用于培育糖度提高的植物体的组合物及其用途的制作方法

专利名称：用于培育糖度提高的植物体的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有调节细胞内氧化还原状态的物质且用于培育糖度提 高的植物体的组合物及其用途。
背景技术：
通常，水果类、蔬菜类和谷物类等植物中含有糖分。糖分的量用糖 度表示，根据植物的种类，所述糖度对商品的价值产生影响。因此，近 年来正在开展用于提高植物的糖度的技术开发。
例如，高糖度番茄主要由土地耕种生产。还提出了由培养液栽培来 生产高糖度番茄的技术(专利文献1 )。
另一方面，人们认识到，谷胱甘肽等调节细胞内氧化还原状态的物
质，能够作为细胞或器官的分化调节剂发挥作用(专利文献2)。还认识
到谷胱甘肽能够作为植物生长调整辅助剂发挥作用(专利文献3 )。
专利文献1:日本国公开专利公报《特开平10-271924号公报(公开
日1998年10月13日)》
专利文献2:国际公开W0 01/080638 (
公开日2003年7月22日) 专利文献3:日本国公开专利公报《特开2004-352679号公报(公开
日2004年12月16日)》

发明内容
然而，上述以往的植物的提高糖度的技术并不简便。能够由土地耕 种生产高糖度番茄的人仅限于部分专业技术人员。另外，由培养液栽培 生产高糖度番茄，在栽培管理上需要特殊的技术以及特殊的生产装置。
因此，本发明是鉴于上述情况而做出的，本发明的目的是提供用于 简便地培育糖度提高的植物的组合物及使用该组合物的技术。本发明人为了解决上述课题进行了认真的研讨，得到的成果是，发 现当用添加了调节细胞内氧化还原状态的物质的培养基(含有土壤及土 壤改良剂)培育植物体，或者对植物体直接涂布、喷雾所述调节细胞内 氧化还原状态的物质时，该植物体的糖度将有所提高。本发明是基于此 全新的发现而做出的，包含以下的发明。
本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的组合物的特征在于，含 有调节细胞内氧化还原状态的物质(但过氧化氢除外)。
本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的组合物中，所述调节细
胞内氧化还原状态的物质较优选为谷胱甘肽、编码Y-谷氨酰半胱氨酸合 成酶的多核苷酸或编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶 的多核苷酸。
再有，本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的组合物中，所述 调节细胞内氧化还原状态的物质较优选为氧化型谷胱甘肽。
另外，本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的试剂盒的特征在 于，所述试剂盒具有调节细胞内氧化还原状态的物质(但过氧化氢除外)。
另外，本发明涉及的糖度提高的植物体的培育方法的特征在于，所 述方法含有使用调节细胞内氧化还原状态的物质(但过氧化氢除外)栽 培植物体的工序。
另外，由本发明涉及的培育方法得到的植物体也是本发明的范畴。
本发明其它的目的、特征、以及优点通过以下示出的内容将被充分 的理解。另外，本发明的优点通过下述参照附图的说明将变得显而易见。


图1示出了实施方案2中得到的番茄果实的糖度测定结果； 图2示出了 AN0VA解析图1中示出的糖度测定结果的结果； 图3示出了从GSSG或GSH的处理日起经过的天数与糖度的关系的经 证实的结果；
图4示出了 35S-GSH1的淀粉及葡萄糖的测定结果； 图5示出了实施方案8中得到的櫻桃果实的糖度测定结果；图6示出了实施方案9中得到的温州蜜柑果实的糖度测定结果； 图7示出了实施方案10中得到的草莓果实的糖度测定结果； 图8示出了实施方案11中得到的甜玉米果实的糖度测定结果； 图9示出了序列号15-36的基因系统树。
具体实施例方式
<1.本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的组合物〉
本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的组合物(以下称"本发 明涉及的组合物")只要含有调节细胞内氧化还原状态的物质即可。
使用本发明涉及的组合物能够简便地培育糖度提高的植物体。例如， 令培养基中包含本发明涉及的组合物，可用该培养基培育植物体。另夕卜， 如下所述，调节细胞内氧化还原状态的物质为多核苷酸的情况下,可以 仅仅使用已知的转化技术将所述多核苷酸导入植物中来栽培该植物。因 此，与上述土地耕种等现有技术相比，不需要熟练的技能、特殊的技术、 特殊的生产装置等，能够极为简便地得到糖度提高的植物。
这种将调节细胞内氧化还原状态的物质用于培育糖度提高的植物的 用途，是与现有的该物质的用途完全不同的新用途。另外，这种能够得 到糖度提高的植物的效果，根据现有的用途是完全不能够预测的。因此 本发明是由本发明人基于全新的发现而得到的。
本说明书中，所谓"糖度提高的植物体"，意为与该植物体的野生植 抹相比糖度提高的植物体。换言之，糖度提高的植物体与野生植抹相比 具有高糖度。即，本发明涉及的组合物也可以说是一种用于培育具有与 野生植林相比高糖度的植物体的组合物。例如，使用本发明涉及的组合 物栽培植物体，与不使用本发明涉及的组合物进行栽培的情况相比，能 够提高该植物体的糖度。对糖度使用已知的方法进行测定即可，也可以 像本实施方案一样使用已知的糖度计。
本说明书中，所谓"调节细胞内氧化还原状态的物质"，意为调节与 细胞内的氧化还原相关的物质的氧化和还原的物质，包含使下述量表示 的值发生变化的物质，例如活性氧的生成容易度，谷胱甘肽的绝对量，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比，烟酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸的
还原型(NAD(P)H)的绝对量，NADPH/NADP的比，细胞色素c的氧化型/ 还原型的比，质体醌、泛醌等电子传递链的构成要素的氧化/还原比。并 且，与细胞内进行的氧化还原相关的物质是该技术领域中已知的，并不 限定于此。另外，使上述值发生变化的物质，可例示出对谷胱甘肽的合 成或谷胱甘肽的量有影响的物质、促进或阻碍活性氧的生成的物质、促 进或阻碍某种化合物向氧化型和还原型中的任意一种转变的物质。
本发明涉及的组合物中含有的调节细胞内氧化还原状态的物质，并 不仅限于上述意思中包含的物质，但优选例示出对谷胱甘肽的合成或谷 胱甘肽的量有影响的物质。当采用这些物质时，能够得到较高糖度的植 物。
另外，本说明书中，所谓"对谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽的量有影 响的物质"，意为使细胞内的谷胱甘肽的量发生变化的物质，优选使谷胱 甘肽增加的物质，例如可举出谷胱甘肽本身、谷胱甘肽合成酶、编码该 酶的多核苷酸等。
