专利名称：用于检测烟草根黑腐病菌的引物、探针及实时荧光pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适合于农业生产、植物保护等部门使用的生物工程技术，特 别是 一 种用于检测烟草生产中的土传病害——烟草根黑腐病病原菌 w'o/^is》ssicWs的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒。
背景技术：
烟草根黑腐病是烟草上的重要病害之一，它遍布世界主要产烟区，在美国、加拿大、 曰本等国曾使烟草生产遭受严重损失，我国主产烟区也均有发生。尤其近年来，此病在一 些烟区蔓延，在我国云南、贵州、湖北等省发生较重，严重地块发病率可达30%以上。山 东、河南、安徽、吉林、福建等省也有发生，近年有加重危害的趋势。
目前对于植物病原真菌的检测方法主要有免疫学技术，分子标记技术和常规PCR技术， 但这些技术只能确定病原微生物的有无，却不能对病原真菌的分生孢子及厚亘孢子数目进 行准确的定量。而传统的植物病原真菌检测定量方法是选择性培养基培养计数法，但选择 性培养基培养计数周期长，耗费人力，而且需要操作者具有丰富的形态学知识，因而限制 了选择性培养基培养计数法的应用。
继常规PCR检测技术之后，新兴的实时荧光定量PCR技术凭借其对初始模板 量准确定量、灵敏度高、特异性强、简便迅速等优点，已经成为国内外分子生物 学研究中的主流技术，同样也在植物病原体的检测和诊断中得到了广泛使用。近 年来国内外陆续开始将实时荧光PCR技术应用于植物病害诊断检测。
实时定量荧光PCR是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增 过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均 标准差，在99.7%的置信度时计算出大于平均值的荧光值即阈值，然后收集荧光信号增强 到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对 数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检 测样品的Ct值就可以准确地测定耙标病原菌的起始模板拷贝数。实时荧光PCR根据其产生 荧光的原理分为使用探针和不使用探针的两类方法。由于探针与待检测病原菌DNA序列有 很高的特异性，而且可以有效避免常规PCR的假阳性问题，所以目前使用较为普遍的是荧 光标记探针法。
实时荧光PCR检测方法用于植物病原菌的检测，在国内外都还是刚刚起步。目前，在烟草根黑腐病菌的实时荧光PCR检测中，以5，-ACC ATA TGT GAA CGT ACC TTT TCT -3，和5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3'为引物、以5，- CCC GAG AGG CAC CTGCCAAAGCA -3'序列为探针制备成相应的实时荧光PCR试剂盒，尚无相关报道。
发明内容
本发明的目的之一就是提供一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物，它可以在 PCR检测过程中，定性检测烟草根黑腐病菌，而且特异性强。
本发明所提供用于检测烟草根黑腐病菌的引物包括正向引物Tbl和反向引物Tb2组成 的引物对，所述正向引物Tbl的核苷酸序列见序列表中的序列1所示，Tbl: 5'-ACCATATGT GAA CGT ACC TTT TCT -3，；所述反向引物Tb2核苷酸序列见序列表中的序列2所示，Tb2: 5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3，。
申请人是经过长期大量的实验，从众多用于检测烟草根黑腐病菌的PCR引物中筛选 出上述的由正向引物Tbl和反向引物Tb2组成的引物，其扩增片段大小为76 bp。该引物 的特点是对烟草根黑腐病菌具有高度的保守性，与其它近缘生物种之间不具有显著的同源 性，用该引物进行PCR扩增，实现烟草根黑腐病菌的准确定性检测，且特异性强。
本发明的目的之二就是提供一种用于检测烟草根黑腐病菌的探针，它可以在实时 荧光PCR检测过程中，定量检测烟草根黑腐病菌，显著地提高检测灵敏度。该探针 的碱基序列是在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，两端向上移位2个碱基或下游 移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，所述探针一端连接有荧光淬灭基团，另一端 连接有荧光报告基团。
所述探针荧光报告基团标记在5'端，荧光淬灭基团标记在3'端，构成荧光标记探针。
所述探针是在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'向上游移位2个碱基的核苷 酸序列5，- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CM AGC A -3,，见序列表中的序列4所示。
