专利名称：：一种培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法
技术领域：
：本发明涉及一种培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法。技术背景甘蓝类蔬菜包括结球甘蓝、花椰菜、绿菜花、球茎甘蓝、芥蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝等，是我国的主要蔬菜类群，在蔬菜周年供应及外贸出口中占据重要地位。黑腐病是我国长久以来危害甘兰类蔬菜生产的主要病害之一，其致病菌有6大类生理小种，其中生理小种1及4是主要致病小种，但目前栽培种中普遍存在的是对生理小禾中3的抗性(Vicente,J.G.,Conway,Roberts,S丄,andTaylor,J.D.IdentificationandoriginofX"W/zoOTOwoyca，e欲/spvcperfWj1racesandrelatedpathovars.Phytopathology,2001，91:492-499;Vicente,JG.，TaylorJD,SharpeAG,ParkinIAP，LydiateDJ,KingGJ.Inheritanceofrace-specificresistanceto^im/Aomowaypv.ca附/e血、in5myw'cagenomes.Phytopathology,2002,92:1134-1141.)，缺乏对主要致病菌的抗原。缘于病原菌的多变性、多样性，植物在长期进化过程中也伴随产生了不同的抗性基因。根据病原菌与寄主抗性的基因对基因理论(PuhlerA，ArlatM,BeckerA.Whatcanbacterialgenomeresearchteachusaboutbacteria-plantinteractions*Currentopinioninplantbiology,2004,7:137-147.)，存在于不同物种中的抗病性来自于不同的基因。因此实现不同物种间的抗性基因转移，对于获得新的抗病种质，以及利用这些种质培育新的抗病品种具有重要意义。在长期自然选择下，芸薹属作物一些近缘野生种有许多对病虫害具备高度抗性以至免疫力。要利用这些抗性基因，一个方法是克隆基因，并通过基因工程手段导入目标材料中。但是许多抗病性是受多基因控制，仅分离、导入一个基因，转基因材料获得的抗病性常不理想。而且，对于抗性基因的分析、定位、克隆和转化存在着技术难度大，周期长，投资高，以及市场的准入和接受程度等问题。另一个方法可以通过有性杂交的手段，向栽培品种引入抗性基因，但是物种间的生殖隔离使常规的有性杂交非常困难甚至不可能。而借助细胞杂交手段却可以实现远缘种间的核质基因融合，达到向栽培种中引入野生优异基因的目的，而且它在细胞质基因控制性状，多基因控制性状的引入上还具有明显优势。采用细胞杂交手段，已在多种作物的种质创新上产生了众多成果。如小麦上获得了抗盐以及具新的HMW麦谷蛋白亚基的高代体细胞杂种(于智勇，谭潇轶，薛哲勇，夏光敏.高冰草与小麦体细胞杂种后代的耐盐性和麦谷蛋白分析.高技术通讯，2006，16(5):511-516。)；获得了抗软腐病的马铃薯种间体细胞杂种(TekAL，StevensonWR，HelgesonJP，etal.Transferoftubersoftrotandearlyblightresistancesfrom5b7朋鹏力rew'ofe"51intocultivatedpotato.TheorApplGenet,2004，109:249-254.);在甘蓝型油菜上获得了新的抗病种质(SjOdinCandGlimeliusK，1989b.Transferofresistanceagainstp力o鹏h."