另外，作为调节细胞内氧化还原状态的物质，可分为能够通过与植 物接触从而被植物吸收的物质和导入植物基因组中的物质。当然，这两 种物质可以单独使用，也可以并用。
作为对谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽的量有影响、并且能够在与植物 接触后被植物吸收的物质的具体实例，可例示出谷胱甘肽、谷胱甘肽结 合物、活性氧(例如过氧化氢等)、活性氮、多胺、二氧化钛、茉莉酸、 水杨酸、半胱氨酸、胱氨酸、重金属镉、铁离子。并且，多胺成为过氧 化氢的原料。二氧化钛在光照下生成活性氧。半胱氨酸、胱氨酸是谷胱 甘肽的前体。重金属镉和铁离子优选过量添加。另外，此处例示出的物 质中优选谷胱甘肽。另外，对于谷胱甘肽，存在还原型谷胱甘肽(下称 "GSH")及氧化型谷胱甘肽(下称"GSSG，，)，但本发明涉及的组合物中含 有的谷胱甘肽较优选为GSSG。为GSSG时，正如下述实施方案所示，能够 得到较高糖度的植物。另外，能够增加果实数量，使果实更为肥硕。
另外，作为对谷胱甘肽的合成或谷胱甘肽的量有影响、且导入植物基因组中的物质的具体实例，可优选例示出，例如y -谷氨酰半胱氨酸合 成酶、编码y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸(下称"GSH1基因")、 谷胱甘肽结合性质体型果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶、编码谷胱甘肽结合性 质体型果糖-1， 6-二磷酸醛缩酶的多核苷酸(下称"FBA基因")。
对GSH1基因的具体实例并没有特别的限定，已知例如百日草 (Genbank accession: AB158510 )、稻(Genbank access ion: AJ508915 )、 烟草(Genbank accession: DQ"WM)等，这些基因也能够适用于本发 明。与拟南芥相同，这些基因的翻译产物也在N端区域具有叶绿体转运 信号肽。
但是，在本发明中，可以优选例示出以下(a) - (d): (a )编码由序列号1或3示出的氨基S吏序列构成的多肽的多核苷酸； (b )编码由一个氨基酸序列构成的、具有y -谷氨酰半胱氨酸合成酶 活性的多肽的多核香酸，所述氨基酸序列是通过在序列号1或3示出的 氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或多个氨基酸而得到的； (c )由序列号2或4示出的碱基序列构成的多核苷酸；
(d) 与由和上述(a) - (c)的多核苷酸中的任意一种多核苷酸互补 的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的多核苷酸。
并且，序列号2示出了一个碱基序列的实例，所述碱基序列编码由 序列号1示出的氨基酸序列构成的多肽；序列号4示出了一个碱基序列 的实例，所述碱基序列编码由序列号3示出的氨基S臾序列构成的多肽。
对FBA基因的具体实例并没有特别的限定，但优选例示出以下的(e )
(e) 编码由序列号5、 6及15-36的任意一个示出的氨基酸序列构成 的蛋白质的多核苷酸；
(f )编码由一个氨基酸序列构成的、具有谷胱甘肽结合性质体型果 糖-1, 6-二磷酸醛缩酶活性的蛋白质的多核苷酸，所述氨基酸序列是通 过在序列号5、 6及15-36的任意一个示出的氨基酸序列中缺失、置换或 添加1个或多个氨基酸而得到的；
(g )由序列号7及37-56示出的碱基序列构成的多核苷酸；(h)与由和上述(e) -(g)的多核苷酸中的任意一种多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
序列号8示出了由序列号5示出的氨基酸序列构成的蛋白质的cDNA序列。在序列号8示出的碱基序列中，第145位-第147位为起始密码子，第1318位-第1320位为终止密码子。即是说，拟南芥FBA1基因具有序列号8示出的碱基序列中的第145位-第1320位作为开放阅读框架(ORF )。
序列号9示出了编码由序列号6示出的氨基酸序列构成的蛋白质的碱基序列的一个实例。在序列号9中，第104位-第1300位是由序列号6示出的氨基酸序列构成的蛋白质的编码区。并且，在序列号6中，从第1位的蛋氨酸至第48位的丙氨酸构成的肽是叶绿体转运肽。
序列号7示出的碱基序列为拟南芥FBA1基因的ORF的碱基序列。并且，作为与拟南芥FBA1基因的碱基序列同源的基因，可举出在稻的基因组中发现的基因(dbjlBAB55475. 1 )。
另外，序列号37-56分别作为编码序列号15-34示出的氨基酸序列的DNA序列的一个实例。
另外，图9示出了序列号15-36示出的氨基S复序列的系统树，仅供参考。
另外，本领域技术人员能够容易地理解，在所述序列号示出的氨基酸序列或DNA序列含相当于叶绿体转运信号的区域的情况下，该区域可以置换为其它蛋白质的叶绿体转运信号。
这里所谓"缺失、置换或添加1个或多个氨基酸"，意为通过位点特异性突变诱导方法等已知的变异肽的制造方法，缺失、置换或添加可以缺失、置换或添加的数量的氨基酸(优选IO个以下，较优选7个以下，更优选5个以下)。这样的变异蛋白质并不限定于通过已知的变异多肽的制造方法从而具有人工导入的变异的蛋白质，也可以是天然存在的蛋白质经提纯精制后得到的。
在本领域中众所周知的是，可以容易地改变蛋白质的氨基酸序列中的几个氨基酸而对该蛋白质的构造或功能不产生实质影响。另外，不仅仅是人工令其发生改变，在天然蛋白质中存在不使该蛋白质的构造或功能发生实质变化的变异体，也是众所周知的。
优选的变异体具有保守性或非保守性氨基酸置换、缺失、或添加。优选沉默置换、添加和缺失，特别优选保守性置换。这些突变不会使本发明涉及的多肽活性发生变化。
可考虑的代表性的保守性置换有在脂肪族氨基酸Ala、 Val、 Leu、和lie中的一个氨基酸置换为该范围内的其它的氨基酸、羟基残基氨基酸Ser和Thr的交换、酸性残基氨基酸Asp和Glu的交换、酰胺基残基氨基酸Asn和Gln之间的置换、碱性残基氨基酸Lys和Arg的交换、以及芳香族残基氨基酸Phe、 Tyr之间的置换。
本发明书中，所谓"严格的条件"，意为仅当序列间存在至少90%的一致性，优选至少95%的一致性，最优选至少97°/。的一致性时才发生杂交。具体而言，例如，可以举出在杂交溶液(含有50%甲酰胺、5xSSC(150mM的NaCl、 15mM的枸橼酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7. 6 )、 5xDenhardt，s溶液、10%硫酸葡聚糖、及20ug/ml的经变性并剪断的鲑鱼精子DNA )中在42。C下培养一夜后，在约65。C下在0. 1 x SSC中洗净过滤器这样的条件。杂交可使用如在Sambrook等所著，冷泉港实验室出版社于2001年出版的《分子克隆实验室手册》第三版(Molecular Cloning, A LaboratoryManual, 3rd Ed" Cold Spring Harbor Laboratory (2001))中所述的方法那样的众所周知的方法进行。通常，温度越高，盐浓度越低，则严格度越高(进行杂交越困难)，能够得到同源性越高的多核苷酸。