所述探针的核苷酸序列是序列表中的序列3所示的序列5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，。
所述探针是在5，_ CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向下游移位3个碱基的核苷 酸序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3'，见序列表中的序列5所示。
本发明的目的之三就是提供一种利用目的一中的引物和目的二中的探针制成 的检测烟草根黑腐病菌的试剂盒，可以在实时荧光PCR检测过程中，快速、准确 地定量检测土壤中和植株上的烟草根黑腐病菌，而且稳定可靠、灵敏度高。所述试 剂盒还包括待测样品提取试剂、定量标准品、实时荧光PCR反应液和检测用品，所述实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液10%; MgCl2: 2.6
mmol/L; dNTPs: 0.2腿ol/L; Taq DNA聚合酶:1 U/20 PL;正向引物Tbl: 0.4 Pmol/L; 反向引物Tb2: 0.4 tool/L;荧光标记探针0.4 Mmol/L;采用无菌超纯水调整终浓度。
根据实际情况，在实时荧光PCR反应液中各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓 冲液；MgCl2的初浓度是25隱ol/L; dNTPs的初浓度是10醒ol/L; Taq DNA聚合酶的初浓 度是正向引物Tbl的初浓度是lOWnol/L;反向引物Tb2的初浓度是10 Mmol/L; 荧光标记探针的初浓度是5 Mmol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向 引物Tbl、反向引物Tb2、荧光标记探针的体积比是20:21:4:4:8:8:16。该荧光定量PCR 扩增体系具有很高的灵敏度，检测目标菌DNA的量达到IOO fg/化。
在实时荧光PCR反应液中，各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓冲液；MgCl2的 初浓度是25 mmol/L; dNTPs的初浓度是2 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初浓度是1 U/pL; 正向引物Tbl的初浓度是5刚ol/L;反向引物Tb2的初浓度是5 Wnol/L;荧光标记探针的 初浓度是5 Wnol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引 物Tb2、荧光标记探针的体积比是20:21:20:10:16:16:16。该荧光定量PCR扩增体系具 有很高的灵敏度，检测目标菌DNA的量达到IOO fg/A。
采用本发明中的试剂盒， 一方面，在待测样品预处理过程中，待测样品提取试剂可以 直接提取土壤样品中的烟草根黑腐病菌DNA用作PCR扩增模板，节约了时间；另一方面， 在待测样品的实时荧光PCR扩增过程中，直接将己按最佳组份及其体积比配制好的实时荧 光PCR反应液加入八连管中，既节约了大量的时间，且稳定可靠，从而达到了快速、准确 地检测土壤中和植株上的烟草根黑腐病菌。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点
(1) 特异性强本发明中引物和探针均根据烟草根黑腐病菌特异性序列设计，并与其 它生物种比对，没有显著同源性，检测特异性强；
(2) 灵敏度高利用本发明中实时荧光PCR试剂盒对烟草根黑腐病菌进行检测时，可 以准确定量，目标菌DNA在lOngAt-100fg/化浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏 度高；
(3) 实用性好本发明中实时荧光PCR试剂盒具有开启即用、标准统一、简单方便等 优点，可以快速、准确地检测田间土壤中和植株上的烟草根黑腐病菌，实用性好；
(4) 应用范围广可以定量检测土壤和植株上的烟草根黑腐病菌，适用于烟草根黑腐 病菌田间动态监测和病害诊断，同时可用于烟草根黑腐病菌在烟草植株中的增殖速度和种子带菌的定量检测。
综上所述，采用本发明，能在田间带病土壤中和植株上快速、准确地检测烟草根黑腐 病菌，从而为及时采取措施切断病害的侵染源提供准确依据，也可以快速、准确地检测植 株上的病害，其意义十分重大。
图1荧光定量扩增体系特异性检测 图2A荧光定量PCR阳性标准品扩增曲线 图2B荧光定量PCR标准曲线 图3实际样品检测
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明-
在本发明中，用于检测烟草根黑腐病菌的引物包括正向引物Tbl和反向引物Tb2，其 碱基序列分别是
