专利名称：一种石斑鱼类精子的冷冻保存方法
技术领域：
本发明涉及精子保存领域，具体涉及一种石斑鱼类精子的冷冻保存方法。
背景技术：
石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类，肉质鲜美，营养丰富，经济价值很高。我国广 东、海南、福建等省已开展石斑鱼养殖，一些种类如鞍带石斑鱼、斜带石斑鱼等人工养殖迅 速普及和推广，成为南方沿海重要海水养殖种类。石斑鱼类具有“先雌后雄”的性转化现象，为雌雄同体雌性先熟鱼类，高龄鱼(3-6 龄)才性转换变为雄鱼。因此，在生产实践中雄鱼来源较为困难，且雌、雄亲鱼性成熟不同 步，这不仅制约了石斑鱼的产量，也损害了养殖农户的利益。采用超低温冷冻保存精液技术 是解决上述难题有效途径，收集成熟雄鱼的精液超低温冷冻长期保存，需要时(雄鱼不足或 性成熟不同步)拿出来进行人工授精。鱼类在形态构造、繁殖习性以及精子的生理特性等差异很大，使得不同鱼类精子 冷冻保存最佳条件具有明显的种特异性(因种而异)。目前我国在鱼类精子冷冻保存的工作 主要集中在淡水鱼类(“四大家鱼”等)，海水鱼类研究起步较晚，且主要是针对冷水性海水 鱼类(鲆鲽类和大黄鱼等)，南海热带海水鱼类(如石斑鱼类)精子超低温冷冻保存是我国亟 待重点开拓和发展的区域，以满足南方海水鱼类养殖和遗传育种行业的迫切需求。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的冷冻保存石斑鱼类精子技术中存在的不足，提供一 种简单易行，冷冻保存效果好的石斑鱼类精子冷冻保存方法。本发明目的通过以下技术方案予以实现
一种石斑鱼类精子的冷冻保存方法，包括如下步骤采精，镜检，将石斑鱼类的精液与 抗冻剂混合，冷冻；其中，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终浓度 为10 14%。作为一种优选方案，上述石斑鱼类的冷冻保存方法包括如下步骤
(1)采精用丁香酚麻醉性成熟雄石斑鱼，擦干鱼体，避免精子与海水接触，轻压腹部收 集精液于冻存管中；
(2)镜检显微镜检测精液，精子活力在80%以上时进行冷冻保存；
(3)将精液与抗冻剂混合，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终 浓度为10 14% ；
(4)冷冻将装有混合好的精液和抗冻剂的冻存管在4°C下平衡15min，在液氮面上方 6cm平衡lOmin，再在液氮面上平衡5min，最后将冻存管沉入液氮内保存。作为一种优选方案，上述冷冻保存方法中，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液， 添加二甲基亚砜至终浓度为10%。作为一种优选方案，上述冷冻保存方法中，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终浓度为12%。作为一种优选方案，上述冷冻保存方法中，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液， 添加二甲基亚砜至终浓度为14%。作为一种优选方案，上述冷冻保存方法中，所述海水鱼类的精液与抗冻剂的体积 比为1:1。作为一种优选方案，上述冷冻保存方法中，所述平衡盐溶液为Hank’ s溶液， 其 pH 值为 7. 2 7. 4，每升 Hank，s 溶液中，含有 8. 00gNaCl、0. 40gKCl、0. 14gCaCl2、
0.20gMgS04 7H20、0. 06gNa2HP04 H20、0. 06gKH2P04、0. 35gNaHC0s 和 1. OOg 葡萄糖。本发明冷冻保存方法选用了平衡盐溶液和二甲基亚砜混合作为抗冻剂，用于保存 石斑鱼类精子的效果最佳。在冷冻保存之后，需要解冻的时候，解冻步骤如下将冻存管从液氮容器中取出后 立即放入40°C水浴1. 5min。解冻后可以进行精子活力检测，利用计数机辅助精子分析系统(Computer-assistedspermanalysis, CASA)检测解冻精子的活力。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(1)本发明冷冻保存方法效果显著，利用本发明方法对目前我国最重要的三种石斑鱼 养殖种类(斜带石斑鱼、鞍带石斑鱼和褐点石斑鱼)进行精子冷冻保存，解冻后精子活力均 在90%以上；
(2)本发明冷冻保存方法简单易行，抗冻剂由Hank’s液和二甲基亚砜两种试剂配制而 成，这两个试剂容易购得，价格便宜，冷冻和解冻步骤操作简单，无需程序降温仪等贵重仪
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具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1斜带石斑鱼精子超低温冷冻保存
1.采精和镜检用丁香酚麻醉斜带石斑鱼性成熟雄鱼，擦干鱼体避免精子与海水接 触，轻压腹部收集精液于0. 2ml冻存管中。显微镜检测活力在80%以上的即可冷冻保存。2.抗冻剂的配制以常用的平衡盐溶液Hank’ s为母液，添加二甲亚砜(DMS0)至 终浓度10%。3.稀释比将精液同抗冻剂混合，两者的体积比为1 :1。4.冷冻步骤将装有混合好精液的冻存管在4°C下平衡15min，然后在液氮面上方 6cm，平衡lOmin ；然后在液氮面上平衡5min ；最后直接将装有精液的冻存管沉入液氮内保存。5.解冻步骤冻精解冻时，应在冻存管拿出液氮容器后立即放入40°C水浴