在本发明组合物中包含上述多核苷酸的情况下，本发明组合物也可含有具有该多核苷酸的表达型载体。表达型载体的构建方法可使用已知
的方法，对此没有特别的限定。
表达型载体的母体的载体，可以4吏用已知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体、或科斯质粒等，可根据导入的植物细胞或导入方法进4亍适当的选l奪。具体而言，例如，可举出pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、 pBluescriptSK、 pBI系的载体等。特别是，在4吏用本发明涉及的组合物，将具有上述多核普酸的载体通过农杆菌法导入植物体的情况下，优选使用pBI系的双元载体。具体而言，作为pBI系的双元载体，例如可举出pBIG、 pBIN19、 pBI101、 pBI121、 pBI221等。
上述启动子只要是能够在植物体内实现基因表达的启动子，对其就没有特别的限定，已知的启动子是适于使用的。这样的启动子，例如可举出花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、 Actin启动子、胭脂碱合成酶的启动子、烟草的PRla基因启动子、番茄的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基启动子等。其中，可较优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子或Ac Un启动子。当将用上述各种启动子得到的表达型载体导入植物细胞内时，能够使其强烈地表达任意的基因。
上述的启动子，只要连结并导入载体内从而能够将编码了转录因子的基因表达出来即可，对于表达型载体的具体构造没有特别的限定。
上述表达型载体除了含有上述启动子及上述多核苷酸，还可进一步含有DNA片段。对所述其它的DNA片段没有特别的限定，但可举出终止子、选择性标记基因、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。另夕卜，上述表达型载体也可进一步具有T-DNA区。特别是当使用农杆菌将上述表达型载体导入植物体内时，T-DNA区能够提高基因导入效率。
终止子只要具有作为转录终止位点的功能，对其就没有特别的限定，可以是已知的终止子。例如，具体而言，可以优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止位点(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止位点(CaMV35S终止子)等。其中可以较优选Nos终止子。在上述表达型载体中，通过将终止子设置在适当的位点，能够防止在导入植物细胞后合成不必要的长转录物以及强效的启动子使质粒的复制数目减少之类的现象的发生。
上述的选择性标记基因，可使用例如耐药性基因。作为这样的耐药性基因的具体的一个实例，可举出例如对潮霉素、博莱霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的耐药性基因。因此，通过选择在含有上述抗生素的培养基中培育的植物体，能够容易地选出发生转化的植物体。
作为上述用于提高翻译效率的多核苷酸，可举出例如来自烟草花叶病毒的omega序列。通过将该omega序列设置于启动子的非翻译区(5，UTR)，能够提高编码上述转录因子的基因的翻译效率。如此，在上述表达型载体中，为了达到此目的可以含有各种各样的DNA片段。
作为构建表达型载体的具体方法，可以举出如下方法在作为经适当选择的母体的载体上，将上述启动子和上述多核苷酸，以及根据需要的上述其它的DNA片段按照设定的顺序进行导入。另外，连结上述多核苷酸和启动子(以及根据需要的终止子等)构建表达框，只要将其导入载体即可。在表达框的构建中，例如，将各个DNA片段的切断位点作为互补的突出末端，通过在连接酶作用下发生反应，能够规定该DNA片段的顺序。并且，当表达框中含有终止子时，按下述顺序排列即可从上游开始，启动子、编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的多核苷酸、终止子。另外，对于用于构建表达型载体的试剂，即限制酶及连接酶等的种类也没有特别的限定，适当选择市场上的试剂使用即可。
另外，对上述表达型载体的增殖方法(生产方法)也没有特别的限定，可以使用已知的方法。 一般地，将大肠杆菌作为宿主，只要使其在该大肠杆菌内增殖即可。这时，可根据载体的种类选择适当的大肠杆菌的种类。
以上例示出的物质可单独-使用，也可2种以上并用。当本发明涉及的组合物中含有的、调节细胞内氧化还原状态的物质，包含能够通过与植物接触被植物吸收的物质时，对它的量没有特别的限定，但优选0. OlmM-20mM，更优选0. lmM-2mM,在此范围内，能够更加揭_高培育的植物的糖度。并且，根据适用的植物的种类、目标糖度值等，其浓度也可作出适当的变化。
本发明涉及的组合物中，在不损害本发明涉及的组合物的作用效果的范围内，也可含有其它成分。例如，当本发明涉及的组合物，作为调节细胞内氧化还原状态的物质，包含能够通过与植物接触被植物吸收的物质时，本发明组合物也可以在水、已知的液体载体等中溶解，以溶液状药剂、乳浊液状药剂、凝胶状药剂等形态提供。作为这样的液体载体，可例示出二曱苯等芳香烃类，乙醇、乙二醇等醇类，丙酮等酮类，二氧杂环乙烷、四氢呋喃等醚类，二甲基曱酰胺，二曱亚砜，乙腈等，但并不限于上述物质。另外，也可以将调节细胞内氧化还原状态的物质承载于固体的载体成分上，作为固体药剂、粉体药剂等。作为这样的固体的载体成分，可以例示出滑石、粘土、蛭石、硅藻土、高岭土、碳酸钙、氢氧化钙、陶土、硅胶等无机物，小麦粉、淀粉等有机物等，但并不限于上述物质。另外，本发明涉及的组合物中，可以适当添加其它的辅助剂。作为这样的辅助剂可举出例如烷基硫酸盐类、烷基磺酸盐、烷芳基磺酸盐、双烷基磺化琥珀酸盐等阴离子表面活性剂，高级脂肪胺的盐类等阳离子表面活性剂，聚乙二醇烷基醚、聚乙二醇酰基酯、聚乙二醇-多元醇酰基酯、纤维素衍生物等非离子表面活性剂，明胶、酪蛋白、阿拉伯胶等增粘剂，增量剂，结合剂等。
对于本发明涉及的组合物的使用方法没有特别的限定。例如，当本发明涉及的组合物，作为调节细胞内氧化还原状态的物质，包含能够通过与植物接触被植物吸收的物质时，当该组合物为溶液状药剂等的情况下，可以使该组合物包含在培育植物时使用的培养基等中，也可以将其散布、滴下、涂布在生长点、芽、叶、茎等植物体的一部分或全体上。并且，本说明书中培育植物时使用的"培养基，，中含有土壤、土壤改良剂。
