤组织接种到筛选培养基(参见《
发明内容》部分)，25℃黑暗条件下筛选培养3周；7、愈伤组织的分化挑选筛选后新生长和未褐化死亡的愈伤组织接种到分化培养基(参见《
发明内容》部分)，25℃，2000Lux，光照培养至分化出绿色芽点；8、再生植株的再筛选将分化产生的绿色芽点或小苗接入含有甘露糖的生根培养基(参见《
发明内容》部分)，25℃，2000Lux，光照培养至移栽，得到转化植株。其发明效果如附图3所示。实施例2转化植株的氯酚红显色法(CPR)检测选实施例1的转化植株主茎上最新长出来的一片叶，剪取约0.3cm×0.5cm面积大小的叶尖段，将叶段浸入氯酚红液体检测培养基(该培养基的成分见《
发明内容》中氯酚红液体检测培养基的制备部分)中，于25℃避光培养4天后观察培养基颜色变化。同时按照相同要求剪取未转化植株的叶段，分别浸入氯酚红液体检测培养基和氯酚红液体对照培养基中(参见《
发明内容》氯酚红液体对照培养基的制备部分)，具体操作步骤参见《
发明内容》部分，于25℃避光培养4天作为对照。如果观察到氯酚红液体检测培养基的颜色变黄说明检测到磷酸甘露糖异构酶(PMI)酶的活性，如果该培养基仍保持红色或者变为紫色，说明转基因植株叶片中检测不到PMI酶的活性。在以蔗糖为碳源的对照培养基条件下，如果对照培养基的颜色变为黄色，说明被培养的转基因植株的叶片利用了蔗糖。本实施例的结果表明，被测的8株转基因大麦植株中有6株为阳性转化植株，说明了本发明的特异性。本实施例的发明效果如附图4所示。实施例3对转化植株的PCR检测取0.1g左右的大麦转基因转化植株的叶片，在液氮中研磨成粉末，用常规的CTAB法(参考本申请人专利申请号为200610019482.0公开的方法)抽提大麦总DNA。设计一对特异性引物Primerl(正向，5’-GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC-3’)和Primer2(反向，5’-TCCGGCTTGTGGTTAGGATC-3’)进行PCR扩增。在25ulPCR反应液中，含有300ng模板DNA，2.5ulPCR缓冲液，1.5ul25mMMgCl2，2ul1.25mMdNTPs，0.5ulPrimerl(10pmol/ul)，0.5ulPrimer2(10pmol/ul)，1UTaq聚合酶。PCR反应条件为95℃5min；94℃1min，58℃50sec，72℃90sec，35个循环；最后72℃5min，10℃10min。反应完成后，取18ulPCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳。凝胶成像系统中紫外灯下照相，根据PCR产物片断判断外源基因的整合情况。产生的特异性条带大小为480bp，根据PCR产物的带型判断出被测的8株转化植株中有6株阳性转化植株，发明效果如附图5所示。实施例4甘露糖对大麦愈伤组织诱导、继代和分化影响的试验为了确定以甘露糖作为选择剂的有效使用浓度，本实施例以大麦栽培品种(品种为花30-来自湖北省农业科学院)的成熟胚为外植体，每处理50个外植体，比较了不同甘露糖梯度浓度对大麦成熟胚的愈伤诱导、继代和分化的影响，得到如图6所示的结果。图6显示在愈伤组织诱导培养基上，当培养基中甘露糖浓度为10g/L或15g/L时，大麦成熟胚的愈伤组织诱导率降低50％，当甘露糖浓度增加为20g/L或25g/L时，大麦成熟胚愈伤诱导和生长完全受到抑制；另外，愈伤组织在分化培养阶段对甘露糖的耐受性最高。故本发明确定在愈伤组织生长阶段(即继代)使用20g/L甘露糖作为选择剂。在生根阶段继续使用20g/L甘露糖作为生根成苗的选择剂，均可以达到理想的诱导效果。权利要求1.一种农杆菌介导的无抗生素筛选转基因大麦植株的方法，其步骤包括引物设计、PCR扩增、载体构建、遗传转化、筛选鉴定转基因植物，其特征在于，通过农杆菌介导将manA基因导入受体大麦中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选，通过鉴定磷酸甘露糖异构酶活性和PCR检测，筛选获得转基因植株，其制备步骤如下1)设计一对特异引物PMIP15’-ATGGATCCATGCAAAAACTCATTAACTCA-3’和PMIP25’-AAGGATCCTTACAGCTTGTTGTAAACACG-3’，扩增大肠杆菌manA基因，以该基因为选择标记基因构建植物表达载体，转化根癌农杆菌；2)在愈伤组织诱导培养基上诱导大麦幼胚，得到愈伤组织；3)将步骤2)的愈伤组织转移至预培养培养基上培养5小时；4)将步骤3)的愈伤组织与农杆菌共培养，将共培后的愈伤组织依次转移至恢复、筛选、分化和生根培养基上培养，筛选获得到侯选转基因植株；5)用氯酚红显色法检测侯选转基因植株，并将所筛选的候选转基因植株移栽成苗；6)进一步用PCR鉴定移栽后的转基因植株，获得转基因植物；其中步骤2)所述的愈伤组织诱导培养基按以下配方制备MS2愈伤组织诱导培养基KