专利名称：象鼻兰的种苗试管繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物的种苗繁殖方法，具体地说，涉及象鼻兰的种苗试管繁殖方法。
背景技术：
象鼻兰(;Vof力oc/on'"s z/7e力'ay7《e/7sj's Z. H. Tsi)属于兰科象鼻兰属，本属中仅此1 种，主要分布于我国浙江临安天目山和宁波等地，生于海拔350—900米的山地林中或林缘树 枝上，形态上与五唇兰("on'"s)和与蝴蝶兰(州373e/7opw's)相似，但其萼片和花瓣白色， 内具紫色横纹，非常艳丽和独特。也是国内少数没有流失到国外的珍贵兰科种质资源之一。
由于生态环境的破坏，象鼻兰的野生资源越来越少，而由于象鼻兰种子胚发育不完全， 自然状态下极难萌发，目前，国内外也还没有象鼻兰种苗繁殖方法的报道，因此，研究和开 发能培育大量象鼻兰种苗的试管繁殖方法，对于减少对野生资源的进一步挖掘，满足市场的 需要，进行回归自然的生态重建，具有重大意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能在短期内获得大量的试管苗的高效率的象鼻兰的种苗试管繁 殖方法。
本发明所提出的象鼻兰的种苗试管繁殖方法，包括以下的步骤
(1) 材料选取生长健壮的象鼻兰母株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育至基本 成熟而未开裂时的果实做为外植体用于播种；
(2) 无菌播种或原球茎的增殖并分化培养
a、 无菌播种将所述外植体用70%—80%的酒精浸泡30—60秒后置于0.1%—0.2%的 升汞溶液中消毒10—20分钟，再用无菌水漂洗4 5次后切开果实，将其粉末状胚接种培养 到种子萌发培养基上，所述的种子萌发培养基为改良的Knudson C培养基附加体积百分比5 % —10%的椰子汁，其中改良的Knudson C培养基每升含硫酸铵400—600 mg，磷酸二氢钾 200—300 mg，硫酸镁200—300 mg，硝酸钙500—1500 mg，硫酸锰5—10mg，硫酸亚铁20 —40 mg，蔗糖15 30g，琼脂6 7g，活性炭0. 5 2 g，肌醇80—120毫克，甘氨酸1. 5 — 2.5毫克，盐酸硫胺素(VB1) 0.05—0.2毫克，盐酸吡哆醇(VB6) 0.4—0.8毫克，烟酸0.4 —0.8毫克，余量为水，pH 5.4-5.6;
b、 原球茎的增殖并分化培养将原球茎培养在所述的改良KnudsoiiC培养基附加体积 百分比5% — 10%的椰子汁再附加TDZ0.01—0.2毫克/升的培养基上，在原球茎上获得大量的 类原球茎或/和愈伤组织，再将这些类原球茎或/和愈伤组织培养在改良的KnudsonC培养 基附加体积百分比5% — 10%的椰子汁再附加活性炭0. 5 2 g/升的培养基上，分化出小苗，
3所述的改良的KnudsonC培养基的组分如步骤(2) a中所述；
(3) 壮苗培养将在上述无菌播种培养所得的小植株或通过原球茎增殖并分化而得的小 苗接种培养到壮苗培养基上，所述的壮苗培养基每升含花宝1号1 3g，蛋白胨0.5~3g， 萘乙酸0.5—3 mg、香蕉匀浆50—100 g、活性炭0. 5 2 g，蔗糖15 30g,琼脂6 7g，肌 醇80—120毫克/升，甘氨酸1.5—2.5毫克/升，盐酸硫胺素(VB1) 0.05—0.2毫克/升，盐 酸吡眵醇(VB6) 0.4—0.8毫克/升,烟酸0.4—0.8毫克/升，pH 5.4-5.6;
(4) 试管苗移栽当植株约3-5厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗10—15天， 然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石蕨根泥炭为1: 0.5~2: 0.5~2 的混合基质中；
上述步骤(2) (3)中培养条件为培养温度24—28°C，光照度1500 20001x，光照 12— 16小时/天。