卵迈to^firassics"邵〃sbyasymmetricsomatichybridizationcombinedwithtoxinselection.Theor.Appl.Genet.78，513-520.LeliveltCLC，LeunissenEHM,FrederiksHJ"，HelsperJ"PFGandKrensFA.1993.Transferofresistacetothebeetcystnematode(HeteroderaschachtiiSchm.)from57朋/iss2ZsL(whitemustard)tothe■SrassJ.cs朋/wsLgenepoolbymeansofsexualandsomatichybridization.TheorApplGenet,85:688-696.)等等。尤其具有代表性的是将原来存在于萝卜中的"0gura"型细胞质雄性不育基因，通过体细胞杂交手段转移到甘蓝型油菜等中(PelletierG.1986.Plantorganellegeneticsthroughsomatichybridization.Oxfordsurveysofplantmolecularandcellbiology,3，97-121.),并且经过进一步的非对称融合中，供体和受体细胞器的重组，在后代中获得了在低温下叶片保持正常绿色以及抗除草剂(triazine)的Ogucms胞质雄性不育育种材料，该材料在各国的育种工作中已得到广泛应用。黑芥是十字花科芸薹属的一个野生种，有研究表明黑芥基因组中存在对黑腐病主要致病小种1及4的高抗性(Vicente,JG.，TaylorJD，SharpeAG，ParkinIAP，LydiateDJ，KingGJ.Inheritanceofrace-specificresistancetoiknf力o/K^3sca;zpestrispv.ca/wpestrj'sinSrassicsgenomes.Phytopathology,2002，92:1134-1141.)。
发明内容本发明的目的是提供一种培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法。本发明所提供的培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法，包括以下步骤1)将对黑腐病具有抗性的黑芥(^^sw'c3/^^^)和甘蓝类蔬菜进行细胞融合，获得杂种细胞；2)离体培养所述杂种细胞，获得再生植株，得到对黑腐病具有抗性的甘蓝类蔬菜杂种。所述抗黑腐病甘蓝类蔬菜具体可为花椰菜。所述方法中，用于进行细胞融合的黑芥("rssw'ca/^^<3)的供体可为叶肉原生质体。当所述甘蓝类蔬菜为花椰菜时，用于进行细胞融合的所述花椰菜的受体可为下胚轴原生质体。所述花椰菜具体可为花椰菜(Ao/eraceavar./otJT"s)，在北京市农林科学院北京蔬菜研究中心的编号为0307。所述细胞融合可通过聚乙二醇介导，如PEG-1450。所述步骤2)中，所述杂种细胞在原生质体培养基中培养到细胞进入l一2次分裂时，转入愈伤组织培养基中进行愈伤组织的诱导培养，当培养至愈伤组织大小为l-5mm时，再转入分化培养基中进行不定芽的诱导培养，培养至幼苗的真叶形成时，再转入生根培养基进行生根培养，获得再生植株。所述原生质体培养基具体可为B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—'、二水合氯化钙865-885mg!/1、山梨糖醇45500mgL—\甘露醇45500mgL—1、葡萄糖2500mgL_1、2-脱氧-核糖115-135mgL—'、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL_1、萘乙酸0.15-0.25mgL—'和6-节氨基嘌呤0.15-0.25mgL—'的pH5.8-6.0的液体培养基；所述愈伤组织培养基具体可为B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—'、蔗糖25000-35000mgL-'、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL-'、萘乙酸O.15-0.25mgL-1和6-苄氨基嘌呤0.15-0.25mgL—1的pH5.8-6.0的固体培养基；所述分化培养基具体可为MS基本培养基的大量元素和微量元素，B5基本培养基的有机成分，并附加水解酪蛋白130-170mgL-1、蔗糖25000-35000mgL-\萘乙酸O.15-0.25mgL-1和6-苄氨基嘌呤2.0-3.0mgL—1的pH5.8-6.0的固体培养基；所述生根培养基具体可为固体MS基本培养基。