Tbl: 5，- ACC ATA TGT GAA CGT ACC TTT TCT _3'，见序列表中的序列1所示； Tb2: 5，- AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA -3，，见序列表中的序列2所示。 用设计的特异引物对进行同源性比对后发现特异引物对只与烟草根黑腐病菌具有高度的保 守性，与其它近缘生物种之间不具有显著的同源性，而其他同源性较高的物种在土壤中存 在的可能性极小，说明该引物对的特异性很高。为了更好的验证引物的特异性，在荧光定 量PCR实验中采用如下土壤中常见的土传病原菌，如烟草疫霉病菌 7 ic。fi朋ae)，甘薯黑斑病(Cers^ cyW5"/y/ Ar!'ate)恶疫霉(尸力j^9p/ ^ ora ca"or"/z )， 烟草白星病菌(Carcc^jDara"icotJ'a/7ae)， 棉花立枯病病菌(尸iA5aric"/z ay/^; Qry"历)，棉 花黄妻病菌(Ker"cj7Ji"/z7ok/7iJyae)， 欧文式杆菌(￡nri/w'a car。f。Kora)，枯草芽抱杆 菌(5aci"〃s s〃/7Z^7is)，烟草青枯病菌(/feJsto/7ia w7a/ acear"yz7)和分离培养的土壤 优势菌作为阴性对照菌(表l)，分别提取其基因组DNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯 度后，将DNA浓度调整到50 ng/叱。荧光定量扩增曲线(图l)结果表明，所有阴性对照 菌都没有起始扩增(Ct=N/A)，再次验证了所设计的引物对具有很高特异性。 表l
荧光定量PCR供试菌株 _,_—__
齒种 来源 扩增结果
7烟草根黑腐霉(77//e/"v/o戸"6ay/cW") 烟草 +a
甘薯黑斑病(Cera/00/5to力附Z)r/",") 甘薯 一b
烟草疫雾(尸/2声6ip/^/2ora m'co/towae) 烟草 一
恶疫霉(尸一6^ 她ora c""w訓) 人参，苹果 一
烟草白星病菌(Ce/rMpora ) 烟草 一
棉花立枯病病菌(Fw"r/cww oxj^W7'w附)棉花 一
棉花黄萎病菌(pfe"/a'〃/w附d"/2z7/"e) 棉花 —
欧文式杆菌(5HWm'"cw^ovora) 胡萝卜，大白菜 一
枯草芽孢杆菌(5"cz7/^57^rifc) 土壤 一
烟草青枯病菌(i "too"/" TO/a"ace"ra加) 烟草 一
分离培养的土壤优势菌I (N/Ae) 土壤 一
分离培养的土壤优势菌II(N/A) 土壤 一
分离培养的土壤优势菌III(N/A) 土壤 一
a+阳性b—阴性
°N/A未知
在本发明中，用于检测烟草根黑腐病菌的探针，它的碱基序列是在5'-CCCGAGAGGCAC CTG CCA AAG CA -3'两端向上移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸 序列，在该条核苷酸序列上，荧光报告基团标记在5'端，荧光淬灭基团标记在3'端，以构 成荧光标记探针。
在由正向引物Tbl和反向引物Tb2组成的引物的扩增区域内，按照探针的设计原理和 设计方法，设计出用于烟草根黑腐病菌实时荧光PCR检测的探针，它的碱基序列是在5'-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'两端向上移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任 意一条核苷酸序列；用设计的探针进行实时荧光PCR扩增，对所设计的探针进行筛选；根 据实时荧光PCR扩增的结果，最后筛选出最佳探针。
在5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向上游移位2个碱基的核苷酸序列可以 是5'- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CAA AGC A -3，，见序列表中的序列4所示。
荧光标记探针的核苷酸序列也可以是5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，， 见序列表中的序列3所示，它是最佳的实施方式。
在5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向下游移位3个碱基的核苷酸序列还可 以是5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3，，见序列表中的序列5所示。在荧光标记探针的5'端标有记报告基团FAM， 3'端标记有荧光淬灭基团T扁RA 。当 探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着 PCR进行，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5' —3'外切核酸酶 活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号，报 告基团所释放的荧光可以被定量检测仪内的荧光计检测，模板每复制一次，就有一个探针 被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一 的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。Ct值是PCR过程中荧光量的 积累超过基底荧光量的循环数。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测 样品的Ct值可准确地定量被检测样品中烟草根黑腐病菌的浓度，从而显著提高检测灵敏 度。
