专利名称：一种获得栽培菊花单倍体的方法
技术领域：
本发明属于生物技术育种领域，涉及一种获得栽培菊花单倍体的方法。
背景技术：
菊花(Chrysanthemum morifolium)为菊科菊属植物，栽培品种多为六倍体及其非 整倍体，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，具有观赏、食用和药用价值(李鸿渐， 1993)，距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长 期选育而成(Chen，1957 ;Chen，1985)。菊花育种一直被认为是世界花卉育种史上的一个奇 迹，据统计，目前全世界菊花品种总数约为20000-30000个，我国传统菊品种超过4000个 (陈俊愉，2001)，是世界上商品产值最高的花卉(B0aes，1997)。菊花不仅在切花和盆花中 具有十分重要的地位，而且在露地栽培中也起到了越来越大的作用，因此加强菊花育种具 有很高的经济效益和社会效益。菊花是天然异花授粉植物，在自然界常有种间杂交现象发生，人工杂交也能获得 种间杂交植株。近年来，国内外研究者在菊花育种方法上，采用了自然杂交、人工杂交、芽变 选种、辐射诱变、组织培养、卫星搭载太空诱变、转基因、单细胞培养突变育种等方法。国内 外研究文献表明，目前绝大部分菊花品种都是经人工杂交育成，杂交是研究菊花及其它园 林植物起源和进化的重要途径，也是创造园林植物新类型和获得有价值的新品种的有效方 法(孟金陵，1997)。但是，由于对菊花亲本的遗传背景不清楚，不能够准确的预测菊花杂交 后代的性状，因此杂交育种的工作存在着很大的盲目性，不能按照确定的育种目标来准确 的选择杂交亲本。目前，杂交育种仍是菊花育种的主要方法，杂交育种的关键是获得优良的 纯系，但是由于菊花自交不育，不能通过自交等方法获得基因型纯合体，因此如何获得稳定 的纯系是我们目前迫切需要解决的问题。单倍体是大多数低等植物生命的主要阶段，在高等植物中出现的单倍体，几乎都 是由于生殖过程的不正常而产生的，大多数是孤雌生殖和孤雄生殖的结果。单倍体植物虽 然高度不育，通常生长衰弱，它本身没有多大价值，但是通过自然加倍或用人工方法使单倍 体植物的染色体加倍，即可获得完全纯合的二倍体，就和经过了好几代自交而产生的纯合 二倍体一样。育种者根据这个原理生产单倍体不仅能极早稳定分离后代，缩短育种年限，这 对自交不育或纯系获得较难的植物来说具有十分重要的意义。同时，单倍体培养不仅能够 获得一定的变异，还可以与常规育种、分子育种和转基因技术相结合，对各种复杂的遗传规 律进行分析，研究菊花的起源进化问题。这将对栽培菊花品种改良及优良新品种选育具有 深远意义也具有巨大的潜在商业价值。花药和花粉培养等孤雄生殖方式是获得单倍体的主要手段。近30年来利用花药 培养产生单倍体植株的技术已经应用到28个科68个属170多种植物上(卫志明，1999)。 花药培养存在得主要问题是植株不仅来自花粉，也来自花药的药壁药隔等其他部分，结果 得到的是不同倍性水平的混杂群体，因为单倍体产生的频率极低，所以需要花费大量的时 间进行鉴定，而且结果有待商榷，而使用花粉人工培养就可以克服这个困难。花粉培养中，花粉发育时期的重要性已有广泛的论述。因花粉发育时期是诱导小孢子分裂的关键。一般 来说，培养处于单核期的小孢子效果较好。但是菊花的花序为头状花序，花药为聚药雄蕊， 无法确定其具体生长时期，即使确定了其合适的生长时期，将花药取出也极其困难，加之菊 花的花粉活力低下，经灭菌后几无活力，使得花药培养十分困难。未受精的胚珠培养属于孤雌生殖，也是获得单倍体的重要手段，与花药和花粉培 养相比，胚珠培养获得的后代产生单倍体比例更好，鉴定更方便，但是胚珠培养一般不易产 生后代。因此未受精的胚珠培养技术亟待重视和加强。