1.5min。6.精子活力检测利用计数机辅助精子分析系统检测解冻后斜带石斑鱼精子的 活力为97. 95%。实施例2鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存
41.采精和镜检用丁香酚麻醉鞍带石斑鱼性成熟雄鱼，擦干鱼体避免精子与海水接 触，轻压腹部收集精液于0. 2ml冻存管中。显微镜检测活力在80%以上的即可冷冻保存。2.抗冻剂的配制以常用的平衡盐溶液Hank’ s为母液，添加二甲亚砜(DMS0)至 终浓度12%。3.稀释比将精液同抗冻剂混合，两者的体积比为1 :1。4.冷冻步骤将装有混合好精液的冻存管在4°C下平衡15min，然后在液氮面上方 6cm，平衡lOmin ；然后在液氮面上平衡5min ；最后直接将装有精液的冻存管沉入液氮内保存。5.解冻步骤冻精解冻时，应在冻存管拿出液氮容器后立即放入40°C水浴1. 5分钟。6.精子活力检测利用计数机辅助精子分析系统检测解冻后鞍带石斑鱼精子的 活力为90. 82%。实施例3褐点石斑鱼精子超低温冷冻保存
1.采精和镜检用丁香酚麻醉褐点石斑鱼性成熟雄鱼，擦干鱼体避免精子与海水接 触，轻压腹部收集精液于0. 2ml冻存管中。显微镜检测活力在80%以上的即可冷冻保存。2.抗冻剂的配制以常用的平衡盐溶液Hank’ s为母液，添加二甲亚砜(DMS0)至 终浓度14%。3.稀释比将精液同抗冻剂混合，两者的体积比为1 :1。4.冷冻步骤将装有混合好精液的冻存管在4°C下平衡15min，然后在液氮面上方 6cm，平衡lOmin ；然后在液氮面上平衡5min ；最后直接将装有精液的冻存管沉入液氮内保存。5.解冻步骤冻精解冻时，应在冻存管拿出液氮容器后立即放入40°C水浴1. 5分钟。6.精子活力检测利用计数机辅助精子分析系统检测解冻后褐点石斑鱼精子的 活力为94. 43%。
权利要求
一种石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述保存方法包括如下步骤采精，镜检，将石斑鱼类的精液与抗冻剂混合，冷冻；其中，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终浓度为10~14体积%。
2.根据权利要求1所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述方法包括如 下步骤(1)采精用丁香酚麻醉性成熟雄石斑鱼，擦干鱼体，避免精子与海水接触，轻压腹部收 集精液于冻存管中；(2)镜检显微镜检测精液，精子活力在80%以上时进行冷冻保存；(3)将精液与抗冻剂混合，所述抗冻剂是以平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终 浓度为10 14% ；(4)冷冻将装有混合好的精液和抗冻剂的冻存管在4°C下平衡15min，在液氮面上方 6cm平衡lOmin，再在液氮面上平衡5min，最后将冻存管沉入液氮内保存。
3.根据权利要求2所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述抗冻剂是以 平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终浓度为10%。
4.根据权利要求2所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述抗冻剂是以 平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终浓度为12%。
5.根据权利要求2所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述抗冻剂是以 平衡盐溶液作为母液，添加二甲基亚砜至终浓度为14%。
6.根据权利要求2所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述石斑鱼类的 精液与抗冻剂的体积比为1:1。
7.根据权利要求2所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述平衡盐溶液 为Hank’ s溶液。
8.根据权利要求7所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于所述Hank’s溶 液的PH值为7. 2 7. 4。
9.根据权利要求7所述的石斑鱼类精子的冷冻保存方法，其特征在于每升Hank’s 溶液中，含有 8. OOgNaCUO. 40gKCl、0. HgCaCl2,0. 20gMgS04 · 7Η20、0· 06gNa2HP04 · H2O, 0. 06gKH2P04、0. 35gNaHC03 和 1. OOg 葡萄糖。
全文摘要
本发明公开了一种石斑鱼类精子的冷冻保存方法。本发明石斑鱼类精子的冷冻保存方法包括如下步骤采精，镜检，将精液和抗冻剂混合，冷冻。本发明冷冻保存方法简单易行，效果显著，冷冻保存效果好，用本发明方法保存我国水产养殖中最重要的石斑鱼精子，解冻后的活力均大于90%，有效解决了石斑鱼养殖面临的雄鱼不足和雌雄亲鱼性成熟不同步等瓶颈问题。
文档编号A01N1/02GK101874483SQ201010249028
公开日2010年11月3日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者刘晓春, 张勇, 张海发, 林浩然, 范斌, 蒙子宁 申请人:中山大学