本发明所述的检测烟草根黑腐病菌的试剂盒，它包括有待测样品提取试剂、定量标准 品、实时荧光PCR反应液和检测用品，所述实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相 对应的终浓度PCR缓冲液10%; MgCl2: 2.6 mmol/L; dNTPs: 0.2咖ol/L; Taq DNA聚 合酶1 U/25叱；正向引物Tbl: 0.4 Mfliol/L;反向引物Tb2: 0.4 Mmol/L;荧光标记探
针0.4 WTK)1/L;采用无菌超纯水调整终浓度。
待测样品提取试剂由土壤DNA提取缓冲液和TE缓冲液组成，其中TE缓冲液是常规试 剂，是根据《精编分子生物学实验指南(第四版)》中相关方法配制而成的。
定量标准品包括基于烟草根黑腐病菌特有核酸序列设计的标准阳性对照模板和阳性标 准品。标准阳性对照模板由含有插入目标片段的pMD18-T载体(Takara)制备而成。制备 过程为采用引物Tbl和Tb2扩增烟草根黑腐病菌基因组DNA， PCR产物电泳后切胶回收 目标片段，与pMD18-T载体于16'C下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞， 转化产物涂布在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素平板上培养，挑取白斑，摇菌后采用质粒 提取试剂盒(Omega Biotek Inc.)提取质粒，通过酶切和测序鉴定阳性克隆。阳性克隆的 质粒DNA经紫外分光光度计A娜定量，经10x梯度稀释为10 ng/叱-100 fg/叱，保存于-20 。C 。
实时荧光PCR反应液包括有如下的组份及其相对应的终浓度PCR缓冲液10%; MgCl2:
2. 6ramol/L; dNTPs: 0,2鹏ol/L; TaqDNA聚合酶1 U/20 ^L;正向引物Tbl: 0. 4 Mraol/L; 反向引物Tb2: 0.4 Wnol/L;荧光标记探针0.4 Wnol/L;采用无菌超纯水调整终浓度。 其中，PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 DNA聚合酶都是PCR常规试剂，均购自北京鼎国生物技 术责任有限公司，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，荧光标记探针在Takara公司合成。
检测用品包括有自封式塑料袋和0.2 mL八连管。
在利用目的一中的引物和目的二中的最佳探针的基础上，优化反应体系和反应条 件，确定最佳的烟草根黑腐病菌实时荧光PCR检测体系。
本发明优化的实时荧光PCR反应体系总体积为20 ^ ，其中10xPCR缓冲液 25咖ol/L MgCl2 2. 6叱，2咖ol/L， dNTPs 2. 0叱，2. 5 U/叱Taq DNA聚合酶0. 4叱，5 rtnol/L正向引物Tbl和反向引物Tb2各1. 6叱，5 Mmol/L荧光标记探针1. 6叱，DNA模板 1.0叱，无菌超纯水8.8 PL。实时荧光PCR采用两步法，扩增反应程序为94r， 4 min; 然后42个循环，每个循环为94。C， 10 s, 60°C， 20s,在每个循环的退火/延伸阶段(60°C) 收集荧光。
利用本发明中的实时荧光PCR试剂盒对烟草根黑腐病菌进行检测，包括待测样品预处 理和待测样品的实时荧光PCR反应。
待测样品PCR扩增模板的制备和待测样品的实时荧光PCR反应。 待测样品PCR扩增模板的制备为土壤样品PCR扩增模板的制备。 土壤的制样品PCR扩增模板备
(1) 称取0.5克土壤样品于5 mL离心管中，加入0.2 g聚乙烯聚吡咯垸酮(PVPP)，涡 旋30 s，再加入3 mL DNA extraction buffer (100腦1/L Tris-HCl， 100mmol/L EDTA， 100mmol/L Na3P04, 1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB ,pH8. 0)混合均匀；
(2) 迅速置于-196 。C液氮中冰冻2min，取出后于65 。C水浴融解(约3 min，注意时 间不能太长，融解后马上取出)，如此反复2-3次裂解细胞；
(3) 加入20 HL 10 mg/mL蛋白酶K、 0.5 mL 50 rag/mL溶菌酶，上下颠倒混匀，置于 37 。C摇床上振荡30 min (225 r/min);
(4) 加入600 PL 10%SDS， 65 。C水浴30 min，其间每隔5-10 rain轻轻颠倒混匀；
(5) 室温离心(12，000 r/min) 10 min，收集上清液，转移到另一新的5 mL离心管中；