所述方法中还可包括对所述再生植株进行靶标病害抗性鉴定、和/或分子标记鉴定、和/或基因组大小鉴定、和/或染色体数目鉴定、禾口/或形态鉴定的步骤。本发明利用细胞杂交技术，克服常规育种中的种间杂交障碍，将存在于十字花科野生材料黑芥中的多种抗病基因转入甘蓝类蔬菜基因组，培育得到抗病甘蓝类蔬菜，如具有黑腐病抗性的花椰菜。图1为花椰菜0307下胚轴原生质体与黑芥(iSra"ica/^gra)叶肉原生质体的融合及培养照片图2为融合后细胞培养形成的愈伤组织照片图3为自愈伤组织上形成的再生植株照片图4为花椰菜0307、黑芥(万rasw'ca/^gra)及其杂种再生植株的SRAP分析图谱图5为流式细胞仪分析杂种细胞核DNA含量结果图6为根尖染色体计数分析照片图7为杂种及亲本叶型比较照片图8为黑芥(7ras^c3^>ra)、花椰菜0307及其体细胞杂种的形态学比较及黑腐病抗性鉴定具体实施方式以培育抗黑腐病的花椰菜为例，阐述本发明的培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法。本发明的培育抗黑腐病花椰菜的方法，具体包括以下步骤-1、对花椰菜及黑芥进行黑腐病原菌的人工接种抗性鉴定，明确其抗感特性；2、以具有良好原生质体培养能力的花椰菜下胚轴原生质体为受体，以抗病黑芥的无菌苗叶肉原生质体为供体，通过聚乙二醇(PEG)介导的体细胞杂交获得黑芥与花椰菜的杂种细胞；3、通过杂种细胞的离体培养，获得再生植株；4、采用染色体计数、基因组大小分析、同工酶谱分析、分子标记等手段在再生植株中筛选鉴定出黑芥-花椰菜的杂种；5、对杂种通过组培扩繁后，构建抗病鉴定群体，进行人工接种抗病性鉴定，筛选出对黑腐病具有高抗性的花椰菜-黑芥杂种材料。下面通过实施例详细阐明本发明的技术方案。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、培育抗黑腐病的花椰菜一、黑芥、花椰菜黑腐病抗性的鉴定所用黑芥(^rassj'c3^'^ra)(ZhuJS，DStruss，GR(3bbelen，1993.StudiesonresistancetoJi/3《柳in^rassica"apwrjSra5^.ca"i^raadditionlines.PlantBreeding111,192-197)。所用花椰菜((丑Weraceavar,6"2y"s)为北京市农林科学院蔬菜研究中心收集的种质资源，编号0307(姚星伟，刘凡，云兴福，赵私，RyschkaU,SchumannG.非对称体细胞融合获得花椰菜与i5rassic3印i/7esce/2s的种间杂种。园艺学报，2005，32(6):1039-1044)，以下简称花椰菜0307。黑腐病菌生理小种1和4的混合菌株分离自北京地区高度发病的甘兰类蔬菜。其分离方法及植物的抗病性鉴定方法和标准采用下述文献中描述的方法和标准(张恩慧,程永安，许忠民，王妍妮，马青山.甘蓝3种病害抗源筛选及抗病品种选育研究.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2001，29(6):30-33)。黑腐病菌生理小种1和4的鉴定方法按照下述文献中描述的方法进行Vicente,J.G.，Conway,Roberts，S丄，andTaylor,J.D.IdentificationandoriginofJfa"决o,wosc/^她pvcam/7e5f〃、racesandrelatedpathovars.Phytopathology,2001,91:492-499.先将菌液浓度调整到107108CFU/mL，对4-5真叶期苗采用医用喷雾器进行人工叶面接种。接种前后植株分别保湿24h。黑芥(i5rasw'caw>r3)和花椰菜0307各接种30株。在20-3(TC环境中培养，常规管理。接种后14天调査发病情况，黑芥(Arasw'cam^ra)和花椰菜0307每株各调査3叶，共调査了180片叶。