专利名称：一种兰科植物试管内授粉及结实的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种组织培养方法，尤其涉及一种兰科植物试管内授粉及结实的方法。
背景技术：
兰科植物(兰花)具有巨大的经济价值，是世界花卉业的重要组成部分，同时许多种类还具有很高的药用价值。其中常用的无性繁殖方法是分株扩繁，用种子繁殖的育种周期长，一般需要4-5年。而且，一般地，兰花的新品种培育工作需要进行反复的杂交、回交和自交，才能实现育种目的，选育出优良的新品种。采用常规办法，这一育种过程一般要用十几年时间。而兰花的试管内开花、授粉及结实可很好地解决这一问题。有了促使兰花试管内开花及人工授粉的方法，人们就可以在试管内让子一代开花，并且在试管内进行自交授粉或子一代植株之间相互授粉，培养出种子。这些种子无需消毒直接播种于培养基上，获得子二代，再诱导出花，即可从子二代中间选择想要的品种。这一过程比常规方法，至少可以节省两个从瓶苗到开花的栽培周期。这是一个全新的应用研究领域，对于兰花的产业化生产具有重要的意义。目前，国内外关于石斛兰、寒兰、建兰、春兰等的试管开花有过报道，但一般仅限于对试管内开花的调控，而对试管内开花的花朵进行人工授粉，并培育子代的报道极少。
发明内容
本发明的目的在于针对兰花常规育种周期长的问题，提供一套离体培养中调控植物开花、人工授粉及育性种子产生的方法，此技术可有效地缩短育种周期，提高育种效率。为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案一种兰科植物试管内授粉及结实的方法，包括如下步骤(1)将成熟的兰科植物果实经清洗、消毒后剖开，取蒴果内种子撒在MS培养基上进行培养；(2)待培养形成可见的小苗后，将小苗转移至MS+0. 5mg -Γ^-ΒΑ+Ο. Img -L^1NAA的
培养基上进行继代培养，60天后获得组培苗；(3)将组培苗移到 MS+0. 5mg · L_16-BA+0. 05mg · I^TDZ+O. Img · I^NAA+IO^椰子水 +500mg · Γ1酵母液+50mg · L^VC的培养基上进行培养，可诱导产生具有较多花芽的花序， 将具有花序的组培苗再转入MS+10%椰子水+500mg · L—1酵母液+50mg · L^1VC的无激素培养基上，花芽可正常开花，花完全开放后3-4天，用镊子取出花中的花粉块，进行自花授粉或异花授粉；(4)将人工授粉后的试管苗重新放回培养室中培养，培养后获得子一代果实，再行无菌播种，即可得到子二代植株。步骤(1)中的消毒过程为用体积比为75%乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍， 用重量比为0. 的HgCl2中浸泡15-20分钟，无菌水冲洗3-4次。
步骤(1)培养温度为25士2°C，光照光强为2500 3000Lx，光照时间为12h/d。上述所有的操作均处于无菌环境下进行。所述的兰科植物优选为铁皮石斛。本发明有效地缩短了兰科植物尤其是铁皮石斛的育种周期，可将自然状态下4-5 年的育种周期缩短到1年之内，培养时间短，成本低，有利于缩短兰花的育种周期，提高育种效率。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例本实施例以兰科植物铁皮石斛为例，来说明兰科植物试管内授粉及结实的方法，但本发明并不为实施例所限。材料为铁皮石斛成熟而未开裂的蒴果。将采回来的果子去除果柄，用自来水冲洗干净，然后在无菌超净工作台上用体积比为75%乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍，用重量比为0. 1 %的HgCl2中浸泡15-20分钟，无菌水冲洗3-4遍。将洗净的蒴果置灭菌滤纸上吸干水分。在超净工作台上用无菌解剖刀将蒴果的前后两端各Icm处切下，中间段纵向切开，将蒴果内干燥的粉末状的种子均勻撒在MS培养基上。