专利名称：龙趸精子超低温冷冻保存应用方法
技术领域：
本发明属于鱼类低温生物学及鱼类精子超低温冷冻保存技术领域，具体涉及ー种龙趸精子超低温冷冻保存方法。
背景技术：
龙冤(EpinephelusIanceolatus),属S卢形目(Perciformes)、酯科(Serranidae)、石斑鱼属(Epinephalus)，为暖水性、中下层珊瑚礁鱼类，生长速度快，I龄鱼可生长到
I.5-3. Okg, 2龄生长到5-6kg,最大可以成长至约I. 7m, 440kg,是石斑鱼类中体型最大者，故也被称为“斑王”。分布于印度洋非洲东岸至太平洋中部密克罗尼西亚，南至澳大利亚，中 国产于南海(南沙群岛)海域，但数量稀少。龙趸人工养殖始于上世纪末，人工繁殖和苗种培育技术尚不成熟，人工养殖苗种数量不足，限制了鞍带石斑鱼养殖的发展。由于龙趸具有生长快的优点，对于开发石斑鱼优良遗传资源，培育生长快养殖新品种，提高养殖效益具有重要的意义。但是龙趸具有雌雄同体，雌性先熟的特点，同一群体中只有年龄最大，个体最大的鱼才性转化为雄性。这ー特性给龙趸的人工繁殖、生产和杂交育种造成一定的困难，因此研究龙趸精子超低温冷冻保存技术，可以有效的解决为ー问题。目前国内外仅在环境因素对龙趸精子活力影响方面进行了研究(广东省大亚湾水产实验中心，梁伟峰等，2009);但对龙趸精子超低温冷冻保存，并利用冷冻精子进行杂交育苗及育种方面的研究，还未见报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种龙趸精子超低温冷冻保存方法，以解决南北方石斑鱼杂交中，雌雄鱼成熟不同步、养殖地理隔离较大，南方鱼类在北方养殖困难等问题，以及龙趸精子冷冻保存成活率低，难于在生产中大量应用等问题。技术方案本发明是通过以下技术方案实现的I、精液的采集在繁埴季节人工采集成熟精液,利用50ppm 丁香酹麻醉龙冤,人工挤压腹部流出乳白色精液，利用注射器吸取精液，防止尿液和海水混入，将采集的精液注入IOOml玻璃瓶，将收集精液的玻璃瓶放置在有冰块的保温盒中；2、精子活力检测醮取少许精子涂在载玻片上，滴加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力，活力达到90%以上可以进行冷冻保存；3、冷冻保存液(ELS)配制在蒸懼水中加入60g/L葡萄糖(Glucose)、10g/L NaCl>O. 5g/L NaHCO3、再加入体积比为10% DMSO和10%胎牛血清(FBS)；4、精液稀释将冷冻保存液与精液以I : I的比例混合，放置在有冰块的保温盒平衡 5min ；5、精子超低温冷冻保存利用Iml移液枪将稀释后精液注入2ml的冷冻管中，每管加入稀释精液1ml，再将冷冻管悬置在-60--80°C的液氮蒸气中平衡lOmin，然后沉入液氮(-196°C )中冷冻保存；6、精子解冻和检测将冷冻管从液氮中取出，在液氮蒸气中平衡lmin，将冷冻管放入37°C水浴中解冻，取少许解冻后精液涂抹在载玻片上，滴加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力；7、冷冻精子受精将解冻后精子活力达到80%以上精子加入到采集的石斑鱼卵中，精卵比为I : 200ml，利用玻璃棒轻轻搅拌混合，静置5min，加入2倍于卵量的海水受
不目o
本发明与现有技术相比的有益效果I、发明了一种新的精子冷冻保存液配方(ELS :60g/L葡萄糖+10g/L NaCl+0. 5g/LNaHC03+10% DMS0+10%胎牛血清)，具有成分简单、易操作、冷冻保存精子量大、成活率高的特点；2、精子冷冻成活率高，利用本发明方法冷冻保存龙趸精子成活率达到83. 76%，与未冷冻精子成活率无显著差异。3、解决了石斑鱼杂交育种中雌雄鱼成熟不同步、各种石斑鱼地理隔离较远、雄鱼数量少、精液量不足的问题。4、精液保存量大，每次冷冻保存量可达到50ml以上，可大量应用于石斑鱼人工繁殖、杂交育种等方面。具体实施方法下面结合龙趸精子冷冻保存和杂交受精来进一步解释本发明。I、精液的采集利用海南省陵水县新村镇(海南蓝海洋科技养殖公司)培育的龙趸雄鱼6条，体长I. 3-1. 6m,体重35-40kg。在2012年4月繁殖季节人工采集成熟精液。利用50ppm 丁香酚麻醉龙趸，人工挤压腹部流出乳白色精液，利用50ml注射器吸取精液，防止尿液和海水混入。将采集的精液注入IOOml玻璃瓶，将收集精液的玻璃瓶放置在有冰块的保温盒中，共采集精液55ml。