病情依病斑扩展深度划分为0-9级。病情指数为0-2的为高抗，2-15的为抗，15-30的为中抗，30-50的为感病。其中，病情调查以叶片为单位进行普査，病害分级标准如下0级无病斑；l级接种叶片出现褪绿斑，扩展深度卜3mm;3级V型坏死斑扩展深度4-6mra;5级V型坏死斑扩展深度7-lOmm;7级V型坏死斑扩展深度11-15mm;9级V型坏死斑扩展深度16mm以上；病情指数=(E(各级病叶数X相对级数值)/(调査总叶数X9))X100。结果表明黑芥(^^5W'ca/7^rs)的病情指数为l.11,即对接种黑腐菌表现高度抗性。花椰菜0307的病情指数为31.77，为感病类型(图8)。二、黑芥与花椰菜原生质体的融合、培养及再生株诱导1、黑芥及花椰菜原生质体的分离、纯化及融合花椰菜0307种子常规消毒后，在MS基本培养基上萌发，24。C暗培养6d后，取下胚轴用于原生质体制备。黑芥(&^sWca;n'^^)无菌苗培养在MS基本培养基中，每30天继代一次，实验中每次取3-5片幼叶用于叶肉原生质体制备。按照本实验室建立的芸苔属植物下胚轴及叶肉原生质体的分离纯化方法获得纯净原生质体(1)花椰菜原生质体的制备取在暗培养箱发芽56d的下胚轴5080个，放入加有4mL原生质体培养基〔B5基本培养基(Gamborgetal,Planttissueculturemedia.Invitro，1976，12:473-478)的大量元素、微量元素和有机成分，附加水解酪蛋白150mgL;1、二水合氯化钙875mgL—'、山梨醇45500mgL一1、甘露醇45500mgL—1、葡萄糖2500mgL—'、2-脱氧-核糖125mgL—'、2,4-二氯苯氧乙酸0,5mgL-'、萘乙酸0.2mg1/'和6-苄氨基嘌呤0.2mgL—、PH5.86.0;过滤灭菌)的09cm培养皿中，横切成O.10.5mm小段后，将培养基吸出，再加入5mL质壁分离液(54.6gL—1Sorbitol,7.4gL—'CaCL2H20，pH5,6-5.8,121X:灭菌20min)，用封口膜将培养皿封住，放入24'C暗培养箱中静置1h。1h后，去掉质壁分离液，加入68mL酶解液V(1.0%CellulaseR-IO，0.1%MacerozymR-10，溶解在含585mg'L—1MES，100mg*L—1NaH2P04，1g'L—1CaCl2.2H20，63.7g'L-1mannitol，63.7g*L—1sorbitol的溶液中，pH6.0,过滤灭菌)，置摇床中25°C、30rpm，酶解1216h。然后用孔径5080ixm的尼龙网将滤液过滤至无菌离心管中，沿管壁缓慢加入24mL清洗液W5(18.4gL—taCL2H20，9.0gL—'NaCl，0.8gL—to，1.OgL—'Glucose，pH5.6-5.8，121。C灭菌20min)至10mL，1200rpm离心10min。收集酶液与清洗液W5溶液界面之间的原生质体于一个新的离心管中，用W5溶液洗涤两次，每次1000rpra离心5min。原生质体洗涤完毕后，用原生质体培养基调浓度至2Xl()6个/ml，用于原生质体融合。原生质体培养浓度为1X105个/ml。(2)黑芥(5ra^ica/n'gra)叶肉原生质体的制备取1520d继代一次的黑芥(i5rasw'ca/2^T3)无菌组培苗完全伸展的幼叶56片，将其放入加有5mL上述原生质体培养基的培养皿中，切成0.5lmm宽的细条，培养皿用封口膜封住，放入暗培养箱中，24。C质壁分离5h。5h后加入23mL的酶解液I(2%CellulaseR-10，0.5%Driselase,0.5%Hemicellulase，1.0%Pectinase，溶解在含585mgL—1MES，100mgL—1NaH2P04，lgL—1CaCl2.2H20，63.7gL—1mannitol，63.7gL_1sorbitol的溶液中，p朋.0，过滤灭菌)，置摇床中25""C、30rpm，酶解1216h。然后用孔径为5080um的尼龙网将滤液过滤至无菌的离心管中，1000rpm离心5min。倒掉上清液，用0.6M的蔗糖8mL重新悬浮细胞，再缓慢加入清洗液W52mL，形成梯度液层，1200rpm离心10min。