专利名称：一株淡紫拟青霉菌与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株淡紫拟青霉菌与应用，特别是涉及一株淡紫拟青霉菌及其菌剂与 该菌剂在防治植物根结线虫病害中的应用。
背景技术：
在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅
次于真菌病害。植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1000亿美元，其中根结 线虫(Afe/oWogy"e^;0是危害最大的一类植物寄生线虫，每年仅对世界上重要的经 济作物造成的经济损失就高达数百亿美元。在根结线虫属(^fe/o/Jogy"e)内，以南方 根结线虫(M /wcogm'to)、花生根结线虫(M flw"。W。)、爪哇根结线虫(M yavflm'ca) 和北方根结线虫(M /^/")四个种的根结线虫病害发生最为普遍，对农作物的危害也 最大。根结线虫的繁殖力极强，通常每个雌虫可产卵1000枚以上。根结线虫通常没有 明显的寄主专化性，能够侵染的植物超过3000种，分属114科，包括单子叶植物，双 子叶植物，草本植物和木本植物，对大多数的粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、 茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等均可造成严重损失。受其危害后，作物品质下降， 大幅度减产，甚至绝产，同时线虫病的发生又加剧了枯萎病、黄萎病和立枯病等土传 病害的危害，造成植物抵抗能力下降，极易受其它病原物侵染。
在控制该类病害的方法中，由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内，所以一 般化学农药难以控制其危害，因此该类病害成为大量剧毒农药频繁使用的对象，对农 产品生产的安全性构成严重威胁。同时，由于化学杀线剂只能在短期内控制线虫数量， 同时还存在成本高、持效短和抗药性等问题。此外， 一些传统的防治方法，如轮作、 种植抗病品种等虽可起到一定的防治作用，但在实际生产中能够轮作的作物并不多， 对根结线虫具有抗性的作物品种十分有限。因此，传统控制方法并不能解决该类病害。 综上所述，由于目前缺乏实用、高效、可持续的治理技术，根结线虫病发生区域不断 扩大，危害作物种类持续增加，致使农业生产面临严峻挑战，杀线虫生物农药具有非 常广阔的应用价值和市场前景。
安全、有效的防治根结线虫类病害是目前农业生产上亟待解决的紧迫问题，而现 有的化学防治等措施并不能满足这一要求，因此利用线虫生防资源对其进行调控是今 后发展的必然趋势。当前，随着人们环境保护意识的提高和对"无公害产品"需求的不
断增加，生防真菌在植物线虫病害生物防治中显示出越来越重要的作用。但是必须指 出，尽管自然界中有众多的菌物与线虫密切相关，但仅有很少一部分菌株用于研发生 防制剂，并且这些菌剂在生产上真正起到防治作用的很少。此外，目前线虫生防制剂 仍然存在一定的缺点，大大限制了其应用，主要体现在
1. 现有防治植物线虫病害的生防制剂多为孢子制剂，对上游活性成分生产要求 较高，往往需要两步发酵(液体发酵结合固体发酵)才能获得活性成分一真菌孢子， 制备工艺十分繁琐。
2. 剂型化水平低，目前线虫防治用生防制剂多为粉剂、悬浮剂等，工艺粗放， 土壤适用性差，不利于土壤环境施用，且往往难以克服土壤中抑菌萌发的不利环境因 素，不易形成群体，且这些制剂多以种衣剂或拌种剂的形式出现，携带菌量十分有限。 因而缺乏市场竞争力，使其应用受到了限制。
3. 稳定性差，菌剂活力丧失十分迅速，导致生防制剂货架期短，难以商业化生 产。为了保证制剂具有较长时间的货架期，往往要求严格的保存条件，直接限制了真 菌类生物农药的大规模应用。
综上所述，尽管土壤中植物线虫病害生物防治型农药具有非常广阔的市场空间， 长期以来通过对植物寄生线虫的生物防治研究获得了一些具有一定生防潜力的菌株， 但是其产业化应用却进展缓慢，在实际生产中能够满足线虫生防需要的制剂非常缺 乏。因此现有生防资源一旦在剂型技术上有所突破，必将会极大的促进植物寄生线虫 病害的生物防治工作跃上一个新的台阶。
发明内容
本发明的目的是提供一株对植物根结线虫病害具有防治作用的淡紫拟青霉菌。
本发明所提供的是淡紫拟青霉菌(尸"巾70附^".///"">^)￥￡5-2，该菌株已于2007 年4月20日保藏于中国北京朝阳区大屯路中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为CGMCC NO. 2012。
淡紫拟青霉菌(尸./z7acZmtf) YES-2CGMCCNo.2012菌株具有以下特征菌落毡状， 表面初为白色，产孢时变为葡萄酒红色，并且产孢量越多，颜色越深，背面呈白色或 酒红色。该菌株在麦芽汁培养基(MEA)上生长较快，在PDA培养基上也可生长。培 养l周后开始产孢，其分生孢子梗直立，孢梗上轮生排列2-4个瓶梗，顶端串生分生 孢子。分生孢子呈椭球或纺锤形，外壁光滑，大小为(2.0-3.0) X (1.5-2.2)网。 该菌株生长的温度范围为8-38°C，最佳为25-3(TC。该菌株在pH 2-11之间均可以生 长，适宜pH值为5-9。