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2·EDTA37.3mg/L，KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O1.25mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，甘氨酸2mg/L，VB11mg/L，VB60.5mg/，VB50.5mg/L，脯氨酸690mg/L，肌醇250mg/L，水解酪蛋白1000mg/L，2，4-D2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂6g/L，补充水分至1L，pH5.8；步骤3)所述的培养基按以下配方制备MS3预培养培养基以MS2培养基为基本培养基，附加甘露醇72.8g/L，pH5.8；步骤4)所述的培养基按以下配方制备MS4共培养培养基以MS2培养基为基本培养基，附加乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8；MS5恢复培养基以MS2培养基为基本培养基，附加头孢霉素500mg/L，pH5.8；MS6筛选培养基，以MS2培养基为基本培养基，将其中的麦芽糖30g/L修改为10g/L，附加甘露糖20g/L，pH5.8；MS7分化培养基以MS2为基本培养基，附加头孢霉素300mg/L，同时除去2，4-D2mg/L，pH5.8；MS8生根培养基KNO3950mg/L，NH4NO3825mg/L，KH2PO485mg/LMgSO4·7H2O185mg/L，CaCl2·2H2O220mg/L，FeSO4·7H2O13.9mg/L，Na2·EDTA18.65mg/L，Kl0.415mg/L，H3BO33.1mg/L，MnSO4·4H2O11.15mg/L，ZnSO4·7H2O4.3mg/L，Na2MoO4·2H2O0.125mg/L，CuSO4·5H2O0.625mg/L，CoCl2·6H2O0.0125mg/L，甘氨酸2mg/L，VB10.5mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L，脯氨酸690mg/L，肌醇250mg/L，水解酪蛋白1000mg/L，NAA1mg/L，麦芽糖10g/L，甘露糖20g/L，头孢霉素200mg/L，琼脂6g/L，补充水分至1L，pH5.8。2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物表达载体是pMBL-5。3.权利要求1所述的方法，其中步骤5)所述的方法如下1)制备氯酚红检测培养基；2)将步骤1)检测培养基分装至细胞培养板中；3)将转基因植株叶片浸入检测培养基中，25℃暗培养4天；4)鉴定转基因植物特异颜色反应。4.权利要求3所述的方法，其中氯酚红检测培养基按照下列配方制备KNO31900mg/L，NH4NO31650mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，FeSO4·7H2O27.8mg/L，Na2·EDTA37.3mg/L，KI6.2mg/L，H3BO30.83mg/L，MnSO4·4H2O，22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl2·6H2O0.025mg/L，甘氨酸2mg/L，肌醇100mg/L，VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L，甘露糖15g/L，氯酚红100mg/L，补充水分至1L，pH6.0。5.权利要求1所述的方法，其中步骤6)所述的方法如下采用一对特异性引物Primer1(正向，5’-GTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC-3’)和Primer2(反向，5’-TCCGGCTTGTGGTTAGGATC-3’)PCR扩增manA基因特异DNA片段，该片段长度为480bp。全文摘要本发明属于植物转基因
技术领域：
，具体涉及一种农杆菌介导的无抗生素筛选培育大麦转基因植株的方法。本发明的要点是，通过农杆菌介导将报导基因manA导入受体大麦细胞中，利用甘露糖替代抗生素作为选择剂，对转化后的受体细胞进行筛选；通过磷酸甘露糖异构酶活性调节大麦的遗传转化进程，利用氯酚红显色方法和PCR方法对转基因大麦候选植株作进一步筛选，最终获得高转化率的转基因大麦植株。本发明所采用农杆菌介导遗传转化的大麦栽培品种转化率最高达到12％，用氯酚红显色法筛选转化植株的效率达到100％。文档编号A01H1/00GK101016568SQ200710051390公开日2007年8月15日申请日期2007年1月26日优先权日2007年1月26日发明者廖玉才,李和平,王韬,黄涛申请人:华中农业大学