收集两溶液界面间的原生质体于一个新的离心管中，用清洗液W5溶液洗涤2次，每次1000rpm离心5min。原生质体洗涤完毕后，可以用于原生质体融合。(3)原生质体融合采用PEG融合法，步骤如下用预融合液(0.15MSorbitol,0.03MCaCl2.2H20，0.075MKC1，0,05MTris-HC1，pH7，2，过滤灭菌)分别调整黑芥(v5ra5^'c諸.,)、花椰菜0307原生质体浓度至2X106个mL—'，按1:1的比例均匀混合供体、受体的原生质体。在直径为6cm的无菌塑料培养皿中均匀分布7滴混合原生质体溶液，每滴40uL，静止放置10min使原生质体沉积在培养皿底部，然后在每滴两侧加60iiL含40X聚乙二醇(PEG1450)的融合液(40XPEG1450，0.3MGlucose,50mMCaCl2.2H20，pH7.0,过滤灭菌)。静止5min后，稍微倾斜培养皿去掉培养皿中的混合液，随即小心加入2mLPEG清洗液I(13%的PEG1450,0.1MGlucose,0.067MSorbitol,0.067MCaCl2.2H20，pH7.0，过滤灭菌)，静止5min后吸去。再小心加入2mLPEG清洗液II(6.7%的PEG1450，0.05MGlucose,0.083MSorbitol,0.083MCaCl2.2H20，pH7.0，过滤灭菌)，静止5min后去掉。用原生质体培养基洗涤培养皿两次，再加入2mL原生质体培养基，于24'C暗培养。2.杂种细胞培养及再生植株诱导培养3-7天后，当观察到较多量的细胞进入一次分裂时，向每培养皿中加入400uL细胞培养基(B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分，附加水解酪蛋白150mgL—'、葡萄糖2500mgL—'、2-脱氧-核糖125mgL—'、蔗糖20000mgL—'、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mgL—'、萘乙酸0.2mgL-'和6-苄氨基嘌呤0,2mgL、pH5.8-6.0;过滤灭菌)，此后每3d加入1次该培养基，大约15天以后有细胞团出现时，转移到愈伤组织培养基(B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分，附加水解酪蛋白150mgL-'、蔗糖30000mgL-'、2，4-二氯苯氧乙酸0.5ragL—'、萘乙酸0.2mgL—'、6-节氨基嘌呤0.2mgL—'和琼脂10000mgL—';pH5.8-6.0;高压灭菌)中促使愈伤组织形成，同时转为正常光照培养。当愈伤组织长到约5隱时，转移愈伤组织到分化培养基(MS基本培养基的大量元素和微量元素，B5基本培养基的有机成分，附加水解酪蛋白150mg*L—'、蔗糖30000mg'lA萘乙酸0.2mgL—'、6-苄氨基嘌吟2.0mgLln琼脂1000mgL-、pH5.8-6.0;高压灭菌)中，诱导不定芽形成。当幼苗的真叶形成时，转移到无激素的MS基本培养基中使再生植株正常生长并生根。上述培养过程的培养温度均为24T:。由于叶肉原生质体具有绿色的叶绿体，而来源于暗培养的下胚轴原生质体为近白色，因此融合的细胞中有明显的叶绿体及白色细胞质存在。此特征可以作为早期鉴别杂种细胞的标志。据此计算，本融合处理条件下，原生质体的异源融合率(显微镜视野下杂种细胞个数/视野里总的细胞数，5个视野取其平均值)为16%。培养4天后，观察到细胞进入1一2次分裂，12天后看到大的细胞团，18天左右有星状细胞团出现，此时转入愈伤组织培养基。40-50天后愈伤组织约1-5mm大小，将它们转入分化培养基上，诱导不定芽的形成。在幼苗的真叶形成后，及时转到无激素的MS基本培养基中可获得生长正常的植株。此技术条件下自原生质体获得再生植株的频率(再生植株数/培养原生质体数)为1.5X10—5。图l示花椰菜0307下胚轴原生质体与黑芥(i&^sw'Cs/w>i^)叶肉原生质体的融合及培养，图中，"一"示花椰菜0307下胚轴原生质体，"一"示黑芥(5rssw'c3;n'^a)叶肉原生质体，"》"示融合细胞分裂。