本发明的第二个目的是提供一种上述淡紫拟青霉菌(P力7ac/m^) YES-2 CGMCC
No. 2012的培养方法。
本发明所提供的淡紫拟青霉菌(尸.Wac/"RS) YES-2 CGMCC No. 2012的培养方法， 是将淡紫拟青霉菌(尸./^c/m^)YES-2 CGMCC No. 2012接种到淡紫拟青霉菌(尸.///""> ) YES-2 CGMCC No. 2012专用液体培养基中，在23-25'C下培养，淡紫拟青霉菌 (尸./z7flc/""s) YES-2 CGMCC No. 2012得到扩大培养；所述淡紫拟青霉菌(尸./// ">^) YES-2CGMCCNo. 2012专用液体培养基的配方为麦芽糖(C源)20-40g(优选为30g)， 酵母(N源)5-7g (优选为6. 12g)， K異0.5-2g (优选为lg)， MgS04 0. 1-lg (优 选为0. 5g)，KCl 0. 1-lg(优选为0. 5g)，FeS040. 001-0. 05g(优选为0. 01g)，ZnS04 7H20 5-20mg (优选为lOmg)，用水定容至1L， pH6 —7。
为提高菌体的生长速率，可对该菌进行振荡培养，振速优选为120-180rpm。
所述培养时间一般为120-180h。
为获得更高的生长速率，所述淡紫拟青霉菌(尸./Z/"c/m^) YES-2 CGMCC No. 2012 的培养方法还包括在接种前对菌种进行试管活化培养的步骤，方法可为将淡紫拟青 霉菌(尸./Z/admtf) YES-2CGMCCNo.2012接种在马铃薯琼脂培养基上，在25-27。C下培 养，得到经活化的淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/"us) YES-2 CGMCC No. 2012;所述马铃薯琼 脂培养基配方为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L， pH6-7左右。
所述淡紫拟青霉菌(尸.YES-2 CGMCC No. 2012的试管活化培养时间可为 72—96h。
本发明的第三个目的是提供一种淡紫拟青霉菌(尸./^c/m^) YES-2 CGMCC No. 2012 菌剂。
本发明所提供的淡紫拟青霉菌(P.///ac/"ws) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂，其活性 成分为淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/mtf) YES-2 CGMCC No. 2012。
为获得更好的稳定性，所述菌剂可采用微球剂型，其原料配方可包含以下组分(每
lOOg):
海藻酸钠 l-4g， 硅藻土 8-15g， 淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012 1-10g，
水 加水至100g。
为了使菌剂的性能更加完备，上述菌剂中还可以包括l-3g的氯化钙 较优选的微球剂型的淡紫拟青霉菌(尸./^dm^) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂的原 料配方可以是两种情况，第一种为
海藻酸钠 l-4g， 硅藻土 10-14g，
淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/"^) YES-2 CGMCC No. 2012 5-10g，
水 72 —84g，
氯化钙 l-2g。
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉菌YES-2和水的重量相加应该等于100g。
第二种情况是
海藻酸钠 l-3g，
硅藻土 12-15g，
淡紫拟青霉菌(尸./^c/"us) YES-2 CGMCC No. 2012 1-5g，
水 77—86g，
氯化钙 1-2.5g。
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉菌YES-2和水的重量相加应该等于100g。
上述微球剂型淡紫拟青霉菌(尸.Z/toc/"^) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂的原料配方 中的水优选为无菌水或蒸馏水。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述微球剂型的淡紫拟青霉菌(尸.///""'"^) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂的方法。
本发明所提供的制备方法，可包括以下步骤
1) 按下述原料配方取料海藻酸钠l-4g，硅藻土 8-15g，淡紫拟青霉菌 (尸.脇d騰)YES-2 CGMCC No. 2012 l-10g，水71 — 90g，氯化,丐1-3g;其中，海藻
酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉菌YES-2和水的重量相加应该等于100g;
2) 微球海藻酸钠凝胶液的配制将海藻酸钠与无菌水混合，在40-6(TC下加热 并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却，备用；