另外，当本发明涉及的组合物为固体药剂等时，可以使其包含在培育植物时使用的培养基中，在适用于水上栽培的植物时，也可将其放入水中使其緩慢溶解。也可提供溶于水的固体药剂等，在使用时将其溶于水。另外，也可将本发明涉及的组合物与已知的肥料、植物激素等药剂混合后施于一直物。
可以从播种植物种子的时候开始施用本发明涉及的组合物。具体而言，
当对像番茄等在播种后2个月-不到半年的期间能够结果的植物施用本发明涉及的组合物时，可以在播种当天施用，优选播种当天-播种后30天之间，较优选播种当天-60天之间，更优选从播种当天到收获当天，定期的施用是更优选的。在这种情况下，对施用本发明涉及的组合物的间隔没有特别的限定，但一周内优选1次-4次，4交优选2-3次。对施用量没有特别限定，根据植物的种类作出适当的设定即可，例如植物为番茄等时，每抹每次施用的调节细胞内氧化还原状态的物质，优选施用
0. OOlmraol以上0. lmmol以下，專交优选0. Olmmol以上0. 05mrao1以下。并且，当如上所述在培养基中含有本发明涉及的组合物时，从将植物种子播种到该培养基时开始，或从将植物的苗等移栽到该培养基时开始，将本发明涉及的组合物施于该4直物。
另外，可以从播种后、成苗后等，有了一定程度的生长发育后开始，一定期间内施用本发明涉及的组合物。例如，对甜玉米等稻科植物施用本发明涉及的组合物时，可在育苗后施用本发明涉及的组合物。这种情况下，可以使种植已长成的苗的培养基中预先含有本发明涉及的组合物，也可以在将苗种植到该培养基后，将本发明涉及的组合物定期地施加到培养基中。当在移栽苗之后将本发明涉及的组合物施加到培养基中的情况下，对相对具体的施加时期没有特别的限定，但例如从移栽苗之后到收获之间， 一周内优选施加1次-4次，较优选2-3次。对施加量没有特别的限定，可以根据植物的种类作出适当的设定，但例如植物为甜玉米等时，每抹每次施加的调节细胞内氧化还原状态的物质优选施加0. OOlmmol以上0. lmmol以下，4交优选0. Olmmol以上0. 05mmo1以下。
另外，也可以基于开花期设定施用本发明涉及的组合物的时期。例如，可以在花蕾期施用，也可在花瓣凋落后使用，也可从花蕾期到结果之间、从开花期到结果之间、从花瓣凋落到结果之间施用本发明涉及的组合物。如以下的实施方案所述，当对葡萄施用本发明涉及的组合物时，可以施于花序上。并且，在此实施方案中，按照用于培育无籽葡萄的植物激素(赤霉素)的施用期，将本发明涉及的组合物混入该植物激素中施用。
另外，也可以从收获期起反向计算设定施用本发明涉及的组合物的时期。例如，可设定为从收获期之前10天开始施用，从之前20天开始使施用等。
当如上所述在栽培期间施用本发明涉及的组合物时，可以将肥料和/或植物激素等药剂与该组合物混合施于植物。在这种情况下，对施用所述的肥料等与组合物的混合物的时期没有特别的限定，可以按照上述的另外，当本发明涉及的组合物，作为使细胞内的谷胱甘肽增加的物 质，含有导入植物的基因组中的物质，如上述多核苷酸时，只要以使用 已知的转化方法将该多核苷酸导入植物体的基因组中的方式来使用即 可。另外，例如，本发明涉及的组合物是含有这些多核苷酸的物质，也 可以是使用已知的植物表达型载体导入植物体的物质，也可以是含有具 有这些核苷酸的载体的物质。
另外，本发明涉及的组合物中，对上述的多核苷酸的含量没有特别 的限定。另外，这些多核苷酸一般可以预先溶解在用于保存多核苷酸的 緩冲液等中。
关于将载体导入植物细胞，可以使用本领域技术人员已知的转化方 法(例如农杆菌法、基因枪法、聚乙二醇法、电穿孔法等)。例如，当使 用农杆菌法时，将构建的用于植物的表达型载体导入合适的农杆菌中(例
如根癌农杆菌(Agrobacter ium tumefaciens )),按照叶片法(leaf disc) (内宫博文著，植物基因操作手册，1990,第27-31页，讲谈社Scientific, 东京)等令该菌林感染无菌培养叶片，能够得到转化植物。并且，在使 用基因枪法时，可以直接使用植物体、植物器官、植物组织自身，也可 以在制成切片后使用，也可以制成原生质体使用。可以使用基因导入装 置(例如PDS-1000 (BIO-RAD公司)等)对经过上述制备的试样进行处理。 处理条件根据植物或样品而有所不同，但通常在450-2000psi左右的压 力，4-12cm左右的距离的条件下进行。
导入了目的基因的细胞或植物组织，首先用卡那霉素耐性、潮霉素 耐性等耐药性标记对其进行选^^,然后用标准方法再生为植物体。由转 化细胞再生为植物体的过程，可以根据植物细胞的种类用本领域技术人 员已知的方法实现。
关于目的基因是否已导入植物体的确认，可以按照PCR法、Southern 杂交法、Northern杂交法等进行。例如，由转化植物制备DNA,针对导 入的DNA设计特异性引物，从而进行PCR。随后，通过对扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，用溴化乙啶等染色，从而检测出目的扩增产物的方法，可以确认已经完成了转化。
一旦得到了基因组中导入了目的基因的转化植物体，由该植物经有 性生殖或无性生殖能够得到子代。另外，从该植物体或其子代或者克隆 得到繁殖材料(例如种子、原生质体等)，以这些为基础能够批量生产目 的植物体。
在本发明中作为转化的对象的植物，意为下述任意一种整抹植物 体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、 韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等)或植物 培养细胞、或各种形态的植物细胞(例如悬浮培养的细胞)、原生质体、 叶的切片、愈伤组织等。对可用于转化的植物没有特别的限定，适当选 择能够表达目的基因的植物即可。
并且，上述的多核苷酸来自拟南芥，但已有报告例如烟草、杨树、 柠檬等，用拟南芥的基因能够培育转化植物，这样的报告也能够作为本
魏酸5-羟基化酶的拟南芥基因的改性木质素》(Modified lignin in tobacco and poplar plants over—expressing the Arabidopsis gene encoding f erulate 5-hydroxylase.) ， Franke R， McMichael CM, Meyer K， Shirley AM, Cusumano JC, Chappie C.著，发表于Plant J. 2000 年第22期第223-224页；《柑橘属植物中拟南芥LEAFY或APETALAl基 因的纟且成型表达减少豆其世^时间》(Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALAl genes in citrus reduces their generation time. )Pena L， Martin-Tri1lo M， Juarez J， Pina JA, Navarro L， Martinez-Zapater JM.著，发表于Nat Biotechnol. 2001 年第19期第263-267页)。