图2示融合后细胞培养形成的愈伤组织，左侧图片为愈伤组织早期照片，右侧图片为愈伤组织晚期照片。图3示自愈伤组织上形成的再生植株，左侧为形成的不定芽照片；右侧形成的完整植株照片。三、花椰菜一黑芥杂种植株的鉴定1、分子标记鉴定首先对再生植株的杂种特性进行DNA水平鉴定。研究表明，SRAP分子标记由于是采用一对能反映植物基因组外显子与内含子结构的引物序列进行扩增，它的扩增结果比RAPD分子标记结果具有更高的稳定性、可靠性，反映的信息量更丰富，多态性更强，因此本研究采用SRAP分子标记对花椰菜一黑芥杂种植株迸行鉴定。植物基因组DNA提取采用常规CTAB法。DNA浓度用分光光度计检测后，稀释到50ng叱—t备用。PCR反应体系为总反应体积为IO叱，其中IOX反应缓冲液1.0化，10mMdNTPs0.25PL，2.5UTag酶(购自TianGen公司)0.6|^L，模板DNA100ng，正向和反向引物各50ng，ddH203.4PL。扩增程序为94°C5min;94°Clmin，35°Clmin，72°Clroin，5个循环；94°Clmin，50°Clmin，72°Clmin，35个循环；72。C10min，4"C保存。PCR产物采用6V变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，^20)3银染法染色显影，在X胶片观察灯上观察分析条带。本研究设计了多对SRAP扩增引物，筛选出5对引物，在黑芥(5rasw'ca/7^rs)与花椰菜0307基因组中表现出很好的扩增多态性，获得了花椰菜0307及黑芥(万i^sWca/^^^)各自基因组的特异扩增带(表l)，可以有效地用于黑芥一花椰菜杂种植株的分子标记鉴定。它们的序列分别是第一对正向序列TGAGTCCAAACCGGAAT，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第二对正向序列TGAGTCCAAACCGGAAG，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第三对正向序列TGAGTCCAAACCGGTTG，反向序列GACTGCGTACGAATTAGC;第四对正向序列TGAGTCCAAACCGGTTG，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第五对正向序列TGAGTCCAAACCGGAAT，反向序列GACTGCGTACGAATTAGC。采用在双亲中表现扩增差异的上述五对引物进行再生植株杂种特性的SRAP分析，能够获得准确的鉴定结果。如采用第四对引物组合对再生植株的DNA进行扩增，样本17，19，2023，28和29号再生株都具有双亲的特征条带，证实为杂种，而样本18，25:，32，47和66号不具有黑芥("rasw'caw'gra)的特征条带，只具有花椰菜0307的特征条带，证明再生植株来自花椰菜0307下胚轴原生质体，而非来自异缘融合细胞，不是杂种(图4)。由于SMP扩增条带远较RAPD中多，因此本试验体系具有更高的杂种检出效率。图4中，C:花椰菜0307;N:黑芥(5r^w'ca/7^T3);17、19、2023、28、29号为杂种再生植株；18、25、32、47、66号为非杂种再生株(来自花椰菜0307原生质体)。+示意黑芥(5rasw'caw>ra)特征带。表1五对SRAP引物在黑芥(^5ras幻'caw'^ra)与花椰菜0307基因组中的特异扩增带<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、流式细胞仪进行基因组大小鉴定采用流式细胞仪可以对植物的基因组大小进行鉴定。由于体细胞杂种应具有双亲的基因组构成，因此对再生植株用流式细胞仪进行DNA含量测定，就可以初步判断其来源。取再生植株和黑芥Brassicanigra)、花椰菜0307叶片各0.2g，分别加入2mL细胞裂解液(363mgTris，148.9mgNa2EDTA，20.2mgSpermine,1.193gKCl，233.8mgNaCl，200ulTritonX-100,以去离子水定容至200mL，pH7.5)，以锋利刀片切碎组织，过滤、离心后用碘化丙碇(PI)染液(BDTACSCalibur)进行细胞核染色。