一种肝保存液的制作方法

专利名称：：一种肝保存液的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种器官保存液，特别涉及一种肝保存液，属于生物医药
技术领域：
。
背景技术：
：随着肝移植普遍丌展，供体来源短缺与等待肝移植患者数量激增的矛盾R益明显。供体的缺乏需要移植器官的合理分配，为了充分利用每一例供体的器官，经常需要长途运送，这样移植器官冷保存时间逐渐延长，冷保存再灌注损伤闩益严重。尽管器官保存技术已经很好的发展，但据国外权威机构统计，仍有4%供肝、供肾由于种种因素而废弃，肝移植后早期无功能(PNF)，大约占5—10%，肝移植后早期功能差(IPF)大约占15—25X，延迟的肝功能恢复(IGF)大约占670X，因而目前仍有许多学者致力于器官保存的研究。20世纪50年代，两大成就掀起了器官移植的序幕。其一是Murray等用同卵双生的供肾进行肾移植获得成功；其二是Medawar等阐明了移植物排斥反应的免疫基础。随后器官移植普遍开展，自二十世纪八十年代以来，肝移植是目前治疗终末期肝病的唯一有效手段。随着手术技巧的不断提高、新型免疫制剂和，保存液的相继问世，临床肝移植进入了快速发展时期。2000年，仅美国就完成了肝移植5000余例。但随着肝移植普遍丌展，供体来源短缺与等待肝移植患者数量激增的矛盾R益明显。供体的缺乏需要移植器官的合理分配，为了充分利用每一例供体的器官，经常需要长途运送，这样移植器官冷保存时间逐渐延长，冷保存再灌注损伤日益严重。根据UNOS最新发布的，近万例肝移植回顾性调査资料表明，影响肝移植存活率(graftsurvival)最重要的因素是供体年龄、热缺血时间和冷保存时间。研究还表明，移植肝冷保存再灌注损伤与移植术后原发性移植肝脏无功能及晚期慢性移植物功能丧失密切相关。因此，如何防治移植肝冷保存再灌注损伤正成为研究的热点。可供移植的人体器官不足，一直是困扰移植界的难题，于是在肝脏临床解剖学和手术技术发展的基础上，出现了利用供肝的各种手术方式。减体积肝移植、劈离式肝移植和活体肝移植手术方式的开展，虽解决了一部分供肝短缺的问题，但在技术上不断加大难度的同时，也提出了一些新的问题。如冷保存时间延长供肝、脂肪变性供肝、小体积供肝与老年性供肝等，开展移植肝功能保护和提升试验研究，拓展边缘性供肝的临床应用，提高移植疗效，具有重要的现实意义。针对冷保存与缺血再灌注损伤开展供肝的保护性研究是肝脏移植领域的一个重要课题。供肝在切除、保存、植入等过程中，不可避免地要经历缺血再灌注过程，冷、热缺血/再灌注势必引起供肝细胞ATP储备耗竭，并产生大量的氧自由基和脂质过氧化产物，造成肝细胞损伤甚至肝功能障碍。由于我国区域器官分配网络尚不健全，供肝延迟获得性比例较高，冷缺血时间较长，供肝质量受到严重影响，增加了移植后肝功能恢复不良和原发性移植肝无功能发生的危险性。为使供肝得到合理分配及利用，防护肝脏缺血再灌注损伤，延长供肝保存时间显得十分重要。迄今，人们对肝缺血再灌注损伤的确切机制尚缺乏完整认识。N0与肝脏缺血/再灌注损伤的关系是研究的焦点问题。基因治疗的开展和中草药的不断挖掘为供肝保护性研究提供了丰富多彩的手段。长期以来，人们研究发现肝脏缺血再灌注损伤机制主要包括肝细胞内Ca2+超载和大量氧自由基的生成，因此临床防治肝脏缺血再灌注损伤的研究多侧重于抗氧化治疗。最近，炎症损伤因子网络在肝脏缺血再灌注损伤中的作用已受到充分的肯定，其中枯否氏细胞即或及释放TNF-a等损伤因子、中性粒细胞的聚集和粘附、肝窦内皮细胞的损伤及肝窦微循环的改变等更是研究的热点。因此针对上述再灌注损伤机制的防治措施正得到广泛的关注。肝移植过程中肝脏冷保存再灌注损伤不可避免，该过程以缺血、缺氧、能量供应中断为始动因素，经细胞内钙超载、氧自由基形成及白细胞浸润三个重要环节，通过细胞因子炎性损伤介质的释放，不但对移植肝脏造成损伤，而且对全身其他器官也可造成一定的伤害。缺血再灌注时钙超载途径主要有以下几个方面NaVCa2+交换增加缺血时细胞内ATP产生减少，化+-1(+^1酶活性降低，导致细胞内Na+浓度增高，从而激活细胞膜上的1^7(^2+交换蛋白，Na7C,交换增加，引起细胞内钙超载;Ca"被动扩散增加缺血缺氧可引起细胞膜通透性增加，再灌注时Ca2+通过被动扩散进入细胞增多。电镜下，Cr3+、La3+等细胞膜通透性标志物在转超负荷时均不能自由地进入细胞，说明被动渗透不是钙内流的主要途径；质膜Ca"泵排Ca2+能力减弱钙泵(即Ca2+-ATP酶)是钙外流的主要机制，而钙过程是耗能的主动转运过程，在缺血缺氧时线粒体ATP生成减少，Ca2+泵排Ca2+能力减弱，至胞浆内钙超载。