如果此技术成熟，将是我国菊花育 种(尤其是杂交育种和起源进化研究上)取得重要突破的关键所在。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种获得栽培菊花单倍体的方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种获得栽培菊花单倍体的方法，包括如下步骤(1)选择菊属栽培菊花[Dendranthema morifolium]或其近缘属植物为蒙导父 本，以栽培菊花为“母本”，利用蒙导父本的灭活花粉进行杂交授粉，取杂交授粉后13d的头 状花序，剥取边缘舌状花的子房进行消毒处理；(2)将步骤⑴所述的经消毒的子房内的胚珠剥出，接入MS添加细胞分裂素 6-BA2. 5mg · Γ1+生长素ΝΑΑ0. 5mg · Γ1的培养基上，诱导愈伤组织形成；(3)愈伤组织形成30d 40d后转入分化培养基，分化培养基为MS+细胞分裂素 6-BA2. Omg · L—1+生长素NAAO. Img · L—1，诱导愈伤组织分化出苗；(4)经步骤(3)得到幼苗后将幼苗转入MS+细胞分裂素6-BAO. 2mg -L"1的培养基中 进行扩繁和继代培养。当幼苗长至2 3cm时，将其移至1/2MS添加生长素NAAO. Img · L—1 的培养基上生根，培养温度为25士2°C，光照周期为14h · cT1，光照强度为1500 20001x， 即可获得栽培菊花单倍体材料的无菌苗；(5)对所得材料进行形态学鉴定，选择形态学特征在株高、冠径、分枝性、叶片、花 序等方面与“母本”不同的植株，再进行细胞学鉴定。经细胞学鉴定体细胞染色体数目是“母 本”体细胞染色体数目一半的后代材料，即为所述的栽培菊花单倍体。所述的“母本”选自钟山金桂或钟山紫桂，优选钟山紫桂。所述的蒙导父本选自茼蒿属白晶菊。所述的杂交授粉是收集所述的蒙导父本的花粉并以干热空气进行灭活，对所述的 “母本”进行人工去雄并套袋隔离，于温室内进行杂交，于上午9 10时或下午3 4时授 粉，同一花序重复授粉2次。所述的消毒处理是在超净工作台上依次开展以下操作用体积比为75%的乙醇 浸泡30s，质量百分比为0. 的升汞溶液消毒3min，无菌水冲洗5次。有益效果本发明利用菊属栽培种结合现代生物技术进行菊花单倍体育种研究，首 次通过使用蒙导父本的灭活花粉进行授粉杂交并结合胚珠培养的方法获得了栽培菊花单 倍体，克服了菊属单倍体获得的问题，拓宽了菊花育种的思路和领域，扩展了栽培菊花的遗 传基础，实现了菊花的种质创新。本发明结合利用形态学和细胞学对所得材料进行鉴定，结果真实可靠。在本发明基础上，使利用纯合体菊花进一步开展菊花育种成为可能，同时可利 用现代分子生物学等手段进行菊属的染色体组分析、起源演化及亲缘关系研究等，有重要 的理论意义和现实意义。
图1、钟山紫桂与其单倍体形态学比较鉴定A-B 盛花期植株形态比较，A 钟山紫桂，标尺=5cm ；B 钟山紫桂其单倍体，标尺 =5 cm ；C 叶片形态比较，钟山紫桂(左)，钟山紫桂其单倍体(右)，标尺=0. 5cm ；D-E 叶背面气孔比较D 钟山紫桂叶背面气孔，标尺=100 μ m，E 钟山紫桂其单 倍体叶背面气孔，标尺=100 μ m。图2钟山紫桂与其单倍体细胞学比较鉴定，左图钟山紫桂的染色体有丝分裂中期形态(2η = 6χ = 54)，标尺=5μπι;右图 钟山紫桂其单倍体的染色体有丝分裂中期形态(In = 3χ = 27)，标尺=5μπι。