30min后，以供体黑芥(Brassicanigra)和受体花椰菜0307为对照，采用流式细胞仪(BDFACSCalibur)进行再生株细胞基因组大小的测定。再生植株细胞的流式图分析表明，黑芥(5rssWcsW^rs)细胞的DNA含量为0.98pg/细胞核，花椰菜0307细胞的DNA含量为1.19pg/细胞核，17，19，2023，28和29号再生株细胞的DNA含量为花椰菜0307与黑芥(^i^sw'ca/i^ra)细胞DNA含量之和(2.17pg/细胞，如图5)，说明本原生质体融合再生系统中异源细胞的融合再生率是较高的。也印证了分子标记鉴定结果。图5中，I、n分别为黑芥(&m^^细胞周期的G,和G2期；III、IV分别为花椰菜0307细胞周期的G,和G2期；V、VI分别为杂种细胞周期的G,和G2期。3、染色体计数取黑芥(^asw'cs/2^rs)、花椰菜0307，以及再生植株的根尖，饱和对二氯苯预处理2-3h后，卡诺(冰醋酸乙醇=1:3)固定4h，lMHC160。C解离5min，卡宝品红染色后常规压片显微镜检。黑芥(A2^sw'MW>rs)和花椰菜0307的染色体数分别为2rp46和2n-18，显微观察显示，17，19，2023，28和29号再生植株的染色体为34条，即为两亲本染色体之和(如图6)。再一次从染色体数目上证实其杂种特性。图6中，A，花椰菜0307，2n=18;B，黑芥(5r^&'ca力&ra)2n=16;C，杂种2『34。4、杂种与亲本材料的形态学比较将经上述分子标记鉴定、基因组大小鉴定和染色体计数鉴定后的杂种再生植株移栽入温室，在苗期及花期进行形态学比较鉴定。花椰菜0307的叶片呈椭圆形，蓝绿色，叶缘锯齿状，无叶耳，叶面光滑无毛；黑芥(^SraSW'c3/7/^t3)叶片卵圆形，绿色，浅裂，有叶耳，叶面被毛。杂种植株植物学特征基本呈花椰菜0307与黑芥(万msw'c3/n'^ra)中间形态类型，但不同单株在叶片形态、颜色、叶毛的有无等上呈现多样性分布。有的植株有叶毛，有的无被毛，叶裂的程度也不尽相同(如图7)。图7中，最左侧的是花椰菜0307叶片，最右侧的为黑芥(^^s^ca/^ra)叶片，中间的两个是杂种植株的叶片。5、黑腐病抗性鉴定保存在培养瓶中的杂种植株各切取茎段，接种在MS基本培养基附加0.lmg/L6-BA的培养基上，25'C，16h光照/8h黑暗培养，进行体外组织培养扩繁。45d后，将扩繁株分离，并转接入MS基本培养基中生根，15天后株系17，19，20，28和29号各株系至少移栽出15株进入抗病鉴定温室，待恢复正常生长后，采用人工接菌法进行杂种的黑腐病抗性鉴定，所接种的菌株仍为黑腐病菌生理小种1和4的混合菌株，黑腐病抗性鉴定方法同上述黑芥(^^sWcaw>ra)、花椰菜0307黑腐病抗性鉴定。同时对30株黑芥(5rasw'ca、30株花椰菜0307进行相同处理作为对照。所用受体花椰菜0307为一感病品种，因此来自黑芥(v5ra"ics7^gra)的抗病性能有效地在花椰菜一黑芥杂种中反应出来。由于所用花椰菜0307的黑腐病鉴定病情指数为31.77，黑芥(万rassicaw>r<3)的黑腐病病情指数为1.11，而受试的几个株系的花椰菜—黑芥杂种群体的病情指数均分布在2-8之间(表2)，因此实验结果表明，受试花椰菜一黑芥杂种群体具有对黑腐病的高度抗性。表2中，PFCN17、19、20、28和29分别为代表17，19，20，28和29号花椰菜一黑芥杂种株系。皇2花椰菜一黑芥体细胞杂种的黑腐病抗性鉴定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>图8为黑芥(^rasw'csw'gra)、花椰菜0307及其体细胞杂种的形态学比较及黑腐病抗性照片。权利要求1、一种培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法，包括以下步骤1)将对黑腐病具有抗性的黑芥(Brassicanigra)和甘蓝类蔬菜进行细胞融合，获得杂种细胞；2)离体培养所述杂种细胞，获得再生植株，得到对黑腐病具有抗性的甘蓝类蔬菜杂种。