严重的细胞内超载可以激活Ca2+依赖蛋白酶，促使细胞内许多重要的酶(如腺氨酸环化酶等)降解，导致细胞损伤；同时Ca2+激活Ca2+依赖磷脂酶，促进脂质分解，破坏细胞膜结构，促进胞膜泡形成，而胞膜泡形成和破裂是肝细胞致死性损伤的普遍特征。缺血再灌注均可产生较多的超氧化物，引起组织损伤；线粒体是肝脏缺血再灌注期间活性氧产生的重要器官。肝脏在缺血再灌注过程中，可通过黄嘌呤氧化酶途径和中性粒细胞呼吸爆发产生大量氧自由基。由于在灌注过程中，抗氧化酶活性受到抑制，造成大量氧自由基在肝组织中聚集。肝组织中聚集的氧自由基可以通过与细胞膜表明多不饱和脂肪酸结合，产生多脂肪酸过氧基。这些过氧基可以通过电子传递的级联放大效应与蛋白质、脂肪和核酸等物质反应，导致这些结构的脂质过氧化物化(LipidPeroxides,LPO)而氧化失活，引起细胞膜通透性增加直至细胞溶解死亡。LPO的代谢终产物为丙二醛MDA，MDA的含量能较好地反映体内氧自由基水平及脂质过氧化物损伤的程度，而超氧化物歧化酶(SOD)含量的高低能反映机体抗氧化的能力。细胞凋亡是一种由特定基因控制，以细胞DNA降解为特征，无明显细胞溶解的程序性细胞死亡过程。细胞凋亡则不同于坏死，坏死是以细胞膜的损害为起点，常伴有死亡细胞内容物释放而产生炎症，其性质为病理性细胞死亡。而凋亡细胞的细胞膜则功能完整并包裹细胞内容物形成凋亡小体，可被体内其它细胞吞噬，通常无细胞内容物的泄漏因而不伴有炎症，其性质为生理性细胞死亡。在形态上，凋亡细胞呈胞核皱縮，核染色质广泛浓縮、边集，胞质浓缩但细胞器仍保持结构完整，细胞膜形成多个芽突，随后分裂为一个或多个有生物膜包被的特征性凋亡小体。各种损伤因素可以通过钙离子大量内流，引发线粒体膜通透性增加和功能丧失，使其释放细胞色素C而最终导致细胞凋亡。细胞凋亡是肝细胞的死亡方式之一，过度凋亡可引起肝功能损害。多年来，用于检测凋亡细胞的主要手段有DNA电泳法、流式细胞仪法以及光镜与电镜方法等。但这些方法或不能定位或观察范围大小，而难以准确地反映细胞凋亡的现象。针对于此，1992年，Gavrieli等建立了TUNEL方法检测凋亡细胞的新途径。此种方法能结构完好地原位显示凋亡细胞，并能进行阳性细胞计数。尽管目前已有一些研究发现，少数坏死细胞晚期DNA也会发生非特异性分解而产生一定量的DNA片段，并可在TUNEL染色中着色，但坏死细胞DNA裂解发生在晚期，分解的DNA片段可进入胞浆，胞核及胞浆均可显色，据此可与凋亡细胞鉴别。细胞凋亡受基因调控，目前作用较明确的基因有Bc1-2、Fas/FasL等。Bcl-2是一种膜整合蛋白，存在于线粒体、核膜、内质网膜上，能防止多种原因引起的凋亡。其抗凋亡的作用途径包括减少磷脂酰丝氨酸生成、减轻脂质过氧化、抑制过氧化物生成、增加过氧化氢酶和SOD活性、抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspase)酶3和6、阻止钙离子内流、抑制线粒体跨膜电位破坏和阻止细胞色素C外流等。Bilbao等研究发现在缺血期通过腺病毒载体将Bcl-2基因转染给供肝可明显减轻再灌注后肝细胞的凋亡和坏死，并可减少移植术后原发性移植肝无功能的发生率。Fas/FasL是介导凋亡的细胞表面分子，其机制可能是Fas与其配体FasL结合从而转导凋亡信号进入靶细胞并激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。本研究发现苦参碱治疗组并不能显著降低FasL蛋白的表达，这就提示苦参碱抑制肝细胞凋亡与FasL蛋白表达无明显关系。Yamaraoto等认为Fas/FasL基因主要参与免疫排斥反应中的肝细胞凋亡。枯否氏细胞占肝脏非实质细胞数量的35%，其主要作用包括吞噬(如细菌、内毒素、病毒和免疫复合物等)，诱导非特异性免疫反应，抗原呈递和释放多种细胞毒性产物如细胞因子(TNF-ci，干扰素等)、一氧化氮、白三烯和蛋白酶类。在供肝冷保存期，由于肝脏处于低温、低氧状态，导致线粒体受损，能量代谢降低，ATP合成减少、分解增加，导致Ca2+内流增加，致细胞内钙超载；枯否氏细胞处于"预"激活状态。同时受体肝移植手术时，须行门静脉阻断，导致肠淤血，肠粘膜屏障受损，肠壁通透性增加，从而促使肠管内细菌内毒素进入门静脉系统。