3) 将淡紫拟青霉菌YES-2和硅藻土加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中， 混匀；
4) 配制CaCl2溶液用水配制摩尔浓度为0. 1-0. 3M的氯化钙溶液，备用；
5) 将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉菌YES-2的混合溶液加入容器内， 在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCL 溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6) 将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌，然后将海藻酸钙微球滤出，冲洗， 干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉菌YES-2菌剂。
在上述淡紫拟青霉菌YES-2菌剂的制备方法中，步骤1)中的原料配方优选为(每 100g):海藻酸钠1-4g，硅藻土 10-14g，淡紫拟青霉菌YES-2 5-10g，加水至100g，
再滴注入氯化钙1-2g;或者为海藻酸钠1-3g，硅藻土 12-15g，淡紫拟青霉菌YES-2
l-5g，加水至100g，再滴注入氯化钙1-2. 5g。
步骤2)中最好将海藻酸钠水溶液冷却至3(TC以下。
步骤3)中的淡紫拟青霉菌YES-2可为其菌丝体及其孢子的混合物。
步骤6)中的淬水搅拌时间可为30-60分钟；可用无菌水对海藻酸铐微球进行清
洗；所述干燥方法可为真空干燥或阴干。
上述微球剂型淡紫拟青霉菌YES-2菌剂制备方法中所用的水优选为无菌水或蒸馏水。
本发明提供了一株对植物寄生线虫一根结线虫具有较高杀虫活性的根结线虫真 菌寄生菌株淡紫拟青霉菌(尸.W"c/mw) YES-2 CGMCC No.2012及其菌剂。该菌剂是以 高分子材料海藻酸钠为基本骨架，以淡紫拟青霉菌(尸.///^/"^) YES-2CGMCCNo.2012 的菌丝体、孢子混合物为活性成分，以硅藻土为载体，根据海藻酸钠与多价阳离子形 成凝胶的特性，采用海藻酸钠一氯化钙反应的方法，制备而成的具有缓施作用的杀线 虫生物菌剂。实验证明，该菌剂具有较好的杀线虫功效，防治率可达50—60%，且较 为稳定，无有毒的化学残留物(无毒、无残留)，不污染农产品和环境(不与环境中 的其它物质反应)，性价比高和施用方便的特点。本发明将在植物根结线虫病害的防 治中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为以淡紫拟青霉菌(PJ/Zadm/s) YES-2 CGMCC No. 2012为活性成分的微球型 生防菌剂的形态图
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度如无特别说 明均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1、淡紫拟青霉菌(尸./// "> ) YES-2 CGMCC No. 2012的分离及保藏 采集云南峨山塔甸烟草根结线虫病根，用自来水冲洗病根3 — 5分钟以除去土壤， 然后将病根放在解剖镜下，用小镊子挑出卵囊，用1%次氯酸钠处理卵囊1分钟以对 卵囊表面消毒和释放线虫卵，将次氯酸钠卵悬液分别过200 j^m和30pm网筛，用灭菌 蒸馏水冲洗3遍以除去次氯酸钠，大约每100个卵涂布在PDA平板上，每天观察菌落 出现情况。最终自烟草根结线虫卵上分离得到一株杀线虫真菌菌株，命名为YES-2， 已于2007年4月20日保藏于位于中国北京朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 2012。经鉴定，该菌株为淡紫拟青霉
菌，具有以下特征菌落毡状，表面初为白色，产孢时变为葡萄酒红色，并且产孢量
越多，颜色越深，背面呈白色或酒红色。该菌株在麦芽汁培养基(MEA)上生长较快， 在PDA培养基上也可生长。培养l周后开始产孢，其分生孢子梗直立，孢梗上轮生排 列2-4个瓶梗，顶端串生分生孢子。分生孢子呈椭球或纺锤形，外壁光滑，大小为 (2.0-3.0) X (1.5-2.2) pm。该菌株生长的温度范围为8-38°C，最佳为25-30°C。 该菌株在pH 2-ll之间均可以生长，适宜pH值为5-9。
实施例2、淡紫拟青霉菌(尸.///^/"^) YES-2 CGMCC No. 2012的培养及其菌剂的
制备
一、 淡紫拟青霉菌(尸.似ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012的培养
1、 试管种培养
马铃薯琼脂培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L， pH
6-7。
将淡紫拟青霉菌YES-2接种在试管中的马铃薯琼脂培养基上，在25'C下培养 72-96h，得到经活化的淡紫拟青霉菌YES-2。
2、 扩大培养
