专利名称：增强的肌醇六磷酸酶变体的制作方法
增强的肌醇六磷酸酶变体本发明涉及增强蛋白质领域，特别是通过分子改变而增强的蛋白质领域。它涉及称作增强的肌醇六磷酸酶的变体，因为与原肌醇六磷酸酶相比它具有较好的热稳定性和/ 或活性。本发明还涉及编码所述变体的核酸，含有所述变体的表达盒或表达载体，表达所述变体的宿主细胞，包括所述变体的组合物，以及还涉及其主要在食品添加剂和动物饲料制备中的用途。肌醇六磷酸酯(phytate)是植物中主要的磷储存化合物。该分子，也被称作肌醇六磷酸(phytic acid)或六磷酸肌醇酯(inositol-hexa-phosphate) (InsP6或肌醇六磷酸酯(myo-inositol hexakisphosphate))，由环己烷组成，六个磷酸酯基团结合到该环己烷。 肌醇六磷酸酯代表大约70%的植物磷酸酯，剩下30%以游离形式存在。另外，肌醇六磷酸酯的磷酸酯残基螯合二价和三价阳离子，如钙、铁、锌、镁、铜、锰和钼，这些阳离子是营养所必需的。肌醇六磷酸酶是水解肌醇六磷酸酯的酶这种酶自然地释放一种或两种磷酸酯， 很少是三种，该磷酸酯然后被吸收进入消化系统；其它的反应产物很少是肌醇三磷酸酯，主要是肌醇四磷酸酯和肌醇五磷酸酯(
图1)。肌醇六磷酸酶构成酶家族，其在自然界中被广泛代表许多生物体一从细菌到借助真菌的植物和某些动物一表达它们中的一种或多种。然而，哺乳动物不表达任意一种，反刍动物或多胃动物如牛和马在它们的胃肠道中具有降解肌醇六磷酸酯的内源微生物，但是这并不适用于单胃动物，例如，主要是猪和家禽，所以源自摄食的植物的肌醇六磷酸酯不代表有用的磷来源。因此，必需向它们的饲料中加入游离的磷酸酯。然而，那些加入的游离磷酸酯的部分和动物摄食的几乎所有肌醇六磷酸酯被排入到环境中。肌醇六磷酸酯然后在土壤中被细菌降解并且以游离磷酸酯的形式最后处于地下水和河流中。在畜牧业高度集中的地区，这种农业-工业磷酸酯废物一呈游离形式或呈肌醇六磷酸酯形式一代表主要的污染来源，这特别地导致河流和河道中的绿藻类增殖。除了美观方面外，这种藻类具有重要的生态影响，因为它们与当地的植物种类竞争， 特别是在溶解氧的消耗方面。哺乳动物能利用以肌醇六磷酸酯形式储存的磷酸酯作为磷酸酯来源的一个方法是将外源肌醇六磷酸酶引入到食物中。因此加入所述酶代表利用无机磷酸酯作为食品补充剂的替代方案。另外，通过使肌醇六磷酸酯的磷酸酯可及，它们还能对螯合到肌醇六磷酸酯的磷酸酯上的金属离子以及对结合到肌醇六磷酸酯的蛋白质提供较好的可及性，使它们在营养上可用。肌醇六磷酸酶目前在动物饲料中被相对系统地使用。它们被用作磷酸酯的部分替代品，它们还使蛋白质、氨基酸和钙更加可及。然而，在动物饲料中使用肌醇六磷酸酶存在几个限制-肌醇六磷酸酶释放磷酸酯不够有效构成第一个限制。即使在外源肌醇六磷酸酶存在的情况下，仍然将磷酸酯添加到动物饲料中。然而，如果所有肌醇六磷酸酯被转化成游离的磷酸酯，那么将不再需要补充物。因此，对提出更有活性的肌醇六磷酸酶存在真正的需求。-目前使用的大多数酶不能被直接加入到饲料中，因为它们不能经受住制粒工艺，该工艺包括将饲料加热到95°C持续90秒。因此在制粒阶段之后将酶喷雾到饲料上，这代表额外的成本并构成第二个限制；因此，对于获得更加热稳定的肌醇六磷酸酶存在极大需求。本发明的目的是通过产生这样的肌醇六磷酸酶而克服目前的限制，所述肌醇六磷酸酶有足够的活性以对补充磷酸酯的需要具有实质影响，并且是足够热稳定的以便能够被直接加入到动物的饲料中，而不必使用喷雾技术。许多肌醇六磷酸酶已在出版物和专利申请中被表征，或甚至已在农业-工业应用中使用。然而，它们都没有能够免除用磷酸酯补充畜牧场动物饲料的需要，并且它们都不是足够热稳定的以便直接加入到动物饲料中而不必使用喷雾技术。大多数出版物涉及来自黑曲霉(Aspergillus niger)和大肠杆菌(Escherichia coli)的肌醇六磷酸酶。微生物来源或源自植物的其它肌醇六磷酸酶也已被研究，问题是获得具有大于黑曲霉比活性(250U/mg)的热稳定肌醇六磷酸酶。