步骤(1)所述的果实成熟期通常为90—120天。
在原球茎的增殖并分化培养步骤[即步骤(2) b]中，当用于培养原球茎的培养基所附 加的TDZ的浓度小于0.05毫克/升时，在原球茎上能增殖形成大量的类原球茎(即主要增殖 类原球茎)；当用于培养原球茎的培养基所附加的TDZ的浓度大于0.05毫克/升时，在原球茎 上能形成大量的愈伤组织(即主要形成愈伤组织)。
步骤(3)所述的花宝1号可以从市场上购得。
本发明具有种子的萌发率高、成苗快、种苗品质好、成本低廉等特点，能在短期内获得 大量的试管苗，成苗的移栽成活率90%以上。能为象鼻兰的种苗生产提供一条有效的途径。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例中使用的花宝l号 (HYPONeX 1)为美国生产台湾台和园艺企业股份有限股份有限公司分装产品。
实施例一
(1) 材料开花时选取生长健壮的象鼻兰母株进行人工授粉，授粉后果实90天时做为 外植体用于播种。
(2) a、无菌播种用70%的酒精浸泡30秒后0.1%的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水 漂洗4次后切开果实，将粉末状胚接种到由改良的Knudson C培养基附加体积百分比5%的 椰子汁的种子萌发培养基上，30天左右胚萌发，80天左右形成小植株；种子萌发率60%， 成苗率50%;所述的改良的KnudsonC培养基每升含硫酸铵[(NH4)2S04] 500 mg，磷酸二氢 钾(KH2PCU250 mg，硫酸镁(MgS04. 7H20 ) 250 mg，硝酸钙[Ca3(P04)2]1000 mg,硫酸锰(MnS04. 4H20) 7.5 mg,硫酸亚铁(FeS04.7H20) 25 mg，蔗糖15g，琼脂7g，活性炭2 g,肌醇100毫克， 甘氨酸2毫克，盐酸硫胺素(VB1) 0.1毫克，盐酸吡哆醇(VB6) 0.5毫克，烟酸0.5毫克， 余量为水，pH 5. 5。(2)b、原球茎的增殖并分化培养将原球茎培养在改良的Knudson C培养基附加体积 百分比5%的椰子汁，再附加噻重氮苯基脲(TDZ) 0.1毫克/升的培养基上，会形成大量的愈 伤组织；再将这些愈伤组织培养在改良的Knudson C培养基附加体积百分比5X的椰子汁、 活性炭2g/升的培养基上，能分化出小苗；所述的改良的KnudsonC培养基的组分如上述步 骤(2) a中所述。
(3) 壮苗培养将无菌播种和继代增殖获得的小苗接种培养到壮苗培养基上，45天时 能形成健壮的植株。所述的壮苗培养基每升含花宝1号2g，蛋白胨3g，萘乙酸2mg、香蕉 匀浆50g、活性炭2g上，蔗糖30g，琼脂7g，肌醇100毫克，甘氨酸2毫克，盐酸硫胺素
(VB1) 0.1毫克，盐酸吡眵醇(VB6) 0.5毫克，烟酸0.5毫克，余量为水，pH 5.5。
(4) 试管苗移栽当植株约3-5厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗15天，然后 将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石蕨根:.泥炭为l: 1: l的混合基质中， 保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90%以上。
在上述步骤(2) — (3)中，所用的培养条件为培养温度25'C，光照度1800 lx,光照 12小时/天。
实施例二
(1) 材料开花时选取生长健壮的象鼻兰母株进行人工授粉，授粉后IOO天做为外植体 用于播种。
(2) a、无菌播种用75%的酒精浸泡45秒后0.15%的升汞溶液中消毒15分钟，无菌 水漂洗4次后切开果实，将粉末状胚接种到由改良的KnudsonC培养基附加体积百分比7.5% 的椰子汁的种子萌发培养基丄，消毒成功率95%， 25天左右胚萌发，70天左右形成小植株； 种子萌发率70%，成苗率60%;所述的所述的改良的Knudson C培养基每升含硫酸铵