(6) 土壤沉淀再加入0. 5 mL提取液和100叱10% SDS，涡旋30 s， 65 。C水浴10 min， 室温离心(12，000 r/min) 10 min，收集上清液并与前次上清液合并；
(7) 上清液中加入0. 05gPVPP，室温结合20min后，室温离心(12， 000 r/min) 10 min， 收集上清液，转移到另一新的5 mL离心管中；
(8) 上清液用等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，离心(12'000 r/min， 10 min) 后吸取水相转移至另一5 mL离心管中；(9) 用预冷的0. 6倍体积异丙醇室温沉淀30 min，室温离心(12,000 r/min) 10 min， 收集核酸沉淀；
(10) 用冷的70%无水乙醇洗涤沉淀两次，自然吹干，溶解于100化灭菌的超纯水中。 待测样品的实时荧光PCR反应步骤为
(1) 将实时荧光PCR仪开机设置备用；
(2) 向0. 2 mL八连管中加入18叱实时荧光PCR反应液和1叱起始浓度为10 mg/mL 的牛血清蛋白(BSA);
(3) 加入l叱待测样品液，将试剂盒提供的标准阳性对照模板加入阳性对照管中， 阳性标准管中加入阳性标准品的10x梯度稀释液，1叱灭菌去离子水代替模板作为空白对 照，对照样品的用量均为每管l A;
(4) 混合均匀之后即可进行PCR反应；
(5) 待PCR扩增完成，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果，制作标准曲线(图 2)， Y=-3.296X+4. 327，根据标准曲线计算出待测样品反应体系中烟草根黑腐病菌的DNA
采用本发明中的试剂盒， 一方面，在待测样品预处理过程中，待测样品提取试剂可以 直接提取土壤样品中的烟草根黑腐病菌DNA用作PCR扩增模板，节约了时间；另一方面， 在待测样品的实时荧光PCR扩增过程中，直接将已按最佳组份及其体积比配制好的实时荧 光PCR反应液加入八连管中，既节约了大量的时间，且稳定可靠，从而达到了快速、准确 地检测土壤中的烟草根黑腐病菌(图3)。
在上述实时荧光PCR反应液中，各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓冲液；MgCl2 的初浓度是25 mmol/L; dNTPs的初浓度是10 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初浓度是2. 5 U/ 叱；正向引物Tbl的初浓度是10他ol/L;反向引物Tb2的初浓度是10 Mmol/L;荧光标记 探针的初浓度是5 Wnol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、 反向引物Tb2、荧光标记探针的体积比是20:21:4:4:8:8:16。
PCR缓冲液是10xPCR缓冲液；MgCl2的初浓度是25鹏ol/L; dNTPs的初浓度是2 腿ol/L; Taq DNA聚合酶的初浓度是1 U/PL;正向引物Tbl的初浓度是5 Mmol/L;反向引 物Tb2的初浓度是5 mol/L;荧光标记探针的初浓度是5陶ol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引物Tb2、荧光标记探针的体积比是 20:21:20:10:16:16:16。
11序列表
<110>重庆大学
<120>用于检测烟草根黑腐病菌的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒 〈130〉 无 〈160> 5
〈170〉 Patent In version 3. 5 〈210〉 1 〈211〉 19 <212> 腿
〈213> 烟草根黑腐病病原菌(7^'e7蹈-,A Z 頻.co7a) 〈400〉 1
accatatgtg aacgtacctt ttct 19
<210> 2 <211〉 22 <212〉 薩
〈213〉 烟草根黑腐病病原菌(7Me7a",j."aw'co7a:) 〈400> 2
agtttataaa tgctaccggc agaa 22
<210> 3
〈211〉 23
〈212> ■
〈213〉烟草根黑腐病病原菌(7力/e/ari^^is Z^5"ico7a)〈400> 3
cccgagaggc acctgccaaa gca 23
〈210〉 4 〈211〉 25 <212> 謹
〈213>烟草根黑腐病病原菌(r力/e7諮.，is Z 扁'co7s) 〈400> 4
gccccgagag gcacctgcca aagca 25
〈210〉 5 <211> 26 <212〉 画
〈213〉 烟草根黑腐病病原菌(7Me7a"'。p^ Z aw.co73) 〈400〉 5
cccgagaggc acctgccaaa gcagct 2权利要求