具体实施例方式实施例1材料选择选择菊属栽培菊花‘钟山紫桂’(中国菊花研究网，http://www. chrysanthemum, cn)作为“母本”，以茼蒿属白晶菊[Chrysanthemum paludosum]为蒙导父 本。以上材料全部种植在南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”，可对外销售。(1)于温室内进行杂交，以钟山紫桂为“母本”进行人工去雄并套袋隔离，以白晶 菊为蒙导父本，在筒状花快开时套袋收集花粉并以干热空气进行灭活，于上午9 10时或 下午3 4时授粉，同一花序重复授粉2次。杂交后采用组织培养手段进行胚珠的离体培 养。接种时取杂交授粉后13d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房，在超净工作台上依次开 展以下操作用体积比为75%的乙醇浸泡30s，质量百分比为0. 的升汞溶液消毒3min， 无菌水冲洗5次。(2)用接种针将子房内的胚珠剥出，接入MS+细胞分裂素6-BA2. 5mg · Γ1+生长素 ΝΑΑ0. 5mg · Γ1的培养基上，每瓶接种胚珠10个，每处理重复30瓶，诱导愈伤组织形成。(3)愈伤组织形成40d后转入分化培养基，诱导愈伤组织分化出苗，分化培养基为 MS+ 细胞分裂素 6-BA2. Omg · Γ1+ 生长素 NAAO· Img · Γ1。(4)得到幼苗后转入MS+细胞分裂素6-BAO. 2mg · Γ1的培养基中进行扩繁和继代 培养，待苗到一定数量后接种在1/2MS添加生长素ΝΑΑ0. Img -L"1的培养基上生根。培养温 度为25士2°C，光照周期为Hh.cf1，光照强度为1500 20001x，即可获得栽培菊花单倍体 材料的无菌苗。(5)单倍体材料的形态学鉴定将“母本”及单倍体材料于4月份同时定植在田间， 6月起开始对“母本”及单倍体材料的形态学进行观察与统计，后代材料的茎、叶、花序、气孔 等形态学特征与“母本”不同、特异性状或“母本”不具有的新性状，即可初步判定其为单倍 体。性状登记均按李鸿渐(1993)标准(李鸿渐，邵建文.《中国菊花》.南京江苏科学技 术出版社，1993，4)进行。
栽培菊‘钟山紫桂’(染色体54条)与步骤⑷所得到的单倍体材料形态特征具 体描述如下‘钟山紫桂，[D.morifolium ‘zhongshanzigui，]株高 7O. 2cm，冠径 89· 5cm，叶 长5. Icm,宽3. 4cm,叶裂深，有或无托叶，茎绿或紫色；花序直径3. 7cm,筒状花部分直径 1. 6cm ；舌状花数26，长1. 9cm,宽0. 62cm,紫色；筒状花数146，长1. 2cm,黄色；花期10 11月。‘钟山紫桂，单倍体株高8. Icm,冠径12. 2cm,分枝性强，叶长2. 8cm,宽1. 9cm, 叶裂浅，无托叶，叶色较浅，茎浅绿或绿色，花序直径0. 7cm，筒状花部分直径0. 5cm，均为黄 色；舌状花数12，长1. Ocm,宽0. 3cm ；筒状花数16，长0. 6cm ；花期11月底 12月。对“母本” ‘钟山紫桂’及步骤⑷所得到的单倍体材料的初步观察表明新材料 的株型、冠幅、株高、叶型、叶色、花型、花色等形态特征与“母本”不同。冠幅、株高、叶片面 积明显低于“母本”；花序直径和舌状花长度、舌状花数量、宽度和筒状花数量、长度均低于 “母本”，且花色跟“母本”完全不同；分枝性、花序繁密度等均高于“母本”，如分枝比“母本” 多，单株花序比“母本”繁密，但花小且开花期较“母本”晚；叶片背面气孔数量和大小均低 于“母本”。由该单倍体材料与母本的表现型的对比，判定该单倍体材料极可能为单倍体植 株，钟山紫桂与该单倍体材料形态学比较鉴定图见图IA E。(6)细胞学鉴定对经形态学鉴定后的材料进行细胞学鉴定，如果后代材料的体 细胞染色体数目是“母本”体细胞染色体数目一半，即可判定该单倍体材料为其单倍体。细 胞学鉴定流程为取幼嫩单株枝条扦插，取长约Icm的根尖冰水处理20 22h，转入卡诺氏固定液 (无水酒精冰醋酸=3 1，体积比)固定24h后用45% (ν/ν)醋酸解离，制作临时片在 相差显微镜下观察染色体数目并拍照。对步骤(5)所得单倍体材料的根尖细胞有丝分裂中期制片进行鉴定，见图2，可以 清楚地看到该单倍体材料有丝分裂中期共有27条染色体(图2右图)，为母本栽培菊‘钟 山紫桂’的54条(图2左图)的一半，直观地证明了该单倍体材料为‘钟山紫桂’单倍体的