淡紫拟青霉菌(尸.似ac/mw) YES-2CGMCCNo.2012专用液体培养基配方麦芽糖 (C源)30g，酵母(N源)6. 12g， K2HP04lg， MgS040.5g， KC1 0. 5g， FeS040 . 01g， ZnS04 7H20 10mg，用水定容至1L， pH6-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉菌YES-2接种到淡紫拟青霉菌YES-2专用液体培养 基中，在25。C、 150rpm下培养120h，淡紫拟青霉菌YES-2得到扩大培养。
二、 淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012微球型菌剂的制备 用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012
菌剂，具体制备方法包括以下步骤
1) 称取原料海藻酸钠20kg，硅藻土 100kg,淡紫拟青霉菌(尸丄7ac/"us) YES-2 CGMCC No. 2012 (菌丝体及其孢子的混合物)10kg，无菌水870kg，氯化钙22kg;
2) 微球海藻酸钠凝胶液的配制将海藻酸钠与无菌水混合，在4(TC下加热并不 断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约3(TC，备用；
3) 将淡紫拟青霉菌(尸.Wac/"Ry) YES-2 CGMCC No. 2012液体培养物过滤收集后 匀浆打碎，离心收集后和硅藻土共同加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，充分 搅拌混匀，备用；
4) 配制CaCl2溶液用无菌水配制摩尔浓度为0. 2M的氯化钙溶液，备用；
5) 将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉菌YES-2的混合溶液加入密闭耐压 容器内加压滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2溶液 中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6) 将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌60分钟后，滤出微球，用无菌水冲 洗3次，将微球在真空条件下干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉菌YES-2菌剂。形态 如图1所示，单粒微球重0.022-0. 024克，直径4.8土0.2mm，经检测，淡紫拟青霉菌 YES-2的CFU/g为107-108。
实施例3、淡紫拟青霉菌(P./Z/fldm^) YES-2 CGMCC No. 2012的培养及其菌剂的
制备
一、 淡紫拟青霉菌YES-2的培养
1、 试管种培养
马铃薯琼脂培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L， p朋-7。 将淡紫拟青霉菌YES-2接种到试管中的马铃薯琼脂培养基上，在25'C下培养72h， 得到经活化的淡紫拟青霉菌YES-2。
2、 扩大培养
淡紫拟青霉菌YES-2专用液体培养基配方麦芽糖20g，酵母5g， K2HP040.5g， MgS04 0. lg， KC1 0. lg， FeS04 0. OOlg， ZnS04 7H20 5mg，用水定容至1L， p朋-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉菌YES-2接种到淡紫拟青霉菌YES-2专用液体培养 基中，在26。C、 180rpm下培养150h，淡紫拟青霉菌YES-2得到扩大培养。二、 淡紫拟青霉菌(尸./z7ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012微球型菌剂的制备 用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉菌YES-2菌剂，具体制备方法包括以下
步骤
1) 称取原料海藻酸钠10kg，硅藻土 150kg，淡紫拟青霉菌YES-2 (菌丝体及 其孢子的混合物)20kg，氯化钙llkg，无菌水820kg;
2) 微球海藻酸钠凝胶液的配制将海藻酸钠与无菌水混合，在50'C下加热并不 断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约3(TC，备用；
3) 将淡紫拟青霉菌YES-2匀浆打碎，离心收集后和硅藻土共同加入到步骤2) 配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4) 配制CaCl2溶液用无菌水配制摩尔浓度为0.1M的氯化钙溶液，备用；
5) 将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉菌YES-2的混合溶液加入密闭耐压 容器内在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制
