专利名称：鉴定花椰菜抗黑腐病的特异引物Ⅱ及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生物技术中的鉴定花椰菜抗黑腐病的引物Ii及其利用该引物序列鉴 定花椰菜抗黑腐病的方法。
背景技术：
黑腐病是由黄单胞杆菌属细菌(Xanthomonascam pestrispv. cam pestris)引起， 不仅危害甘蓝类蔬菜，且危害其他十字花科蔬菜。在世界多数地区，病害的发生常常是毁灭 性的。近年来由于人民生活水平的提高，花椰菜种植面积不断扩大，而生态环境又适宜该病 的发生蔓延。因此，花椰菜黑腐病呈逐年加重趋势，严重影响花椰菜的产量和品质，造成巨 大的经济损失。该病菌主要危害花椰菜的叶片，有时也危害花球。幼苗受害时，子叶呈水浸状并逐 渐变褐枯萎，或蔓延至真叶，使叶片的叶脉呈长短不等的小条斑。成株期发病，病菌多从叶 缘水孔和伤口处入侵，自叶缘开始向内形成“V”形黄褐色病斑，致病叶发黄，叶脉变黑，如病 菌侵入茎部维管束，可引起植株萎蔫。花球受害，一般从花梗开始，颜色变成灰黑色，最后小 花球呈灰黑色干腐状，失去食用价值。花椰菜的抗病育种是提高产量和质量的有效途径之一，抗病品种的选育已成为花 椰菜育种的长久目标，目前采用田间接种鉴定植株抗病性费时费力，而且易受环境等多种 因素的影响，准确度差。随着分子生物学技术的发展，特别是DNA分子标记技术的发展可以 为这些研究提供准确、快捷的辅助手段。由于DNA分子标记不存在表达与否的问题，可以直 接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受取材部位、时间、 发育时期和环境的影响，信息量大，准确率高，为抗黑腐病品种的早期筛选、缩短抗病育种 年限带来广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是克服现有筛选抗病品种技术的不足，提供一种快速、早期筛选花 椰菜抗黑腐病品种的引物序列，和利用该引物鉴定花椰菜抗黑腐病品种的鉴定方法。本发明的技术方案概述如下鉴定花椰菜抗黑腐病的引物II，它由引物序列II-S和引物序列II-A组成。一种使用特异引物II鉴定花椰菜抗黑腐病品种的方法，它包括如下步骤(1)花 椰菜基因组DNA提取。O)PCR扩增；在0. 2ml PCR专用薄壁离心管中加入PCR缓冲溶液 2. 5 μ lUOmmol/LdNTPO. 5μ 1、10 μ mol/L 引物序列 II-S 和引物序列 II-A 各 0. 5 μ 1、花椰 菜基因组DNA 50-100ng、Taq聚合酶2U、无菌水补至25 μ 1，将装有上述溶液的PCR专用薄 壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增条件为94°C预变性180秒，94°C变性45秒，56°C退火45 秒、72°C延伸60秒，扩增30个循环，最后在72°C延伸480秒，扩增完成。(3)PCR扩增产物 的琼脂糖凝胶电泳检测配置1. 2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0. 5μ g/ml)； 在5μ1扩增产物中及标准阳性Marker分别加入Ιμ 6Χ上样缓冲液，混勻，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，120V恒电压，电泳1800秒 后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长或在凝胶成像仪上进行观察。(4)依 照标准DNA marker带在凝胶上的位置鉴定花椰菜是否抗黑腐病。
图1是利用特异引物II和方法对已知抗、感黑腐病花椰菜检测结果的电泳图，1， 为标准分子量marker，2-10为抗病植株，特异条带为400bp ； 11-20为感病植株的检测结果， 无400bp条带图2是利用特异引物II和方法进行田间随机检测结果的电泳图，显示400bp条带 的为抗病植株，未显示条带的为感病植株。