对于作为本发明组合物的对象的植物没有特别的限制，对各种单子
叶植物、双子叶植物、树木等植物能够全部适用。例如，作为单子叶植 物，能够例示出例如，包含紫萍属植物(紫萍)和浮萍属植物(稀脉 萍和品藻)的浮萍科植物，包含卡特兰属植物、蕙兰属植物、石斛兰属 植物、蝴蝶兰属植物、万代兰属植物、兜兰属植物、文心兰属植物等的兰科植物，香蒲科植物、黑三棱科植物、眼子菜科植物、茨藻科植物、 芝菜科植物、泽泻科植物、水鳘科植物、霉草科植物、稻科植物(玉米 等，如甜玉米等)、莎草科植物、椋榈科植物、天南星科植物、谷精草科 植物、鸭跖草科植物、雨久花科植物、灯心草科植物、百部科植物、百 合科植物、石蒜科植物、薯蓣科植物、秀尾科植物、芭蕉科植物、姜科 植物、美人蕉科植物、水玉簪科植物等。
另外，作为双子叶植物，能够例示出例如，包含牵牛属植物(牵 牛花)、打碗花属植物(日本打碗花、打碗花、肾叶打碗花)、番薯属植 物(厚藤、甘薯)、菟丝子属植物(日本菟丝子、南方菟丝子)的旋花科 植物，包含石竹属植物(康乃馨等)、繁缕属植物、米努草属植物、巻耳 属植物、漆姑草属植物、无心菜属植物、种阜草属植物、孩儿参属植物、 Honckenya属植物、大爪草属植物、拟漆姑属植物、蝇子草属植物、剪秋 萝属植物、女娄菜属植物、狗筋蔓属植物的石竹科植物，木麻黄科植物、 三白草科植物、胡椒科植物、金粟兰科植物、杨柳科植物、杨梅科植物、 胡桃科植物、桦木科植物、山毛榉科植物、榆科植物、桑科植物、荨麻 科植物、川草科植物、山龙眼科植物、铁青树科植物、檀香科植物、槲 寄生科植物、马兜铃科植物、帽蕊草科植物、蛇恭科植物、蓼科植物、 藜科植物、苋科植物、紫茉莉科植物、假繁缕科植物、商陆科植物、番 杏科植物、马齿苋科植物、木兰科植物、昆栏树科植物、连香树科植物、 睡莲科植物、金鱼藻科植物、毛莱科植物、木通科植物、小檗科植物、 防己科植物、蜡梅科植物、樟科植物、罂粟科植物、山柑科植物、十字 花科植物、茅膏菜科植物、猪笼草科植物、景天科植物、虎耳草科植物、 海桐花科植物、金缕梅科植物、悬铃木科植物、蔷薇科植物、豆科植物、 酢浆草科植物、栊牛儿苗科植物、亚麻科植物、蒺藜科植物、芸香科植 物、苦木科植物、楝科植物、远志科植物、大戟科植物、水马齿科植物、 黄杨科植物、岩高兰科植物、马桑科植物、漆树科植物、冬青科植物、 卫矛科植物、省沽油科植物、茶茱萸科植物、槭树科植物、七叶树科植 物、无患子科植物、清风藤科植物、凤仙花科植物、鼠李科植物、葡萄 科植物、杜英科植物、椴树科植物、锦葵科植物、梧桐科植物、猕猴桃科植物、山茶科植物、金丝桃科植物、沟繁缕科植物、柽柳科植物、堇 菜科植物、刺篱木科植物、旌节花科植物、西番莲科植物、秋海裳科植 物、仙人掌科植物、瑞香科植物、胡颓子科植物、千屈菜科植物、石榴 科植物、红树科植物、八角枫科植物、野牡丹科植物、菱科植物、柳叶 菜科植物、小二仙草科植物、杉叶藻科植物、五加科植物、伞形科植物、 山茱萸科植物、岩梅科植物、山柳科植物、鹿蹄草科植物、杜鹃科植物、 紫金牛科植物、报春花科植物、蓝雪科植物、柿树科植物、山矾科植物、 野茉莉科植物、木樨科植物、醉鱼草科植物、龙胆科植物、夹竹桃科植 物、萝摩科植物、花葸科植物、紫草科植物、马鞭草科植物、唇形科植 物、茄科植物(番茄等)、玄参科植物、紫葳科植物、胡麻科植物、列当 科植物、苦苣莒科植物、狸藻科植物、爵床科植物、苦槛蓝科植物、透 骨草科植物、车前科植物、茜草科植物、忍冬科植物、五福花科植物、 败酱科植物、川续断科植物、葫芦科植物、桔梗科植物、菊科植物等。
另外，本发明中包含用于培育糖度提高的植物体的试剂盒(以下称 为"本发明涉及的试剂盒，，)。本发明涉及的试剂盒只要具有调节细胞内 氧化还原状态的物质(例如，谷胱甘肽、编码Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶 的多核香酸、或编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1， 6-二磷酸醛缩酶的 多核苦酸)即可。另外，本发明涉及的试剂盒，也可具有这些物质以外 的其它成分。调剂细胞内氧化还原状态的物质以及上述的其它成分，可 以以其适当容量和/或形态包含在一个容器中来提供，也可以用分别的容 器来提供。另外，也可具有用于培育植物的器具、培养基等。另外，当 本发明涉及的试剂盒具有上述的多核苷酸时，可将作为使该多核苷酸进 行表达的表达型载体的母体载体，置入与该多核苷酸不同的容器中；也 可预先备有插入了该多核苷酸的该载体。另外，也可备有在已知的植物 转化方法中使用的试药等。
<2.本发明涉及的糖度提高的植物体的培育方法〉
本发明涉及的糖度提高的植物体的培育方法(以下称为"本发明涉 及的培育方法")只要含有用调节细胞内氧化还原状态的物质(例如，谷 胱甘肽、编码y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸、或编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶的多核苷酸)栽培植物体的工序即 可。
作为上述工序，例如，作为细胞内氧化还原状态的调节，只要在使 用通过与植物接触能够被植物吸收的物质时，该物质能被该植物吸收即 可。对于使调节细胞内氧化还原状态的物质被植物吸收的方法没有特别 的限定，例如，可以通过使用含有调节细胞内氧化还原状态的物质的培
养基(含土壤以及土壤改良剂)栽培植物，使其由根吸收；也可以在栽 培植物的期间将调解细胞内氧化还原状态的物质喷雾、涂布，令植物体 吸收该物质。另外，也可以使调节细胞内氧化还原状态的物质吸附在离 子交换树脂等吸附物质上，将其埋进土壤中等，置于培养基中，在上述 工序的基础上栽培该纟直物体。
另外，例如，作为细胞内氧化还原状态的调节，使用导入植物基因 组中的物质、如上述的多核苷酸时，也可以不是使其被植物吸收，而是 预先导入植物中进行转化，培育得到的转化植物。关于将多核苷酸导入 植物的方法，遵照上述的本发明组合物的说明。
通过本发明涉及的培育方法得到的植物体也是本发明的范围。通过 检测调节细胞内氧化还原状态的物质在植物体中的量和比例的至少其中 一项，能够对所述植物体进行简易的检测，从而能够将其与由本发明的 方法之外的方法得到的植物体明确的区别开来。除了检测该物质的量 浓 度的方法，例如，还能够通过用DNA微阵列等对基因表达模式比较来进 行检测。使用GSSG作为该物质时，例如，预先检测施用GSSG栽培的植 物体的基因表达模式，与其它方法栽培的植物体的基因表达模式进行比 较，预先确定施用GSSG时的特有的表达模式(GSSG表达模式)。然后， 检测作为检测对象的植物体的表达模式，通过与上述GSSG表达模式进行 比较，能够简便地进行检测。进一步，作为其它的实例，通过与由谷胱 甘肽结合蛋白质的二维电泳图像预先检测的模式变化进行比较，能够判 断是否施用了 GSSG。另外，当使用上述多核苷酸时，通过PCR法、Southern 杂交法、Northern杂交法等确认植物体内的该多核苷酸，从而能够将本 发明涉及的植物体与其它的植物区别开来。