的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌30分钟，然后将海藻酸钙微球滤出， 用无菌水冲洗2次，滤出微球真空干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉菌(P.///flC/m ) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂。菌剂形态与实施例1制备的菌剂相同，单粒微球重 0.032-0.034克，直径4. 5土0. 3mm，经检测，淡紫拟青霉菌(尸.編"'画)YES-2 CGMCC No. 2012的CFU/g为107-108。
实施例4、淡紫拟青霉菌(尸.〃/ac/"w) YES-2 CGMCC No. 2012的培养及其菌剂的
制备
一、 淡紫拟青霉菌YES-2的培养
1、 试管种培养
马铃薯琼脂培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至IL， p朋-7。
将淡紫拟青霉菌YES-2接种在试管中的马铃薯琼脂培养基上，在28'C下培养72h， 得到经活化的淡紫拟青霉菌YES-2。
2、 扩大培养
淡紫拟青霉菌YES-2 CGMCC专用液体培养基配方麦芽糖40g，酵母7g， K2HP04 2g， MgS(Ug， KC1 lg， FeS04 0 . 05g， ZnS04 7H20 20mg，用水定容至1L， p朋-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉菌YES-2接种到淡紫拟青霉菌YES-2专用液体培养 基中，在23。C、 120rpm下培养180h，淡紫拟青霉菌YES-2得到扩大培养。
二、 淡紫拟青霉菌YES-2微球型菌剂的制备
用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉菌YES-2菌剂，具体制备方法包括以下 步骤
1) 称取原料海藻酸钠20kg，硅藻土 80kg，淡紫拟青霉菌(尸."toc/mtf) YES-2 CGMCC No. 2012 (菌丝体及其孢子的混合物)30kg，氯化钙33kg，无菌水870kg;
2) 微球海藻酸钠凝胶液的配制将海藻酸钠与无菌水混合，在6(TC下加热并不 断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30'C，备用；
3) 将淡紫拟青霉菌(尸.似ac/"M) YES-2 CGMCC No. 2012匀浆打碎，离心收集后 和硅藻土共同加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4) 配制CaCl2溶液用无菌水配制摩尔浓度为0. 3M的氯化钙溶液，备用；
5) 将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉菌YES-2的混合溶液加入密闭耐压 容器内在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制 的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化l丐溶液反应后，生成海藻酸钙微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌45分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用 无菌水冲洗4次，滤出后阴干，得到微球剂型的淡紫拟青霉菌(尸./^c/m^)YES-2 CGMCC No.2012菌剂。菌剂形态与实施例1制备的菌剂相同，单粒微球重0. 018-0. 020克， 直径4. 7土0. 2mm，经检测，淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/"^) YES-2 CGMCC No. 2012的CFU/g 为107-108。
实施例5、淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012的培养及其菌剂的
制备
一、 淡紫拟青霉菌YES-2的培养
1、 试管种培养
马铃薯琼脂培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L， p朋-7。 将淡紫拟青霉菌YES-2接种在试管中的马铃薯琼脂培养基上，在25'C下培养96h， 得到经活化的淡紫拟青霉菌YES-2 。
2、 扩大培养
淡紫拟青霉菌YES-2专用液体培养基配方麦芽糖25g，酵母6. 5g， K2HP041. 5g， MgS04 0.8g， KC1 0.4g， FeS04 0. 03g， ZnS04 7H20 10mg，用水定容至1L， pH6-7。
将步骤一经活化的淡紫拟青霉菌YES-2接种到淡紫拟青霉菌YES-2专用液体培养 基中，在25。C、 150rpm下培养120h，淡紫拟青霉菌YES-2得到扩大培养。
二、 淡紫拟青霉菌YES-2微球型菌剂的制备
用以下方法制备本发明微球型淡紫拟青霉菌YES-2菌剂，具体制备方法包括以下 步骤
1) 称取原料海藻酸钠25kg，硅藻土 120kg，淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012 (菌丝体及其孢子的混合物)25kg，氯化钙llkg，无菌水830kg;