具体实施例方式下面结合实施例子和附图对本发明做进一步的说明利用引物II，对花椰菜抗黑腐病和感黑腐病植株的检测方法，具体步骤如下(1)采用CTAB方法提取花椰菜基因组DNA 取幼嫩花椰菜叶片200mg，在液氮里 研成粉末，移入IOml离心管中，加入^iICTAB裂解液，56°C保温30分钟，加入等体积的酚、 氯仿，充分混勻后，离心，取上清加入細1氯仿、异戊醇，混勻后离心，取上清加入等体积的 异丙醇，-20°C静止2小时，IOOOOg离心20分钟，去上清，沉淀用75 %的乙醇漂洗后风干， 加入50 μ L无菌水溶解DNA沉淀，取5 μ L电泳检测DNA质量和计算DNA的含量；(2) PCR扩 增在0.2ml PCR专用薄壁离心管中加入PCR缓冲溶液2. 5μ l、10mmol/L dNTP 0. 5μ1、 ΙΟμπιοΙ/L引物序列II-S和引物序列II-A各0.5 μ 1、花椰菜基因组DNA 80ng、Taq聚合 酶2U、无菌水补至25μ 1，将装有上述溶液的PCR专用薄壁离心管放入PCR扩增仪中，扩增 条件为94°C预变性180秒，94°C变性45秒，56 °C退火45秒，72°C延伸60秒，扩增30个循 环，最后72°C延伸480秒，扩增完成。(3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测配置1. 2% 的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0.5微克/毫升)；在5μ1扩增产物中及标准阳性 Marker中分别加入1 μ 1 6X上样缓冲液，混勻，用移液器将上述混合液分别加入浸没TBE 电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，120V恒电压，电泳1800秒后停止电泳。凝胶直接在紫外 灯下(紫外波长沈5歷)或在凝胶成像仪上进行观察。(4)依照标准DNA marker带在凝胶 上的位置鉴定花椰菜是否抗黑腐病。图1为已知感抗黑腐病花椰菜植株的检测，1为分子量 标准marker，箭头示500bp ；2-10为抗黑腐病花椰菜植株，具有400bp的条带，11-20为不抗 黑腐病的花椰菜植株；21为阳性对照，图2为田间随机采集的抗、感黑腐病的花椰菜植株， 与阳性对照相比，凡是具有400bp条带的为花椰菜抗黑腐病植株。
权利要求
1.鉴定花椰菜抗黑腐病的特异引物II，其特征在于它由引物序列II-S 5，ATACAGGCACAGACACACTCGC3，和引物序列 II-A :5，TGTCCCTCCCTCAAAGCCATCT3，组成。
2.一种使用权利要求1的鉴定花椰菜抗黑腐病的方法，包括如下步骤(1)提取花椰菜 基因组DNA;(2)基因组DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检测；(3)特异引物PCR扩增，在PCR 扩增专用离心管中加入PCR缓冲溶液、dNTP、引物序列II-S和引物序列II-A、花椰菜基因 组DNA、Taq聚合酶、无菌水补至25微升，将装有上述液体的PCR专用薄壁离心管放入PCR 扩增仪中，扩增条件为94°C变性180秒，后进行94°C变性30秒，56°C退火45秒，72°C延伸 60秒的扩增循环，循环数为30，最后在72°C延伸480秒，扩增完成。G)PCR扩增产物的琼 脂糖凝胶电泳检测配置1. 2%的琼脂糖凝胶，在凝胶中加入溴化乙锭(0. 5微克/毫升)； 在5微升扩增产物及标准阳性Marker中分别加入1微升6X上样缓冲液，混勻，用移液器 将上述混合液分别加入浸没TBE电泳液的琼脂糖凝胶的点样孔中，120V恒电压，电泳1800 秒后停止电泳。凝胶直接在紫外灯下(紫外波长或在凝胶成像仪上进行观察。(5) 结果判读依照标准阳性Marker带在凝胶上的迁移位置和PCR产物的迁移位置判断花椰菜 抗、感黑腐病情况。
全文摘要
本发明公开了一对用于花椰菜抗黑腐病鉴定的特异引物II和鉴定方法，引物II由引物序列II-S5’ATACAGGCACAGACACACTCGC3’和引物序列II-A5’TGTCCCTCCCTCAAAGCCATCT 3’组成。使用上述引物II鉴定花椰菜抗黑腐病的方法包括4个步骤(1)花椰菜基因组DNA的提取及检测；(2)特异引物对的PCR扩增；(3)PCR产物的凝胶电泳检测；(4)结果判读依据被检测花椰菜基因组DNA的PCR扩增结果鉴定被检花椰菜是否抗黑腐病。采用上述方法鉴定的结果与田间吻合率达95％以上。该方法在花椰菜抗黑腐病种质或植株筛选上具有重要的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102108401SQ20101058119
公开日2011年6月29日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者孙德岭, 宋文芹, 王春国, 郝擘, 陈成彬 申请人:南开大学