18以下示出了实施例，对本发明的实施方案进行更为详细的说明。当 然，本发明并不局限于以下的实施例，在细节上有各种各样的方案是可 能的，这一点是不言而喻的。进一步，本发明并不限定于上述的实施方 案，在权利要求的范围内进行各种各样的变动是可能的，将各个公开的 技术方案进行适当的组合从而得到的实施方案也包含在本发明的技术的 范围内。另外，引用本说明书中记载的文献的全部内容，作为本发明书 中的参考。
实施例
〈实施例1.番茄的培育〉
在本实施例中，使用GSSG或GSH培育了番茄。具体如下所述。
首先，将番茄苗(泷井(TAKII)种苗社制，品名王样番茄丽夏) 移栽在水耕栽培用盆中(1/2000公亩)。在水耕栽培用盆内，层积下层蛭 石(旭工业抹式会社制)6L、中层吴羽园艺培土 (林式会社吴羽(KUREHA) 制)3L、上层蛭石3L。
在培育番茄的期间，每抹每周在根部施用2次0. 5mM GSSG或0. 5mM GSH(用0. 1N NaOH调整至pH7),每次50ml，不摘芽，培育60天。另外， 最后的十天作为收获果实的对象期间。另外，为了进行比较，除了 GSSH 和GSH都不施用之外，在相同条件下培育番茄。并且，在任何一种条件 下，作为追肥，每2周施用1次组合(KUMIAI)磷硝安加里(phosphorate ammonium nitrate potassium) S-604号(TISS0旭月巴泮牛冲朱式会it制)3g。
然后，针对收获的果实的糖度等进行味觉测试。结果证实，与GSSG 和GSH都不施用时相比，施用了 GSSG得到的果实中糖度增加。另外证实 了果实数量的增加。证实了施用了 GSH得到的果实中糖度增加。另外证 实了酸p木的增加。
由以上的结果示出了，通过使用含GSSG、 GSH的培养基培育番茄， 能够培育糖度增加的番茄。
<实施例2.糖度的测定〉
用实施例1中描述的方法施用GSSG或GSH培育番茄。施用口袋糖度计APAL-1 (林式会社爱宕)测定了得到的果实的糖度。
另外，为了进行比较，在2种条件下培育了番茄。分别记为"Cont"、 "Cont2Sunny"。在Cont中，除了 GSSG和GSH都没有施用之外，用与实 施例1相同的方法培育番茄。在Con12Sunny中，GSSG和GSH都没有施用， 为了使照度达到100%,以单林独立种植的方式培育以使其充分接受阳光。 并且，施用了 GSSG或GSH的林系以及Cont中，分别以抹间间隔40cm-50cm 种植。因此，植抹有时会遮住其他植抹接受的光，从而使这些植抹照射 到的光的照度低于100%。
并且，在施用GSSG的条件、施用GSH的条件、Cont的条件下各培育 3抹，在Cont2Sunny的条件下培育1抹。
结果示于图1和图2中。图1示出了在本实施例中得到的番茄果实 的糖度的测定结果，纵轴表示糖度(Brix，单位％)，横轴表示培育条 件。另外，图1中的"*"，表示在上述对象期间内没有得到果实。图2 示出了将图一中示出的糖度的测定结果通过AN0VA解析后的结果，纵轴 表示糖度，横轴表示培育条件。另外，图2中各个数据柱上记录的字母 文字，表示在AN0VA解析的分组中属于同组。并且，使用StatView5. 0 (SAS Institute Inc.制)进行AN0VA分析，以显著差异水平5%来检验判 定。
如图1和图2所示，在施用了 GSSG或GSH的条件下得到的番茄果实， 不用说与Cont相比，就是与充分照射了阳光的番茄果实相比，其糖度也 有了明显的提高。其中，施用了 GSSG的植抹得到了极高糖度的番茄。
<实施例3.甜玉米的培育〉
在本实施例中培育了甜玉米。具体而言，首先将甜玉米(泷井种苗 社制，产品号堪培拉90)的种子播种在蛭石中(旭工业林式会社制)。 播种2周后，移栽到实施例1中所述的水耕栽培用盆中，作为追肥，在4 周后和6周后分别施用组合磷硝安加里S-604号3g。
另夕卜，从播种后第五周开始，在2周内在根部施用0. 2mMGSSG4次， 每次50ml。从播种后第7周开始，在2周内经叶片散布0. 2mMGSSG4次， 每次50ml，并且，为了进行比较，除不施用GSSG之外，用与本实施例相播种90天后收获果实，对甜度进行了味觉测试。结果证实，施用GSSG 进行培育得到的果实，与不施用GSSG进行培育得到的果实相比，糖度增 加。另外证实，在施用了 GSSG的情况下，果实更为肥硕，果实的数量增 加。
<实施例4.甜玉米的培育2>
在本实施例中，在与实施例3不同的条件下施用GSSG来培育甜玉米。 具体而言，首先，将甜玉米(泷井种苗社制，产品号堪培拉90)的种 子播种在蛭石中(旭工业抹式会社制)。播种1周后，移栽到实施例1中 所述的水耕栽培用盆中，作为追肥，在4周后和6周后分别施用组合磷 硝安加里S-604号3g。
另外，从发芽后起12周内，每周在根部施用0. 5mM GSSG 2次，每 次200ml。并且，为了进行比较，除不施用GSSG之外，用与本实施例相 同的方法培育甜玉米并收获果实。
播种后12周后收获果实，对糖度进行味觉测试。结果证实，使用GSSG 进行培育得到的果实，与不施用GSSG进行培育得到的果实相比，糖度增 加。另外证实，在施用了 GSSG的情况下，果实更为肥硕，果实的数量增 加。
<实施例5.葡萄的培育>
在本实施例中培育了葡萄。具体而言，在葡萄(特拉华)开花之后， 立即将混合了 lmM的赤霉素(GA3)和lmM的各种试剂的溶液施于花序上。 分别使用GSSG、 GSH作为各种试剂。随后，在涂布了各种试剂之后，收 获结出的果实。另外，为了进行比较，除了不使用上述各种试剂而仅施 用GA3之外，用同样的方法培育葡萄，收获果实用于以下的味觉测试。
然后，对收获的果实的糖度进行味觉测试。结果证实，与仅施用GA3 进行培育得到的果实相比，施用了GSSG和GA3、 GSH和GA3进行培育得 到的果实，两者糖度都增加。另外证实，在施用GSSG和GA3的情况下， 果实更为肥硕。
另夕卜，在使用GSSG或GSH的情况下，证实了当不使用GA3培育葡萄时，糖度增加。并且，在不使用GA3的情况下，无籽的效果受到了抑制。 <实施例6.调节细胞内氧化还原的物质添加后的经时变化〉 在本实施例中，测定了在将调节细胞内氧化还原状态的物质施于植 物之后的该植物中的糖度。使用GSH、 GSSG作为调节细胞内氧化还原状 态的物质。另外，植物使用与实施例1中使用的植物相同的番茄。具体 而言，进行以下操作。