因此在门静脉血流重新开放，进入再灌注期，门静脉血中的内毒素迅速与脂多糖蛋白结合后，被枯否氏细胞俘获。可使已处于"预"激活专题的枯否氏细胞完全激活。激活的枯否氏细胞表现为胞体增大，细胞表面皱缩，突起增多、变圆，胞浆空泡化和脱颗粒，胞内出现大量的吞噬溶酶体和空泡。枯否氏细胞激活后吞噬功能增强，并且产生许多生物活性物质，如氧自由基、蛋白水解酶和多种促炎性损伤因子(如TNF-ci、PAF、LT等)。这些活性物质协同作用，损伤肝窦内皮细胞和肝细胞，引起移植肝再灌注损伤，最终可导致原发性移植肝无功能。枯否氏细胞激活后，释放大量TNF-a，其在肝脏损伤过程中起着重要介导作用。TNF-a对肝细胞有直接毒性作用，可导致肝细胞坏死和细胞内酶的释放。TNF-a作用于肝窦内皮细胞，使其上调粘附分子ICAM-1和VCAM-1，同时刺激白细胞表达CR1和CR2类趋化因子，增加白细胞与肝窦内皮细胞的粘附，导致肝窦微循环的障碍。此外，TNF-a可以直接刺激白细胞释放氧自由基，并进一步促进枯否氏细胞产生过氧化物，及释放IL-1、IL-6、IL-8等炎性损伤因子，同时激活磷脂酶A2，通过加速花生四烯酸的代谢，释放TXA2等途径加重缺血再灌注局部和全身的组织损伤。Arrii等的临床研究发现，在人类肝移植过程中，应用抗TNF-a单克隆抗体可显著减轻肝窦内皮细胞的损伤，改善肝功能，提高移植肝的存活率有关肝移植冷保存再灌注损伤机理的研究很多，其中微循环再灌注障碍日益受到重视。其发生的主要原因有(1)肝血窦内皮细胞对冷、热缺血均比肝细胞敏感，早期即可能出现不可逆损伤，同样，在再灌注期内皮细胞比肝细胞早发生致死性损伤，再灌注后内皮细胞出现肿胀、死亡及脱落，阻塞血窦；(2)再灌注后粒细胞粘附、聚积及毒性作用；(3)血小板激活因子大量生成，内皮细胞脱落后其下组织暴露引起血小板粘附，血管内凝血，产生血栓；(4)内皮素大量生成，而N0产生减少，使SEC收缩，循环阻力增加。肝血窦内皮细胞损伤及顺应性改变可致肝血窦阻塞，再灌注障碍，从而使肝组织细胞仍处于缺血状态，损伤进一步加重发展。因此，在肝移植缺血再灌注损伤过程中，保护内皮细胞和保护肝细胞同样重要，这对于移植肝脏微循环障碍，术后发生"无复流"等现象，继而导致原发性移植肝无功能的预防具有重要临床意义。HA是一类氨基葡聚糖，它由体内的间质细胞产生后，经淋巴途径到达肝脏。而SEC上有HA特异性的受体，可通过胞吞方式摄取和降解HA。故当SEC损伤时，其对内源性HA摄取量降低，血清HA浓度也就相应上升。1987年，Folkert0.Belzer博士领导的美国WISCONSIN大学实验小组成功研制了一种低温保存液-UW液，极大地延长了肝脏、肾脏、胰腺、心脏、肺和小肠等器官的保存时间，推动了世界器官移植的快速发展。UW液的成分是经乙基淀粉50克/升、乳酸(内酯)35.83克/升、KH2P043.4克/升、MgSO,,.7H201.23克/升、棉子糖17.83克/升、腺苷1.34克/升、别嘌呤醇0.136克/升、总谷胱甘肽0.922克/升、K0H5.61克/升、pH为7.4胰岛素40单位、青霉素G20万单位、地塞米松16mg。UW液的特点有(1)不使用代谢活跃的葡萄糖来维持渗透压，而用乳糖醛酸盐作为非渗透阴离子，并用棉子糖作为附加的渗透支持，用来预防因体温过低而引发的细胞水肿；(2)用谷胱甘肽、别嘌呤醇对抗氧自由基；(3)含有腺苷，可刺激ATP合成，支持能量代谢；(4)含经乙基淀粉(250KU)，用来防止细胞间隙膨胀和维持胶体渗透压；(5)以磷酸盐系统防止细胞酵中毒。临床证实UW液可显著延长器官体外活性，由此增加了可供移植的器官数量。目前，UW液及其各种UW型改良液已在国际上日益广泛应用。但是目前此类保存液处方复杂，对保存液的生产和质量控制带来非常繁琐的工作量。而且成品不利于终端消费者，因为繁琐的配置过程和质量控制，耗费大量资源同时，必定带来高昂的费用，增加患者负担。国内对肝移植缺血再灌注损伤的保护方面做了大量研究工作，从我国器官保存来说，我们尚缺乏国际上已广泛应用的类似UW、HTK这样的能保存多脏器的长效器官保存液，这将是限制我国器官移植工作进一步发展的因素。因此，器官保存工作仍需加倍努力，争取研制处方尽可能简单而且有高效、高质量的长效器官保存液。