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述甘蓝类蔬菜为花椰菜。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，用于进行细胞融合的黑芥(^gr3sw'ca"fgTa)的供体是叶肉原生质体。4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于用于进行细胞融合的所述花椰菜的受体是下胚轴原生质体。5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述花椰菜为花椰菜((Avar.6ot/y"s)，在北京市农林科学院蔬菜研究中心的编号为0307。6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞融合通过聚乙二醇介导；所述聚乙二醇优选为PEG-1450。7、根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤2)中，所述杂种细胞在原生质体培养基中培养到细胞进入1一2次分裂时，转入愈伤组织培养基中进行愈伤组织的诱导培养，当培养至愈伤组织大小为卜5mm时，再转入分化培养基中进行不定芽的诱导培养，培养至幼苗的真叶形成时，再转入生根培养基进行生根培养，获得再生植株。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述原生质体培养基为B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分，并附加水解酪蛋白140-160ragL—'、二水合氯化f丐865-885mgL-\山梨糖醇45500mgL-\甘露醇45500mgL-'、葡萄糖2500mgL—'、2-脱氧-核糖115-135mg!/1、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6ragL/'、萘乙酸0.15-0.25mgf和6-节氨基嘌呤0.15-0.25mgL—i的液体培养基;所述愈伤组织培养基为B5基本培养基的大量元素、微量元素和有机成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—1、蔗糖25000-35000mgL-1、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL-'、萘乙酸0.15-0.25mgL—'和6-苄氨基嘌呤O.15-0.25ragL—'的固体培养基;所述分化培养基为MS基本培养基的大量元素和微量元素，B5基本培养基的有机成分，并附加水解酪蛋白130-170mgL—'、蔗糖25000-35000mgL—'、萘乙酸0.15-0.25mgL—，6-苄氨基嘌呤2.0-3.0ragI/1的固体培养基；所述生根培养基为固体MS基本培养基。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述培养基的pH值均为5.8-6.0。10、根据权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中还包括对所述再生植株进行靶标病害抗性鉴定、和/或分子标记鉴定、和/或基因组大小鉴定、和/或染色体数目鉴定、和/或形态鉴定的步骤。全文摘要本发明公开了一种培育抗黑腐病甘蓝类蔬菜的方法。该方法包括以下步骤1)将对黑腐病具有抗性的黑芥(Brassicanigra)和甘蓝类蔬菜进行细胞融合，获得杂种细胞；2)离体培养所述杂种细胞，获得再生植株，得到对黑腐病具有抗性的甘蓝类蔬菜杂种。该方法利用细胞杂交技术，克服常规育种中的种间杂交障碍，将存在于十字花科野生材料黑芥中的抗病基因转入甘蓝类蔬菜基因组，培育得到抗病甘蓝类蔬菜，如具有黑腐病抗性的花椰菜。文档编号A01H4/00GK101126087SQ20071011853公开日2008年2月20日申请日期2007年7月9日优先权日2007年7月9日发明者红严,凡刘,丽张,张月云,泓赵申请人:北京市农林科学院