2) 微球海藻酸钠凝胶液的配制将海藻酸钠与无菌水混合，在45"C下加热并不 断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约3(TC，备用；
3) 将淡紫拟青霉菌YES-2匀浆打碎，离心收集后和硅藻土共同加入到步骤2) 配制的海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混匀，备用；
4) 配制CaCl2溶液用无菌水配制摩尔浓度为0. 1M的氯化钙溶液，备用；
5) 将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉菌YES-2的混合溶液加入密闭耐压 容器内在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制 的CaCl2溶液中，海藻酸钠微球与氯化转溶液反应后，生成海藻酸转微球；
6)将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌50分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用 无菌水冲洗4次，过滤后阴干，得到微球剂型的淡紫拟青霉菌YES-2菌剂。菌剂形态
与实施例1制备的菌剂相同，单粒微球重0. 026-0. 028克，直径4. 6土0. 2mm,经检测， 淡紫拟青霉菌(尸./z7ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012的CFU/g为107-108。
实施例6、淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)YES-2 CGMCC No. 2012菌剂的生防效果检
测
用下述实验检测实施例2制备的微球剂型的淡紫拟青霉菌(P./Z/flc/m^) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂对根结线虫(以黄瓜根结线虫为例)的防治效果，实验方法如下:
选择根结线虫病发病严重的北京市门头沟碧琨种植中心蔬菜温室大棚为大棚，种 植作物为黄瓜，品种为"黛安娜"迷你型小黄瓜。实验小区面积为20平方米，每处 理三次重复，小区排列为随机排列法。在黄瓜苗移栽时，将供试药剂采用穴施的方法， 施于作物根下，实验期间按常规管理，时间为9月中旬-次年1月下旬。供试药剂如 下
处理l:空白对照(不施药)， 处理2:本发明生物杀线虫微球菌剂2kg/亩， 处理3:本发明生物杀线虫微球菌剂4kg/亩， 处理4:本发明生物杀线虫微球菌剂8kg/亩，
在作物收获后，挖出每处理黄瓜根，按照根结线虫分级调査指标进行调查，具体
如下0级=没有根结，1级1-10%的根上有根结，2级11-20%， 3级21-30%， 4级 31-40% ， 5级41-50%， 6级51-60%， 7级61-70%， 8级71-80%， 9级81-90%， 10级91-100%。
防治效果计算公式为防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数。 其中，实施例实验结果如表1所示，可以看出，使用本发明的淡紫拟青霉菌(尸.///^/"^) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂后对根结线虫都有不同程度的防效，与空白对照相比能够 显著降低根结线虫危害，且防治效果随施用量的增加而不断提高。
表1本发明淡紫拟青霉菌YES-2菌剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
病情指数防治效果
处理l (对照)74. 13—
实施例2处理262. 1716. 13
实施例2处理354. 3326.71
实施例2处理434. 6753. 23
实施例2处理519. 3373. 92
按照上述方法利用实施例3-_5所获得的菌剂进行试验，得到的效果与实施例2所获
得的菌剂一致。
权利要求
1、一株淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)YES-2，其生物保藏号为CGMCC NO.2012。
2、 一种培养权利要求1所述的淡紫拟青霉菌(尸力/ac/mw) YES-2CGMCCNo.2012 的方法，是将淡紫拟青霉菌(P.///ac/"w) YES-2 CGMCC No. 2012接种到淡紫拟青霉菌(尸./z7ac/m^) YES-2 CGMCC No. 2012专用液体培养基中，在25-30。C下培养，淡紫拟 青霉菌(P./z7ac/"w5) YES-2 CGMCC No. 2012得到扩大培养；所述淡紫拟青霉菌(尸./Z/flc/m^) YES-2 CGMCC No. 2012专用液体培养基的配方为麦芽糖20-40g，酵 母5-7g， K2HP040. 5-2g， MgS040. l-lg， KCl 0. 1-lg， FeS040. 001-0. 05g， ZnS04 7H20 5-20mg，用水定容至1L， p朋-7。