发明内容技术问题本发明的目的是提供一种肝保护液，能有效的保护移植肝脏，又处方相对简单的肝保存液，为临床肝移植提供又一个良好保证。技术方案目前，国内已有学者参考国外文献，在HCA保存液中添加钙离子拮抗剂一异搏定，自由基清除剂一别嘌呤醇、谷胱甘肽等。但有关花生四烯酸代谢抑制剂的应用未见报告。发明人认为从保存液添加剂来说，祖国的传统医学应有一定的优势。本发明提供了一种肝保存液，每100ml该肝保存液含有1,6-二磷酸果糖78g，谷胱苷肽l2g，别嘌呤醇23g，中药成分川芎嗪0.30.5g，中药成分山莨菪碱812mg，林格氏液加至100毫升。该肝保存液还可以含有维生素E;每100ml该肝保存液含有维生素E0.20.4g。该肝保存液还可以含有青霉素；每lOOinl该肝保存液含有青霉素6001000万单位。该肝保存液还可以根据需要，加入其他传统中药成分，如丹-参提取物等。有益效果本发明公丌的肝保存液，与空白对照组有统计学意义，两治疗组(本发明组与美国UW液治疗组)没有统计学意义。为长效器官保存又提供了一个非常好的保证。山莨菪碱(Anisodamine)是我国科研人员从茄科植物唐古特莨菪中提取的生物碱，也称654，其人工合成品称654-2。山莨菪碱能对抗乙酰胆碱所致平滑肌痉挛和抑制心血管的作用，同时能解除血管痉挛，改善微循环，己被广泛用于防止休克。川芎嗪(LigusticumWallichiiFranch)据中医记载，川芎的基本作用为活血化瘀行气，药理学研究则表明，川芎嗪可扩张血管改善微循环，保护肾功能作用。自1981年起马永江等对川芎防治急性肾衰进行了一系列实验研究和初歩临床应用，证明川芎优于一般血管扩张剂，并具有钙离子拮抗剂作用，能保护肾脏的能量供应，并有利于清除代谢产物。而且，本发明肝保存液处方简单，为生产和临床节约了生产和检验成本。具体实施例方式以下实施例只是用来说明本发明的方法，而不限制本发明的范围。1、肝保存液的配置每100ml该肝保存液含有1，6-二磷酸果糖78g，谷胱苷肽12g，别嘌呤醇23g，中药成分川芎嗪0.30.5g，中药成分山莨菪碱812mg，林格氏液加至100毫升。治疗组Zw肝保存液(本发明肝保存液)成份与含量1，6-二磷酸果糖7.5g、谷胱苷肽1.5g、别嘌呤醇2.5g、川芎嗪0.4g、山莨菪碱10mg。按处方称量，用林格氏液溶解至100ml过滤即得。治疗组Uw液市场购买。实验对照液林格氏液。2、为探讨ZW肝保护液对供肝冷保存再灌注损伤的保护作用，本实验采用供肝保存12小时后，大鼠原位肝移植冷保存再灌注损伤模型。分为A组(实验对照组)；B组(UW液治疗组)；C组(ZW肝保护液治疗组)。每组在术后规定时间点(4、7d)断尾获取外周血，第14d牺牲动物获取外周血和肝脏检测肝功能；TNF-a活性；内毒素；血清透明质酸；血N02-/N03-;肝脏病理；肝细胞超微结构；肝脏MDA和SOD;肝脏ATP酶；肝脏细胞原位凋亡(TUNEL)的免疫组化检测；肝组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的免疫组化检测。三组间的ALT相比较(P<0.05)有统计学意义；三组间的AST相比较(P<0.05)有统计学意义；三组间的LDH相比较(P<0.05)有统计学意义。与实验对照组各个时间点的血清TNF-a活性相比较，均下降，(P<0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血清TNF-a活性相比较无有统计学意义(P>0.05)。两组治疗组移植术后4d血中内毒素达到高峰，与实验对照组各个时间点的血中内毒素相比较，均下降，(P<0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血中内毒素相比较无统计学意义(p〉0.05)。两组治疗组移植术后7d血清HA值达到高峰，与实验对照组各个时间点的血清HA值相比较，均下降，(P〈0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血清TNF-a活性相比较无有统计学意义(P〉0.05)。两组治疗组移植术后4d血清N02-/N03-值均下降，但与实验对照组各个时间点的血清HA值相比较，均上升，(P<0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血清N02-/N03-值相比较无有统计学意义(P>0.05)。UW液和ZW液治疗组肝小叶结构基本正常，肝细胞轻度空泡变性，汇管区炎性细胞浸润少，肝窦扩张，肝窦内皮细胞扁平，基本完整，两治疗组肝脏病理变化程度类似。两组治疗组肝细胞核圆居中，线粒体和粗面内质网结构清晰，肝窦内皮细胞基本完整，未见明显肿胀。