1. 一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物，它包括正向引物Tb1和反向引物Tb2组成的引物对，所述正向引物Tb1的核苷酸序列见序列表中的序列1所示，Tb15’-ACC ATA TGTGAA CGT ACC TTT TCT-3’；所述反向引物Tb2核苷酸序列见序列表中的序列2所示，Tb25’-AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA-3’。
2. —种用于检测烟草根黑腐病菌的探针，其碱基序列是在5'- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序 列，荧光报告基团标记在5'端，荧光淬灭基团标记在3'端，构成荧光标记探针。
3. 如权利要求2所述的用于检测烟草根黑腐病菌的探针,其特征在于所述探针是在5'-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3，向上游移位2个碱基的核苷酸序列5，- GCC CCG AGA GGC ACC TGC CAA AGC A -3'，见序列表中的序列4所示。
4. 如权利要求2所述的用于检测烟草根黑腐病菌的探针，其特征在于所述探针的核苷 酸序列是序列表中的序列3所示的序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'。
5. 如权利要求2所述的用于检测烟草根黑腐病菌的探针，其特征在于所述探针是在5'-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA -3'向下游移位3个碱基的核苷酸序列5，- CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CAG CT -3'，见序列表中的序列5所示。
6. —种检测烟草根黑腐病菌的试剂盒，包括权利要求1所述的引物和权利要求2、 3、 4或5所述的探针。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括待测样品提取试剂、 定量标准品、实时荧光PCR反应液和检测用品，所述实时荧光PCR反应液包括有如下的组 份及其相对应的终浓度:PCR缓冲液10%; MgCl2: 2. 6,1/L; dNTPs: 0. 2腸1/L; Taq DNA聚合酶1 U/20 PL;正向引物Tbl: 0.4 Mmol/L;反向引物Tb2: 0.4陶ol/L;荧光标记探针0.4陶0l/L;采用无菌超纯水调整终浓度。
8. 根据权利要求7所述的检测烟草根黑腐病菌的试剂盒，其特征在于在实时荧光PCR 反应液中，各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓冲液；MgCl2的初浓度是25mraol/L; dNTPs的初浓度是10 mmol/L; Taq DNA聚合酶的初浓度是2. 5 U/叱；正向引物Tbl的初 浓度是IO陶ol/L;反向引物Tb2的初浓度是10 Mmol/L;荧光标记探针的初浓度是5陶ol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引物Tb2、荧光标记探 针的体积比是:20:21:4:4:8:8:16。
9. 根据权利要求7所述的检测烟草青枯病菌的试剂盒，其特征在于在实时荧光PCR反应液中，各组份采用的是PCR缓冲液是10xPCR缓冲液；MgCl2的初浓度是25 mmol/L; dNTPs的初浓度是2咖ol/L; Taq DNA聚合酶的初浓度是1 U/叱；正向引物Tbl的初浓度 是5 Wnol/L;反向引物Tb2的初浓度是5 Wnol/L;荧光标记探针的初浓度是5 Wnol/L; PCR缓冲液、MgCl2、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶、正向引物Tbl、反向引物Tb2、荧光标记探 针的体积比是20:21:20:10:16:16:16。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测烟草根黑腐病菌的引物、探针及实时荧光PCR试剂盒，所述的引物包括正向引物Tb1和反向引物Tb2，其碱基序列分别是Tb15’-ACC ATA TGT GAACGT ACC TTT TCT-3’，Tb25’-AGT TTA TAA ATG CTA CCG GCA GAA-3’。所述的探针的碱基序列是在5’-CCC GAG AGG CAC CTG CCA AAG CA-3’两端向上游移位2个碱基或下游移位3个碱基区域内的任意一条核苷酸序列，在该条核苷酸序列上，荧光报告基团标记在5’端，荧光淬灭基团标记在3’端，以构成荧光标记探针，并用上述的引物和探针制备成相应的试剂盒。本发明能在田间病土中快速、准确地检测烟草根黑腐病菌，从而为及时采取措施切断病害的侵染源提供准确依据，也可以快速、准确地检测植株上的病害。
文档编号C12Q1/68GK101451162SQ20081023331
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者刘映红, 康振辉, 李常军, 黄俊丽 申请人:重庆大学