文献和专利申请中描述的肌醇六磷酸酶涉及真菌(担子菌和子囊菌)、酵母和细菌。许多肌醇六磷酸酶已被从真菌中分离并且主要源自曲霉属(Aspergillus)家族，但也源自犁头霉属(Absidia)、端梗霉属(Acrophialophora)、田头菇属(Agrocybe)、 Calcarisporiella、毛壳菌属(Cheatomium)、棒囊壳属(Corynascus)、毛霉菌(Mucor)、 菌丝体(Mycelia)、Myriococcum、青霉属(Penicillium)、隔孢伏革菌属(Peniophora)、 根毛霉(Miizomucor)、根霉属(Iihizopus)或甚至源自松庆病菌属(Trametes)、孢子菌丝属(Sporotrichum)、链孢霉属(Neurospora)、木霉属(Trichoderma)、枝孢属 (Cladosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Taleromyces、梭抱壳属(Thielavia)、腐质霉属(Humicola)、桩菇菌属(Paxillus)和嗜热子囊菌属(Thermoascus)。可获得大量关于这样的酶的比活性和Km的信息，如Wyss等1999 (App 1. Environ. Microbiol. 65 (2) 367-373)中的信息。总体上，曲霉属肌醇六磷酸酶被表征为5 μ M至20 μ M 的高Km值、57°C的最适温度和5. 5的最适pH——除了烟曲霉(Aspergillus fumigatus) (最适pH. = 6)，但具有范围从100至250U/mg非常低的比活性。某些源自其它真菌的肌醇六磷酸酶已显示令人感兴趣的性质，特别是高比活性， 如源自绒毛栓菌(Trametes pubescens)的肌醇六磷酸酶或源自隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的肌醇六磷酸酶(在WO 98/28408中分别是1200U/mg和1080U/mg)。枝孢菌属某种(Cladosporium sp.)具有令人感兴趣的肌醇六磷酸酶，其具有900U/mg的比活性和15. 2μ M的Km，但具有40°C的低最适温度。另外，来自蜡质菌属某种(Cei^poria sp.)的6-肌醇六磷酸酶具有11040U/mg的比活性。Lassen等，2001 (App 1. Environ. Microbiο 1. 67 (10) 4701 -4707发表了一些互补的信息，比较了来自担子菌，特别是隔孢伏革菌、蜡质菌某种、绒毛栓菌和黑曲霉的肌醇六磷酸酶的热稳定性；似乎所述酶具有从 550C (绒毛栓菌)到60°C (隔孢伏革菌)非常接近的Tms(酶具有50%活性时的温度)，但具有从15% (绒毛栓菌)到62% (隔孢伏革菌)变化大的残余活性(在醋酸钠
， PH 5. 5中于80°C预温育60分钟而产生的活性百分比)。许多机构已提交了关于所述酶的专利申请，特别是Danisco/Genencor (WO 2001/012792, Penicillium subtilis ；WO 2003/038035，里氏木霉(Trichoderma reesei)； WO 2003/038111，青霉属，Mumicola，翘孢霉属(Emericella)，镰孢霉属(Fusarium))、 ABEnzymes/ROAL (EP O 659 215，由里氏木霉生产的曲霉属肌醇六磷酸酶)、DSM/Roche (EP0 684 313，土曲霉(Apergillus terreus)，烟曲霉，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)， Talaromaces thermophilus) ,BASF (WO 2003/102174，曲霉属)、Adisseo (W0 2003/054199， 青霉属)禾口 Choongang Biotech Ltd. (WO 2005/056835,草酸青霉菌(Penicillium oxalicum))。