播种番茄种子之后，在90天后用GSH或GSSG进行处理。对于培育 番茄的方法，除了用GSH或GSSG处理之外，用与实施例l中所述的方法 相同的方法进行。所述用GSH或GSSG进行的处理为，每抹在根部施用1 次0. 5mM GSSG或0. 5mM GSH (用0. 1N NaOH调整至pH7) 50ml。然后，在 施用后第0天-第4天每天收获果实，测定其糖度。结果示于图3。图3 示出了从GSSG或GSH处理日起经过的天数与糖度的关系经证实的结果， 纵轴表示糖度(Brix,单位％),横轴表示从处理日起的天数。另外， 在图3中的圆形记号表示施用了 GSH的结果，三角形记号表示施用了 GSSG 的结果，四边形记号表示用于进行比较的GSSG和GSH都没有施用时的结 果。并且，GSSG或GSH的施用在第0天的早上进行，在图3中第0天的 结果表示的是在第0天的晚上进行的果实的收获和糖度的测定的结果。 如图3所示，通过施用GSSG或GSH,能够迅速地提高果实的糖度。 <实施例7.导入了 GSH1基因的植物的培育〉
在本实施例中，使用经克隆的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因作为调 节细胞内氧化还原状态的物质。它是具有序列号3中示出的序列的多核 苷酸，是GSH1基因之一，在本实施例中简记为"GSH1基因"。
(1 )使用的植物
作为用于制作转化体的亲本植物，使用野生型拟南芥的Columbia (Col-0)。在正方形的塑料盆(6. 5 x 6. 5 x 5cm)中分三层放入土壤，从盆 底开始为蛭石(旭工业，闪山)、吴羽培养土 (吴羽园艺培土，吴羽化学， 东京)、蛭石，比例为2: 1: 1;将植物播种在该土壤中，在培育温度22 。C、长日条件下(16小时明期/8小时暗期)培育。
(2) GSH1基因的克隆、GSH1基因的改变、以及GSH1转化体的培育分离提纯来自3周龄的拟南芥野生型Columbia (Col-0)的全RNA, 用Prostar first strand RT-PCR试剂盒(Stratagene， UJolla， CA， USA)合成cDNA。
然后，使用基于GSH1基因的cDNA序列设计的以下特异性引物将完 整长度的cDNA作为2个片段通过PCR扩增，在pGEM-T Easy载体 (Promega， Madison， WI， USA)中亚克隆各片段。在引物GSHl_5，-3和 GSH1_3，-2上，在导入用于植物转化的双元载体pBI121时，分别插入 必要的Xbal和SacI切割位点。
GSH1 —5，-3: 5，-GCTTTCTTCTAGATTTCGACGG-3，(序列号10) GSHl — 3，-3: 5，-CCTGATCATATCAGCTTCTGAGC-3，(序列号11) GSHl_5，-2: 5，-ATGCCAAAGGGGAGATACGA-3，(序列号12) GSHl_3，-2: 5，-GGAGACTCGAGCTCTTCAGATAG-3，(序列号13) 将2个片段在Kpnl切割位点融合，构建含完整长度的cDNA的载体 (Chl.GSHl-pGEM)。用限制酶Xbal和Sacl处理Chi. GSHl-pGEM后，将片 段与双元载体pBI121的花椰菜花叶病毒的35S启动子的下游的P-葡萄 糖苷酸酶的编码区置换，做成用于培育转化植物的构建体(35S-Chl. GSHl-pBI121 )。
另外，在拟南芥基因组中，GSH1基因仅存在1个拷贝，且含有向叶 绿体的转运信号。因此，为了在细胞质中积蓄GSH1基因产物(y-谷氨 酰半胱氨酸合成酶)，制作了表达除去推断为叶绿体转运信号的N末端73 个氨基酸且将从N端起第74个的丙氨酸残基置换为曱硫氨酸残基的蛋白 质的构建体(35S-cyt.GSHl-pBI121)。首先，将以下示出的从N端起第 74个的丙氨酸残基置换为曱硫氨酸残基，使用在所述第74个氨基酸的上 游插入了 Xbal切割位点(碱基置换位点用下划线表示)的引物 GSHl(cyt.)-5'和上述的GSHl — 3'-3进行PCR,用限制酶XbaI和Kpnl处理 片革殳后，在pBluescript载体(Stratagene， La Jolla， CA USA)中亚克 隆(cyt.GSH卜pBS)。
GSH1 (cyt.) _5，: 5，-AGGGCATCTAGAGACCATGGCAAGTCC-3，(序列号14 ) 将cyt.GSHl-pBS用限制酶Xbal和Kpnl处理后，将片段与35S-Chl.GSHl-pBI121的GSH1上的XbaI-K叩I片段置换，构建35S-cyt. GSH1-pBI121。
将按照上述内容构建的35S-Chi. GSH1-pBI121和35S-cyt. GSH1-pBI121的2种表达型载体用农杆菌法(《Floral dip法 一种农杆菌 介导转化拟南芥的简化方法》(Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalia-na), Clough, S. J.和SHI-pB Bent，A. F.著，发表于Plant J. 1998年 第16期第735-743页)导入Col-O,培育了转化植物。
具体而言，在含有作为选择标记的卡那霉素的琼脂培养基(1/2 倍浓度的Murashige-Skoog(MS)培养基)上反复选才奪，直至得到所有的 种子均显示出卡那霉素耐性的世代(不发生分离的世代)。另外在选择 的过程中，卡那霉素耐性的性状以3: l的比例发生分离，证实了表达 型载体已导入到至少单独一条染色体上。
按照以上的描述得到的植物，以下记为"35S-GSHl"。
(3)糖度的测定
在生育光(growth light)强度50或500 p Em_2s—1的条件下培育 35S-GSHl和用于进行比较的野生型拟南芥(Col-0)。培育一周后，采 摘植物体。然后，用液氮冻结采摘的植物体后，磨碎成粉末状，每50mg 植物体用100 ja 1的50mM醋酸钠緩冲液提取。
然后，测定了得到的提取物中的葡萄糖和淀粉的量。葡萄糖量的 测定用葡萄糖CII-Test Wako (和光纯药社制)进行。另外，对于淀 粉量的测定，将淀粉葡聚糖酶35Units/ml及醋酸钠緩冲液 (50mM，pH4. 5)与提取物混合，静置1小时后，测定葡萄糖的量。结果 示于图4。图4示出了 35S-GSH1的淀粉和葡萄糖的测定结果，图4(a) 示出了淀粉量，图4 (b)示出了葡萄糖量。另外，在图4 (a)和(b) 中，纵轴分别表示淀粉和葡萄糖的相对含量，横轴表示使用的植物的 种类。在横轴中A和B表示35S-GSH1。即，在本实施例中用图4中表 示为A和B的2抹35S-GSH1进行试验。另外，上述的相对含量意为， 将在生育光强度50|aEm—2s—^々条件下培育的Col-0的结果计为100时的相对量。
如图4所示，35S-GSH1与Col-O相比，显示了高淀4分量和^f唐度。 <实施例8.櫻桃的培育〉
在本实施例中培育了櫻桃。具体而言，在樱桃预计的收获日的4 周之前和3周之前，在预计收获果实的结果枝条的叶片表面涂布0. 5mM 的GSSG，在预计日收获果实。
然后，对收获的果实的糖度进行味觉测试。结果证实，施用GSSG 进行培育得到的果实糖度增加且酸度降低。另外证实，在施用了GSSG 的情况下，果实重量增加。进一步，用口袋糖度计APAL-1 (抹式会社 爱宕制)测定了得到的果实的糖度。图5示出了本实施例中得到的樱 桃果实的糖度的测定结果，纵轴表示糖度(Brix,单位％)。并且， 4吏用StatView5. 0 ( SAS Institute Inc.制)进4亍AN0VA分4斤，以显著差 异水平5%来纟全验判定，证实存在显著差异。