3、 根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述培养过程中进行振荡， 振速为120-180rpm;培养时间为120-180h;接种前，先对淡紫拟青霉菌(P.//toc/m ) YES-2 CGMCC No. 2012菌种进行试管活化培养，方法为将淡紫拟青霉菌(,///ac/m ) YES-2 CGMCC No. 2012接种在马铃薯琼脂培养基上，在25-3(TC下培养，得到经活化 的淡紫拟青霉菌(尸.Wac/mtf) YES-2 CGMCC No. 2012;所述马铃薯琼脂培养基的配方 为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂16g，用水定容至1L， p朋-7。
4、 一种淡紫拟青霉菌(尸./^c/m^) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂，其活性成分为 权利要求1所述的淡紫拟青霉菌(尸力7flc!'mw) YES-2 CGMCC No. 2012。
5、 根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于所述菌剂为微球剂型，其原料配 方包含以下组分海藻酸钠 l-4g， 硅藻土 8-15g，淡紫拟青霉菌(尸.Wac/"w) YES-2 CGMCC No. 2012 1-10g，水 加水至100g。
6、 根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中还包括1-3g的氯化钙 的原料配方包含以下组分
7、 根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于所述菌剂的原料由以下组分组成:海藻酸钠 l-4g， 硅藻土 10-14g，淡紫拟青霉菌(尸./Z/fl"'m^) YES-2 CGMCC No. 2012 5-10g，水 72 —84g，氯化钙 l-2g。
其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉菌YES-2和水的重量相加应该等于100g。
8、根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于所述菌剂的原料由以下组分组成:海藻酸钠 l-3g，硅藻土 12-15g，淡紫拟青霉菌(尸.Wac/"w) YES-2 CGMCC No. 2012 l-5g，水 77 — 86g，氯化钙 1-2.5g。其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉菌YES-2和水的重量相加应该等于100g
9、 一种制备权利要求6所述的淡紫拟青霉菌(尸./Z/ac!'w^) YES-2CGMCCNo.2012 菌剂的方法，包括以下步骤1) 按下述原料配方取料海藻酸钠1-4g，硅藻土 8-15g，淡紫拟青霉菌 (尸.肠c/,) YES-2 CGMCC No. 2012 l-10g，水71—90g，氯化牵丐l-3g;其中，海藻酸钠、硅藻土、淡紫拟青霉菌YES-2和水的重量相加应该等于100g;2) 微球海藻酸钠凝胶液的配制将海藻酸钠与无菌水混合，在40-6(TC下加热 并不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却，备用；3) 将淡紫拟青霉菌YES-2和硅藻土加入到步骤2)配制的海藻酸钠水溶液中， 混匀；4) 配制CaCl2溶液用水配制摩尔浓度为O. 1-0.3M的氯化钙溶液，备用；5) 将步骤3)获得的海藻酸钠及淡紫拟青霉菌YES-2的混合溶液加入容器内， 在恒定液压条件下滴注，将滴注形成的海藻酸钠微球乳胶液落入步骤4)配制的CaCl2 溶液中，海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球；6) 将步骤5)得到的海藻酸钙微球淬水搅拌，然后将海藻酸钙微球滤出，冲洗， 干燥，得到微球剂型的淡紫拟青霉菌YES-2菌剂。
10、 权利要求4一8中任意一项所述的淡紫拟青霉菌(尸./Z/flc/mtf) YES-2 CGMCC No. 2012菌剂在防治植物根结线虫病害中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)YES-2 CGMCC No.2012及其菌剂与应用。该菌剂是以高分子材料海藻酸钠为基本骨架，以淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)YES-2CGMCC No.2012的菌丝体、孢子混合物为活性成分，以硅藻土为载体，根据海藻酸钠与多价阳离子形成凝胶的特性，采用海藻酸钠—氯化钙反应的方法，制备而成的具有缓施作用的杀线虫生物菌剂。实验证明，该菌剂具有较好的杀线虫功效，防治率可达50-60％，且较为稳定，无有毒的化学残留物(无毒、无残留)，不污染农产品和环境(不与环境中的其它物质反应)，性价比高和施用方便的特点。本发明将在植物根结线虫病害的防治中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A01P5/00GK101100646SQ200710117818
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月25日 优先权日2007年6月25日
发明者刘杏忠, 段维军 申请人:中国科学院微生物研究所