与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后MdMDA值增高(p〈0.05)，而两治疗组间比较无显著差异，与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后14dS0D值下降(p〈0.05)，而两治疗组间比较无显著差异。UW液和ZW液治疗组和对照组移植术后14dNa+-K+-ATPase和Ca、ATPas值均下降，与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后14dNa+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值下降(p〈0.05)，而两治疗组间比较无显著差异。Zw肝保存液、Uw液、对照液进行试验，实验数据及结果如下(1).血清ALT、AST、LDH由表1可见，三组间的ALT相比较，F二10.46(P<0.05)有统计学意义；三组间的AST相比较，F=32.73(P〈0.05)有统计学意义；三组间的LDH相比较，F=95.42(P〈0.05)有统计学意义。表1三组大鼠原位肝移植术后，4、7、14天的ALT的变化氺(n=6,p<0.05，JT士s,U/L)DIGP0D4P0D7POD14A770.17±37.58690±51.00599.83±15.63B736.17±129.09591.17±92.19434.33±53.18C709±85.13583.54±6.57494.17±61.54注*F=10.46(p〈0.01)，A，B，C比较，有统计学意义(p<0.05)①PODn表示术后天数②DIG(divideintogroups)表示术后分组(下同)表2三组大鼠原位肝移植术后，4、7、14天的AST的变化"『6,p〈0.05,7±s,U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*F=95.42(p〈0.05),A，B，C比较，有统计学意义(p<0.05)(2).TNF-a活性测定实验对照组血清TNF-a活性在鼠肝移植术后4d快速上升到(8.14±0.57U/L),移植术后7d上升达到(9.87±0.47U/L)高峰，移植术后14d又至(4.11±0,35U/L)水平；UW液治疗组血清TNF-a活性在鼠肝移植术后4d快速上升到(3.04±0.37U/L)，移植术后7d上升达到(1.77±0.27U/L)高峰，移植术后14d又至(1.02±0.23U/L)水平；ZW肝保存液治疗组血清TNF-a活性在鼠肝移植术后4d快速上升到(3.54±0.43U/L)，移植术后7d上升达到(2.01±0.11U/L)高峰，移植术后14d又降至(1.32±0.43U/L)水平。两组治疗组移植术后4d血清TNF-a活性达到高峰，与实验对照组各个时间点的血清TNF-a活性相比较，均下降，(P〈0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血清TNF-a活性相比较无有统计学意义(P〈0.05)'见表4。表4各组大鼠原位肝移植术后4d、7d、14d的血清TNF-a活性变化*(n=6，p<0.05，X±s，U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*F=7.86(p〈0.05),A，B，C比较，有统计学意义(p<0.05)(3).内毒素测定实验对照组血中内毒素在鼠肝移植术后4d快速上升到(0.94±0.17EU/ml)高峰，移植术后7d上升到(0.81±0.21EU/ml)，移植术后14d又降至(0.41±0.55EU/ml)水平；UW液治疗组血中内毒素在鼠肝移植术后4d快速上升到(0.64±0.23EU/ml)，移植术后7d上升达到(0.27±0.17EU/ml)高峰，移植术后14d又至(0.22±0.43EU/ml)水平；ZW液治疗组血中内毒素在鼠肝移植术后4d快速上升到(0.54±0.63EU/ml)，移植术后7d上升达到(0.51±0.51EU/ml)高峰，移植术后14d又至(0.32±0.23EU/ml)水平。两组治疗组移植术后4d血中内毒素达到高峰，与实验对照组各个时间点的血中内毒素相比较，均下降，(P<0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血中内毒素相比较无统计学意义(P<0.05)，见表5。