如上所述，通过施用GSSG得到了糖度显著提高的櫻桃果实。
<实施例9.温州蜜柑的培育〉
在本实施例中培育了温州蜜柑。具体而言，在温州蜜柑预计的收获 曰的1周之前，在预计收获果实的结果枝条的叶片表面涂布0. 5mM的 GSSG,在预计日收获果实。
然后，然后，对收获的果实的糖度进行味觉测试。结果证实，施 用GSSG进行培育得到的果实糖度增加且酸度降低。另外证实，在施用 了 GSSG的情况下，果实重量增加。进一步，用口袋糖度计APAL-1 (林 式会社爱宕制)测定了得到的果实的糖度。并且，也对用于进行比较 的在未施用GSSG的条件下得到的果实测定了糖度。图6示出了本实施 例中得到的温州蜜柑果实的糖度的测定结果，纵轴表示糖度(Brix, 单位％)。并且，使用StatView5.0(SAS Institute Inc.制)进行ANOVA 分析，以显著差异水平5%来检验判定，证实存在显著差异。
如上所述，通过施用GSSG得到了糖度显著提高的温州蜜柑果实。
<实施例IO.草莓的培育〉
在本实施例中，施用GSSG或GSH培育了草莓。具体如下所述。首先，将草莓苗移栽到盆中，在盆中层积下层蛭石(旭工业林式会社
制)6L、中层吴羽园艺培土 (抹式会社吴羽制)3L、上层蛭石3L。
在培育草莓的期间，每抹每周在根部施用1次50ml的0. 2mM或0. 5mM 的GSSG或者0. 4mM或1. OmM的GSH (用0. 1N NaOH调整为pH7 ),不摘芽， 培育63天。另外，为了进行比较，除了 GSSG和GSH都不施用之外，在 相同条件下培育草莓。并且，在任一条件下，作为追肥，每2周施用1 次组合磷硝安加里S-604号(TISSO旭肥料抹式会社制)3g。
然后，对收获的果实的糖度等进行味觉测试。结果证实，与GSSG和 GSH都没有施用的情况相比，施用了 GSSG得到的果实中糖度增加且算为 降低。另外证实了果实数量增加。证实了在施用了 GSH得到的果实中糖 度和酸p未都增加。
进一步，用口袋糖度计APAL-1 (林式会社爱宕制)测定了得到的果 实的糖度。并且，也对用于进行比较的在GSSG和GSH均未施用的条件下 得到的果实测定了糖度。图7示出了本实施例中得到的草莓果实的糖度 的测定结果，纵轴表示糖度(Brix,单位％)。并且，使用SUtView5.0 (SAS Institute Inc.制)进行ANOVA分析，以显著差异水平5°/。来检验判 定，^i正实存在显著差异。
由以上的结果显示，通过使用含有GSSG、 GSH的培养基培育草莓， 能够培育糖度增加的草莓果实。
<实施例ll.甜玉米的培育〉
在本实施例中培育了甜玉米。具体而言，首先将甜玉米(泷井种苗 社制，产品号堪培拉86)的种子播种到蛭石上(旭工业林式会社制)。 播种2周后，移栽到实雄例1中所述的水耕栽培用盆中，作为追肥，在4 周后和6周后分别施用组合磷硝安加里S-604号3g。
另外在播种后第5周、第6周、第7周、第8周在叶片表面散布0. 5mM GSSG (溶解于作为铺展剂的0. l°/。Tween80)。并且，为了进行比较，除了 不施用GSSG而施用Tween80作为代替之外，用与本实施例相同地方法培 育甜玉米并收获果实。
播种86天后收获果实，对糖度进行味觉测试。结果证实，施用GSSG进行培育得到的果实，与未施用进行培育得到的果实相比，糖度增加。
进一步，用口袋糖度计APAL-1 (抹式会社爱宕制)测定了得到的果实的 糖度。并且，也对用于进行比较的未施用GSSG的条件下得到的果实测定 了糖度。图8示出了本实施例中得到的甜玉米果实的糖度的测定结果， 纵轴表示糖度(Brix,单位％ )。并且，使用StatView5. O(SAS Institute Inc.制)进行AN0VA分析，以显著差异水平5%来4企验判定，证实存在显 著差异。
另外证实，在施用GSSG的情况下，果实更为月巴硕，果实数量增加。 进一步证实，施用了 GSSG的甜玉米果实在播种后第70天就可以收获了。
由以上的结果显示，通过使用含有GSSG的培养基培育甜玉米，能够 培育糖度增加的草莓果实。
本发明涉及的用于培育糖度提高的植物体的组合物，由于含有调节 细胞内氧化还原状态的物质，起到了能够简便地培育糖度提高的植物体 的效果。
明本发明的技术内容，不应仅局限于这些具体实例来狭义地解释本发明 的技术内容，在本发明的精神实质和以下所述的权利要求的范围内是可 以做出各种变动来实施的。
产业上的实用性
由于通过使用本发明涉及的组合物，能够容易地培育糖度提高的植 物，因此本发明涉及的组合物能够用于农业、食品业等产业。另外，由 于由糖度高的植物能够高效率地制造酒精，因此能够在能源产业等大范 围的产业中利用本发明的组合物。
2权利要求
1.一种用于培育糖度提高的植物体的组合物，其特征在于，所述组合物含有调节细胞内氧化还原状态的物质(但过氧化氢除外)。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述调节细胞内氧 化还原状态的物质为谷胱甘肽、编码Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷 酸或编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶的多核苷酸。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述调节细胞内氧 化还原状态的物质为氧化型谷胱甘肽。
4. 一种用于培育糖度提高的植物体的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒具有调节细胞内氧化还原状态的物质(但过氧化氢除外)。
5. —种糖度提高的植物体的培育方法，其特征在于，所述培育方法 含有使用调节细胞内氧化还原状态的物质(但过氧化氢除外)栽培植物 体的工序。
6. —种植物体，其特征在于，所述植物体是通过权利要求5所述的 培育方法得到的。
全文摘要
本发明涉及的一种用于培育糖度提高的植物体的组合物含有谷胱甘肽、编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸或编码谷胱甘肽结合性质体型果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的多核苷酸。优选含有氧化型谷胱甘肽。由此提供了用于简便地培育糖度提高的植物的组合物。
文档编号A01G7/06GK101686669SQ200880018279
公开日2010年3月31日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月13日
发明者小川健一 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构