〔(NH4)2S04] 400 mg;磷酸二氢钾(KH线)200 mg;硫酸镁(MgS04. 7H20) 200 mg;硝酸钙 [Ca3(P04)2] 800 mg;硫酸锰(MnS04.4H20) 6 mg;硫酸亚铁(FeS04.7H20 ) 22 mg;蔗糖20g
琼脂6.5g，活性炭lg，肌醇80毫克，甘氨酸1.5毫克，盐酸硫胺素(VB1) 0.08毫克，盐
酸吡眵醇(VB6) 0.4毫克，烟酸0.4毫克，余量为水；pH 5.4。
(2) b、原球茎的增殖并分化培养将原球茎培养在由改良的KnudsonC培养基附加体 积百分比7.5%的椰子汁，再附加噻重氮苯基脲(TDZ) 0.03毫克/升的培养基上，原球茎增殖 形成大量的类原球茎，将这些类原球茎培养在由改良的Knudson C培养基附加体积百分比 7.5%的椰子汁、活性炭1 g/升的培养基上，使之分化出小苗；所述的改良的KnudsonC培养 基的组分如上述步骤(2) a中所述。
(3) 壮苗培养将无菌播种和继代增殖获得的小苗接种培养到壮苗培养基上，40天时 能形成健壮的植株。所述的壮苗培养基每升含花宝1号3 g，蛋白胨lg,萘乙酸2.5mg、香蕉匀浆100g、活性炭l g上，蔗糖20g，琼脂6.5g，肌醇80毫克，甘氨酸1.5毫克，盐酸 硫胺素(VB1) 0.08毫克，盐酸吡哆醇(VB6) 0.4毫克，烟酸0.4毫克，余量为水；pH5.4。 (4)试管苗移栽当植株约3-5厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗12天，然后 将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石蕨根泥炭为h 2: 0.5的混合基质 中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90%以上。
在步骤(2) — (3)中，所用的培养条件为培养温度28。C，光照度2000 lx,光照10 小时/天。
实施例三
(1) 材料开花时选取生长健壮的象鼻兰母株进行人工授粉，授粉后120天的果实做为 外植体用于播种。
(2) a、无菌播种用80%的酒精浸泡60秒后0.2%的升汞溶液中消毒20分钟，无菌 水漂洗5次后切开果实，将粉末状胚接种到由改良的Knudson C培养基附加10%的椰子汁的 种子萌发培养基上，消毒成玛率100%， 25天左右胚萌发，60天左右形成小植株；种子萌 发率80%，成苗率70%;所述的改良的KnudsonC培养基每升含硫酸铵[(NH4)2S04] 600 mg; 磷酸二氢钾(KH2P04) 300 mg;硫酸镁(MgS04. 7H20) 300 mg;硝酸钙[Ca3(P04)2] 1400 mg; 硫酸锰(MnS04.4H20) 10 mg;硫酸亚铁(FeS04. 7H20 ) 35 mg;蔗糖30g，琼脂6g，活性炭0. 5 g，肌醇120毫克，甘氨酸2.5毫克，盐酸硫胺素(VB1) 0.2毫克，盐酸吡哆醇(VB6) 0.8 毫克，烟酸0.8毫克，余量为水；pH 5.6。
(2) b、原球茎的增殖并分化培养将原球茎培养在改良的Knudson C培养基附加体积 百分比10%的椰子汁，再附加噻重氮苯基脲(TDZ) 0.05毫克/升的培养基上，使原球茎增殖 形成大量的类原球茎；将这些类原球茎培养在改良的Knudson C培养基附加体积百分比10% 的椰子汁、活性炭0.5g/升的培养基上，使之分化出小苗；所述的改良的Knudson C培养基 的组分如上述步骤(2) a中所述。
(3) 壮苗培养将无菌插种获得的小苗和继代增殖接种培养到壮苗培养基上，30天时 能形成健壮的植株。所述的壮苗培养基每升含花宝l号1.5g,蛋白胨2g，萘乙酸lmg、香 蕉匀浆75 g、活性炭0.5g上，蔗糖15g，琼脂6g，肌醇120毫克，甘氨酸2.5毫克，盐酸 硫胺素(VB1) 0.2毫克，盐酸吡哆醇(VB6) 0.8毫克，烟酸0.8毫克，余量为水；pH 5.6。