表5各组大鼠原位肝移植术后4d、7d、14d的血中内毒素变化伞(n=6,p〈0.05,X±s,EU/ml)DIGP0D4P0D7POD14A0.94±0.170.81±0.210.41±0.25B0.64±0.230.27±0.170.22±0.13C0.54±0.330.51±0.210.32±0.13注*F=8.14(p<0.05)，A,B，D比较,有统计学意义(p<0.05)(4).血清透明质酸(HyaluronicAcid，HA)测定实验对照组血清HA值在鼠肝移植术后4d快速上升到(1518.14±100.57ng/ml)，移植术后7d上升达到(1819.87±120.47ng/ml)高峰，移植术后14d又至(1664.11±114.35ng/ml)水平；UW液治疗组血清HA值在鼠肝移植术后4d快速上升到(1003.04±111.37ng/ml)，移植术后7d上升达到(1441.77±113.27ng/ml)高峰，移植术后14d又至(1121.02±121.23ng/ml)水平；ZW液治疗组血清HA值在鼠肝移植术后4d快速上升到(1073.54±97.43ng/ml)，移植术后7d上升达到(1312.01±100.11ng/ml)高峰，移植术后14d又降至(1111.32±120.43ng/ml)水平。两组治疗组移植术后7d血清HA值达到高峰，与实验对照组各个时间点的血清HA值相比较，均下降，(P<0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血清TNF-a活性相比较无有统计学意义(P<0.05)，见表6。表6各組大鼠原位肝移植术后4d、7d、14d的血中HA的变化本(n=6，p<0.05，亍士s,ng/ml)DIGPOD4P0D7P0D14A1518.14±100.571819.87±120.471664.11±114.35B1003.04±111.371441.77±113.271121.02±121.23C1073.54±97.431312.01±100.111111.32±120.43注*F=38.24(p<0.01)，A,B，D比较，有统计学意义(p<0.05)(5).血N0VN(T测定实验对照组血清N02—/NCT值在鼠肝移植术后4d快速下降到(28.0±2.lumol/L)，移植术后7d下降达到(19.8±4.7uraol/L)高峰，移植术后14d又升至(34.1±3.5umol/L)水平;UW液治疗组血清NO'VN(T值在鼠肝移植术后4d快速下降到(33.4±3.7umol/L)，移植术后7d上升达到(41.7±2.7umol/L)，移植术后14d又升至(61.2±2.3umol/L)水平；ZW液治疗组血清N0VN0'-值在鼠肝移植术后4d快速下降到(35.4±4.3画1/L)，移植术后7d上升达到(52.l士l.lumol/L)，移植术后14d又升降至(63.2±4.3umol/L)水平。两组治疗组移植术后4d血清N(T/N(T值均下降，但与实验对照组各个时间点的血清HA值相比较，均上升，(P<0.05)有统计学意义，两组治疗组术后血清NOVN(T值相比较无有统计学意义(P<0.05),见表7。表7各组大鼠原位肝移植术后4d、7d、14d的血中N02/N03变化Wr^6,p〈0.05，X±s,umol/L)DIGPOD4P0D7POD14A28.0±2,119.8±4.734.1±3.5B33.4±3.741.7±2.761.2±2.3C35.4±4.352.1±1.163.2±4.3注*f=9.44(p<0.05)，A，B，D比较，有统计学意义(p<0.05)(6).肝脏病理检测移植术后14d肝脏病理检测，与W液和ZW液治疗组相比较，实验对照组肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀，空泡变性，偶见以小叶中央静脉为中心的灶状凝固性坏死，汇管区大量炎性细胞浸润，肝窦内皮细胞受损肿胀，脱落入肝窦，kupffer细胞肥大，呈三角形或不规则形。UW液和ZW液治疗组肝小叶结构基本正常，肝细胞轻度空泡变性，汇管区炎性细胞浸润少，肝窦扩张，肝窦内皮细胞扁平，基本完整，两治疗组肝脏病理变化程度类似。(7).