2、精子活力检测醮取精液涂片，滴加海水激活，在显微镜下检测，精子活力达到93. 33±2. 89%。3、冷冻保存液(ELS)配制在蒸馏水中加入60g/L葡萄糖(Glucose)、10g/L NaCl、0. 5g/L NaHCO3、再加入体积比为10% DMSO和10%胎牛血清(FBS)；3、精子冷冻保存利用精子冷冻保存液(ELS)以I : I的比例稀释精液，利用移液枪吸取稀释精液Iml加入2ml的冷冻管，将冷冻管悬置在-60—80°C的液氮蒸气中平衡lOmin，然后沉入液氮(_196°C)中冷冻保存。共冷冻保存精液110管(110ml)。4、精子解冻和检测将冷冻管从液氮中取出，在液氮蒸气中平衡lmin，将冷冻管放入37°C水浴中解冻。取少许解冻后精液涂抹在载玻片上，滴加一滴海水激活，在显微镜下观察精子活力。解冻后精子活力达到83. 76 ±7. 45%。5、冷冻精子受精及杂交育苗在海南蓝海洋科技养殖公司冷冻保存龙趸精液110管(IlOml)，将冷冻精液运输到山东莱州明波水产有限公司，采集该公司培育的红点石斑鱼成熟卵子800ml，解冻龙趸精子4管(4ml)，加入采集的卵子中，用玻璃棒轻轻搅动混合，采用干法受精，静置5ml后，加入2倍于卵子的海水。之后将受精卵置于小网中冲洗，洗去卵液，将受精卵放入22°C海水中孵化。受精率达到94. 56%，孵化率达到62. 5%，获得发眼卵500ml，孵化出 鱼苗40万尾左右。
权利要求
1.一种龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，包括精子采集、精子活力检测、冷冻保存液配制、精液稀释、精子超低温冷冻保存、精子解冻和检测、冷冻精子受精，其特征在于精子冷冻保存液配制在蒸馏水中加入60g/L葡萄糖、10g/LNaCl、0. 5g/L NaHC03、10%胎牛血清和10% ニ甲基亚砜配制而成。
2.根据权利要求I所述的龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，其特征在于精子采集时利用50ppm 丁香酚麻醉龙趸，人工挤压腹部采集精液，防止尿液和海水混入。
3.根据权利要求I所述的龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，其特征在于精子活力检测时龙趸精子活力在90%以上的精液可用于冷冻保存。
4.根据权利要求I所述的龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，其特征在于所述的精液稀释为冷冻保存液与精液以I : I的比例稀释混合，放置在有冰块的保温盒平衡5min。
5.根据权利要求I所述的龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，其特征在于所述的精子超低温冷冻保存为将稀释精液Iml注入2ml冷冻管中，将冷冻管置于-60--80°C的液氮蒸气中平衡lOmin，直接将冷冻管投入液氮中冷冻保存。
6.根据权利要求I所述龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，其特征在于所述的精子解冻和检测为将精子冷冻管放入37°C水浴中解冻，镜检后冷冻精子活力平均达83. 67%。
7.根据权利要求I所述龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，其特征在于所述的冷冻精子受精为将解冻精子加入未受精卵中混合均匀，精卵比例为I : 200ml，静置5min后加入2倍于卵的海水受精。
全文摘要
一种龙趸精子超低温冷冻保存应用方法，属于鱼类低温生物学及鱼类精子超低温冷冻保存技术领域，其技术方法包括精液采集、精子活力检测、冷冻保存液(ELS)配制、精液稀释、精子超低温冷冻保存、精子解冻和检测、冷冻精子受精。本发明技术方法冷冻精子活力平均达83.67％，与新鲜精子无显著差异，能与红点石斑进行杂交育苗。该发明技术方法利用稀释液配方简单、成本低，可大量冷冻保存龙趸精液，从而解决了龙趸人工繁殖中雌雄成熟不同步、与其它石斑鱼杂交中地理隔离较大、精液量不足的问题。
文档编号A01K61/00GK102726369SQ20121020830
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者杨传军, 梁友, 田永胜, 翟介明 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所