(4) 试管苗移栽当植株约3-5厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗15天，然后 将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石蕨根泥炭为1: 0.5: 2的混合基质
中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%以上。
在步骤(2)— (3)中。所用的培养条件为培养温度24'C,光照度1500 1x，光照15小 时/天。
权利要求
1、象鼻兰的种苗试管繁殖方法，其特征在于包括以下步骤(1)材料选取生长健壮的象鼻兰母株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育至基本成熟而未开裂时的果实做为外植体用于播种；(2)无菌播种或原球茎的增殖并分化培养a、无菌播种将所述外植体用70％-80％的酒精浸泡30-60秒后置于0.1％-0.2％的升汞溶液中消毒10-20分钟，再用无菌水漂洗4～5次后切开果实，将其粉末状胚接种培养到种子萌发培养基上，所述的种子萌发培养基为改良的Knudson C培养基附加体积百分比5％-10％的椰子汁，其中改良的Knudson C培养基每升含硫酸铵400-600mg，磷酸二氢钾200-300mg，硫酸镁200-300mg，硝酸钙500-1500mg，硫酸锰5-10mg，硫酸亚铁20-40mg，蔗糖15～30g，琼脂6～7g，活性炭0.5～2g，肌醇80-120毫克/升，甘氨酸1.5-2.5毫克/升，盐酸硫胺素(VB1)0.05-0.2毫克/升，盐酸吡哆醇(VB6)0.4-0.8毫克/升，烟酸0.4-0.8毫克/升，pH 5.4-5.6；b、原球茎的增殖并分化培养将原球茎培养在所述的改良Knudson C培养基附加体积百分比5％-10％的椰子汁再附加TDZ 0.01-0.2毫克/升的培养基上，在原球茎上获得大量的类原球茎或/和愈伤组织，再将这些类原球茎或/和愈伤组织培养在改良的Knudson C培养基附加体积百分比5％-10％的椰子汁再附加活性炭0.5～2g/L的培养基上，所述的改良的Knudson C培养基的组分如步骤(2)a中所述；(3)壮苗培养将在上述无菌播种培养所得的小植株或通过原球茎增殖并分化而得的小苗接种培养到壮苗培养基上，所述的壮苗培养基每升含花宝1号1～3g，蛋白胨0.5～3g，萘乙酸0.5-3mg、香蕉匀浆50-100g、活性炭0.5～2g，蔗糖15～30g，琼脂6～7g，肌醇80-120毫克/升，甘氨酸1.5-2.5毫克/升，盐酸硫胺素(VB1)0.05-0.2毫克/升，盐酸吡哆醇(VB6)0.4-0.8毫克/升，烟酸0.4-0.8毫克/升，pH 5.4-5.6；(4)试管苗移栽当植株约3-5厘米高时，将培养瓶转移到自然光下炼苗10-15天，然后将其从培养瓶中取出，洗净根部的培养基，移入兰石∶蕨根∶泥炭为1∶0.5～2∶0.5～2的混合基质中；上述步骤(2)～(3)中培养条件为培养温度24-28℃，光照度1500～2000l x，光照12-16小时/天。
全文摘要
本发明提供一种象鼻兰的种苗试管繁殖方法，本方法选取生长健壮的象鼻兰母株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育至基本成熟而未开裂时的果实做为外植体，并经过无菌播种或原球茎的增殖并分化培养、壮苗培养和试管苗移栽等繁殖步骤。分别采用专门配制的培养基进行无菌播种和原球茎的继代增殖，获得小植株，再将小植株经在专门配制的壮苗培养基上培养后移栽。本发明具有种子的萌发率高、成苗快、种苗品质好、成本低廉等特点，能在短期内获得大量的试管苗，成苗的移栽成活率90％以上。能为象鼻兰的种苗生产提供一条有效的途径。
文档编号A01G31/00GK101584298SQ200910039929
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月2日 优先权日2009年6月2日
发明者吴坤林, 曾宋君, 俊 段, 陈之林 申请人:中国科学院华南植物园