肝细胞超微结构观察移植术后14d电镜观察与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组肝细胞核皱縮，染色质浓集，线粒体肿胀，嵴结构不清，粗面内质网扩大成指状，kupffer细胞明显活跃，肝窦内皮细胞不连续，高度肿胀；治疗组肝细胞核圆居中，线粒体和粗面内质网结构清晰，肝窦内皮细胞基本完整，未见明显肿胀；枯否氏细胞超微结构观察实验对照组可见枯否氏细胞高度活跃，细胞突起增多，胞浆增宽，胞浆内可见许多吞噬溶酶体、透明的空泡和颗粒，细胞核形态不规则。UW液治疗组可见枯否氏细胞呈圆形，突起减少，细胞核规则，胞浆内容物减少。ZW液治疗组枯否氏细胞超微结构改变与UW液治疗组相似；枯否氏细胞超微结构观察实验对照组，SEC明显肿胀，核酸不规整，可见核固縮、聚集、着边的凋亡SEC，线粒体水肿、部分空泡化，粗面内质网扩张，可见髓鞘样结构。包膜部分断裂，失去胞突，内皮细胞向血窦腔内突出，并可脱落入肝血窦腔内。血窦腔内可见大量中性粒细胞、淋巴细胞等浸润。ZW液治疗组，SEC核膜稍显不规整，伸展部变薄，但覆盖完整。内皮细胞轻度水肿，溶酶体增多，粗面内质网无扩张，吞饮小泡丰富，SEC损伤明显减轻。血窦腔内炎性细胞浸润的程度和范围也明显轻于对照组。UW液治疗组，SEC损伤仍存在，其超微结构改变与ZW液治疗组类似。(8).肝脏MDA和SOD的检测肝组织MDA测定实验对照组肝组织中MDA在鼠肝移植术后14d上升至(n=6，I±s,3.94±0.17nmol/mgprot);UW液治疗组肝组织中MDA在鼠肝移植术后14d上升至(n=6，X±s，L64±0.23nmol/mgprot);ZW液治疗组肝组织中MDA在鼠肝移植术后14d上升至(n=6，J±s，1.54±0.63nmol/mgprot)，UW液和ZW液治疗组和对照组移植术后14dMDA值均增高，与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后14dMDA值增高(p<0.01)，而两治疗组间比较无显著差异，见表8。表8各组大鼠原位肝移植术后14肝组织中MDA变化(JT±s)DIGnMDA(nmol/mgprot)A63.94±0.17B61,64±0.23C61.54±0.63注A组与B、C组比较有统计学差异(p<0.05)，B、C之间无显著差异。肝组织SOD测定实验对照组肝组织中SOD在鼠肝移植术后14d下降至(n=6,±s,14.34±0.21U/mgprot);UW液治疗组肝组织中SOD在鼠肝移植术后14d下降至(n=6,Z±s,21.17±0.25U/mgprot);ZW液治疗组肝组织中SOD在鼠肝移植术后14d下降至(n=6，I±s，23.05±0.43U/mgprot)，UW液和ZW液治疗组和对照组移植术后各14dSOD值均下降，与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后14dSOD值下降(p〈0.05)，而两治疗组间比较无显著差异，见表9。表9各组大鼠原位肝移植术后i4肝组织中sod变化(；r±s)DIGnSOD(U/mgprot)A614.34±0.21B621.17±0.25C623.05土0.43注A组与B、C组比较有统计学差异(P<0.05)，B、C之间无显著差异。(9).肝脏ATP酶的测定肝组织ATP酶测定实验对照组肝组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值在鼠肝移植术后14d下降至(n=6,X±s，2.134±0.121umol/mgprot和3.012±0.lllumol/mgprot);UW液治疗组肝组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值在鼠肝移植术后14d下降至(n=6，I±s,3.117±0.151umol/mgprot和4.917±0.171umol/mgprot);ZW液治疗组肝组织中Na+-K+-ATPase和Ca2'-ATPas值在鼠肝移植术后14d下降至(n=6，I±s,3.213±0.145umol/mgprot和4.777±0.151umol/mgprot)，UW液和ZW液治疗组和对照组移植术后14dNa+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值均下降，与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后14dNa+-K+-ATPase和0&2+4133值下降(p<0.05)，而两治疗组间比较无显著差异，见表3-10，3-11。