真实性。
权利要求
1.一种获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于包括如下步骤(1)选择菊属栽培菊花或其近缘属植物为蒙导父本，以栽培菊花为“母本”，利用蒙导父 本的灭活花粉进行杂交授粉，取杂交授粉后13d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房进行 消毒处理；(2)将步骤⑴所述的经消毒的子房内的胚珠剥出，接入MS添加细胞分裂素 6-BA2. 5mg · Γ1+生长素ΝΑΑ0. 5mg · Γ1的培养基上，诱导愈伤组织形成；(3)愈伤组织形成30 40d后转入分化培养基，分化培养基为MS+细胞分裂素 6-BA2. Omg · L—1+生长素NAAO. Img · L—1，诱导愈伤组织分化出苗；(4)经步骤(3)得到幼苗后将幼苗转入MS添加细胞分裂素6-BAO.2mg ·厂1的培养基 中进行扩繁和继代培养，当幼苗长至2 3cm时，将其移至1/2MS添加生长素NAAO. Img -L"1 的培养基上生根，培养温度为25士2°C，光照周期为14h · cT1，光照强度为1500 20001x， 即可获得栽培菊花单倍体材料的无菌苗；(5)对所得材料进行形态学鉴定，选择形态学特征在株高、冠径、分枝性、叶片、花序方 面与“母本”不同的植株，进行细胞学鉴定。经细胞学鉴定体细胞染色体数目是“母本”体 细胞染色体数目一半的后代材料，即为所述的栽培菊花单倍体。
2.根据权利要求1所述的获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于所述的母本选自钟 山金桂或钟山紫桂。
3.根据权利要求2所述的获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于所述的母本为钟山 紫桂。
4.根据权利要求1所述的获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于所述的导蒙父本选 自茼蒿属白晶菊。
5.根据权利要求1所述的获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于所述的杂交授粉是 收集所述的蒙导父本的花粉并以干热空气进行灭活，对所述的“母本”进行人工去雄并套袋 隔离，于温室内进行杂交，于上午9 10时或下午3 4时授粉，同一花序重复授粉2次。
6.根据权利要求1所述的获得栽培菊花单倍体的方法，其特征在于所述的消毒处理是 用体积百分比为75%的乙醇浸泡30s，质量百分比为0. 1 %的升汞溶液消毒3min，无菌水冲 洗5次。
全文摘要
本发明属于生物技术育种领域，公开了一种获得栽培菊花单倍体的方法。本发明选择栽培菊花品种为“母本”，利用蒙导父本的灭活花粉进行授粉杂交，并采用组织培养手段进行胚珠的离体培养，以克服菊属栽培菊花单倍体的生产和鉴定障碍。对获得的单倍体材料进行形态学鉴定和细胞学鉴定，选择茎、叶、花序、气孔等形态学特征与“母本”不同或出现特异性状单倍体材料，进行细胞学鉴定，若染色体组成为“母本”数目的一半，即为获得的单倍体。应用本方法成功地生产了多个栽培种的单倍体，为菊属植物种质创新和起源进化研究提供了新的材料。
文档编号A01H1/02GK102124950SQ201010607838
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者刘兆磊, 房伟民, 李 真, 滕年军, 王海滨, 管志勇, 陈发棣, 陈素梅 申请人:南京农业大学