培养温度为25士2°C，光照光强为 2500 3000Lx，光照时间为12h/d。IOd后部分种胚开始膨大、变绿，20d后少量种胚开始形成绿色的原球茎，30d后形成大量的原球茎，并且开始出现叶、根的分化。60d后形成可见的小苗。将小苗转移到 MS+0. 5mg -Γ^-ΒΑ+Ο. Img -T1NAA的培养基上进行继代培养，60d后可获得大量完整的长约 4-5cm的组培苗。将组培苗移到MS+0. 5mg · L_16-BA+0. 05mg · I^TDZ+O. Img · L^1NAA+10 % 椰子水 +500mg · Γ1酵母液+50mg · L^VC的培养基上进行培养，可诱导产生具有较多花芽的花序， 将具有花序的组培苗再转入MS+10%椰子水+500mg · L—1酵母液+50mg · L^1VC的无激素培养基上，花芽可正常开花。花完全开放后3-4天，在超净工作台上用镊子轻轻取下蕊柱顶端的花药帽，然后取出下面的花粉块，小心放入柱头穴中，进行自花授粉或异花授粉。将人工授粉后的试管苗重新放回培养室中培养。授粉15d后，子房开始膨大发育， 120d后果皮发黄成熟，采下子一代果实，无需对果实进行灭菌处理，在超净工作台中用刀片切开果实，将种子播种在培养基上。2个月后即可得到子二代植株。本发明有效地缩短了兰科植物尤其是铁皮石斛的育种周期，可将自然状态下4-5 年的育种周期缩短到1年之内，培养时间短，成本低，有利于缩短兰花的育种周期，提高育种效率。
权利要求
1.一种兰科植物试管内授粉及结实的方法，其特征在于包括如下步骤(1)将成熟的兰科植物果实经清洗、消毒后剖开，取蒴果内种子撒在MS培养基上进行培养；(2)待培养形成可见的小苗后，将小苗转移至MS+0.5mg · L-1 6-BA +0. Img · L,AA的培养基上进行继代培养，60天后获得组培苗；(3)将组培苗移至IjMS+0. 5mg · Γ1 6-ΒΑ+0. 05mg · I^TDZ+O. Img · L^1NAA+10 % 椰子水 +500mg · Γ1酵母液+50mg · L^VC的培养基上进行培养，可诱导产生具有较多花芽的花序， 将具有花序的组培苗再转入MS+10%椰子水+500mg · L—1酵母液+50mg · L^1VC的无激素培养基上，花芽可正常开花，花完全开放后3-4天，用镊子取出花中的花粉块，进行自花授粉或异花授粉；(4)将人工授粉后的试管苗重新放回培养室中培养，培养后获得子一代果实，再行无菌播种，即可得到子二代植株。
2.根据权利要求1所述的一种兰科植物试管内授粉及结实的方法，其特征在于步骤 (1)中的消毒过程为用体积比为75%乙醇表面消毒30秒，无菌水冲洗2遍，用重量比为 0. l%m HgCl2中浸泡15-20分钟，无菌水冲洗3-4次。
3.根据权利要求1所述的一种兰科植物试管内授粉及结实的方法，其特征在于步骤 (1)培养温度为25士2°C，光照光强为2500 3000Lx，光照时间为12h/d。
4.根据权利要求1 3任何一项所述的一种兰科植物试管内授粉及结实的方法，其特征在于所有的操作均处于无菌环境下进行。
5.根据权利要求1 3任何一项所述的一种兰科植物试管内授粉及结实的方法，其特征在于所述的兰科植物为铁皮石斛。
全文摘要
本发明涉及涉及一种兰科植物试管内授粉及结实的方法。本发明通过兰科植物组织培养的方法得到子二代植株，有效地缩短了兰科植物尤其是铁皮石斛的育种周期，可将自然状态下4-5年的育种周期缩短到1年之内，培养时间短，成本低，有利于缩短兰花的育种周期，提高育种效率。
文档编号A01H4/00GK102239801SQ201010172180
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者欧阳彤, 王彩霞, 田敏 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所