两治疗组凋亡的肝细胞明显减少，其AI均显著降低(p〈0.05)，而两治疗组AI相比无显著差异。表10各组大鼠原位肝移植术后14肝组织中Na-K'-ATPase变化(f±s)DIGnNa+-K+-ATPase(mol/mgprot)A6B6C62.134±0.1213.117±0.1513.213±0.145::A组与B、C组比较有统计学差异(p<0.05)，B、C之间无显著差异。表11各组大鼠原位肝移植术后14肝组织中Ca2-ATPas变化(了±s)DIGnNa+-K+-ATPase(mol/mgprot)A*6B6C63.012±0.Ill4.917±0.1714.777±0.151注A组与B、C组比较有统计学差异(p〈0.05),B、C之间无显著差异。(10).肝脏细胞原位凋亡(TUNEL)的免疫组化检测UW液和ZW液治疗组和对照组移植术后14d均见肝实质细胞凋亡，与UW液和ZW液治疗组相比较，实验对照组移植术后14d可见较多散在的肝实质细胞凋亡，亦可见少量染色阳性的肝窦内皮细胞。移植术后14dUW液、ZW液治疗组和对照组的AI为(n=6，J±s，19.87±2.45,4.56±0.78,4.75±065)，两治疗组凋亡的肝细胞明显减少，其AI均显著降低(p〈0.05)，而两治疗组AI相比无显著差异，见表12。表12各组大鼠原位肝移植术后14肝组织中AI变(±s)DIGnAIA619.87±2.45B64.56±0.78C64.75±065注A虹与B、C组比较有统计学差异(p<0.05)，B、C之间无显著差异。3、又几种肝保存液的配置(1)成份与含量1，6-二磷酸果糖7g、谷胱苷肽lg、别嘌呤醇2g、川芎嗪0.3g、山莨菪碱8mg、维生素E0.20.4g(—般使用O.3g)。按处方称量，用林格氏液溶解至100ml过滤即得。维生素E具有抗氧化作用，与多种酶一起构成体内抗氧化系统，保护着细胞骨架、蛋白质中巯基、细胞内核酸等免受自由基的攻击。因此，维生素E在维护免疫、神经、心血管正常运行，抗动脉粥样硬化、延缓衰老和抗癌上有一定作用。与此同时，维生素E还有一定的免疫功能，可以促进T淋巴细胞增殖和单核细胞分泌细胞因子。在本发明保存液处方中加入维生素E，使得本发明效果更好。(2)成份与含量1，6-二磷酸果糖8g、谷胱苷肽2g、别嘌呤醇3g、川芎嗪0.5g、山莨菪碱12mg、青霉素6001000万单位(一般使用800力'单位)。按处方称量，用林格氏液溶解至100ml过滤即得。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是e-内酰胺类中一大类抗生素的总称。青霉素类抗生素的毒性很小，由于e-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，在一般用量下，其毒性不甚明显.是化疗指数最大的抗生素。所以在本发明中加入该物质，能弥补一些不足。(3)成份与含量1,6-二磷酸果糖7.5g、谷胱苷肽1.5g、别嘌呤醇2.5g、川芎嗪0.4g、山莨菪碱10rag、维生素E0.3g、青霉素800万。按处方称量，用林格氏液溶解至100ml过滤即得。同理，在本发明同时再加入维生素E和青霉素，必使效果更好。权利要求1、一种肝保存液，其特征是每100ml该肝保存液含有1，6-二磷酸果糖7～8g，谷胱苷肽1～2g，别嘌呤醇2～3g，中药成分川芎嗪0.3～0.5g，中药成分山莨菪碱8～12mg，林格氏液加至100毫升。2、根据权利要求1所述的一种肝保存液，其特征在于每100ml该肝保存液含有维生素E0.20.4g。3、根据权利要求1或2所述的一种肝保存液，其特征在于每100ml该肝保存液含有青霉素6001000万单位。全文摘要本发明公开了一种肝保护液，每100ml该肝保存液含有1，6-二磷酸果糖7～8g，谷胱苷肽1～2g，别嘌呤醇2～3g，中药成分川芎嗪0.3～0.5g，中药成分山莨菪碱8～12mg，林格氏液加至100毫升。通过大量的实验证明本发明公开的肝保存液，与试验对照组有统计学意义，两治疗组(本发明组与美国UW液治疗组)没有统计学意义。本发明为长效肝器官保存又提供了一个非常好的保证，而且处方简单，为生产和临床应用节约了生产和检验成本。文档编号A01N1/02GK101627753SQ200910184378公开日2010年1月20日申请日期2009年8月19日优先权日2009年8月19日发明者张业伟申请人:江苏省肿瘤医院