几种细菌肌醇六磷酸酶已被描述，其源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (Paver 禾口 Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology 151 :1102-1108)、fi 单胞菌属(Pseudomonas)(Cosgrove,1970, Australian Journal of Biological Sciences 23 1207-1220)和Klebsiella。文献中已报导了几种源自大肠杆菌的肌醇六磷酸酶。Greiner 等在Arch. Biochem. Biophys.，303，107-113，1993中纯化和表征了大肠杆菌的新型肌醇六磷酸酶；其它的已被 Lim 等，2000，Nat. Struct. Biol. 7 :108-113, Oshima 等，1996，DNA Research, 3 137-155, Touati 禾口 Danchin,1987, Biochimie,69 :215-221, Rodriguez 等， 2000，Arch. Biochem. Biophys.，382 :105-112, Kretz，涉及大肠杆菌 B 的美国专利 5 876 997 和涉及 appA 的 Dassa 等，1990，J. Bacteriol. 172 :5497-5500 报导。来自大肠杆菌肌醇六磷酸酶的突变体已通过基因工程获得，导致增强的热稳定性和比活性(Rodriguez 等，2000，Arch. Biochem. Biophys.，382 :105-112，Lanahan 等，2003， 美国专利申请20030157646)。然而，那些突变体都没能用于在真核生产生物体中生产足够的原核来源的那些酶。本发明的目的是提供重组酶，所述重组酶适于工业过程以使其用作食品添加剂， 主要是用于动物饲料中。在申请WO 2002/048332中，利用在发明日获得的细菌基因组的BLAST分析和利用来自大肠杆菌的appA基因，Diversa鉴定了具有肌醇六磷酸酶活性的来自鼠疫耶尔森菌 (Yersinia pestis)的新型蛋白。该蛋白具有显著的特征，即它具有4400U/mg的比活性。 在该申请中没有说明该蛋白的其它生物化学特征。该申请似乎证实源自来自耶尔森菌家族细菌的肌醇六磷酸酶的高潜在活性。在2005年10月20日，具有编号ZP_00832361的蛋白序列被加入到NCBI数据库中。所述序列是中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)ATCC 29909的假定蛋白，其相应的核苷酸顺序存在于编号NZ_AALF01000052，区域1889…3214下。该蛋白序列通过源自菌株中间耶尔森菌ATCC 29909基因组全序列的相应核苷酸序列的翻译而获得。尽管PRK10172 结构域似乎预测肌醇六磷酸酶活性，但是没有实验成分伴随该预测。这似乎已通过从源自冰川污物样品的新型菌株中间耶尔森菌分离非常相似的肌醇六磷酸酶而被证实，该菌株被称为H-27并存在于申请WO 2007/128160中。源自H-27菌株的肌醇六磷酸酶在NCBI数据库中被指定核苷酸序列登录号AB195370. 1和蛋白序列登录号DQ986462 ；它具有98%的氨基酸同一性并且与编码中间耶尔森菌ATCC 29909的假定肌醇六磷酸酶的核苷酸序列具有97%的同一性。申请WO 2007/128160的肌醇六磷酸酶具有超过3000U/mg的高比活性，与WO 2002/048332中记载的鼠疫耶尔森菌的比活性具有相同的等级。在该申请WO 2007/128160 中，要求保护蛋白的固有生物化学特征，即45. 5kDa的分子量、在4. 0至5. 0范围的最适pH、 50至60°C的最适温度、7. 7的理论pi、超过3000U/mg的比活性和对胃蛋白酶和胰蛋白酶的
高抗性。
本发明意指通过分子上改变来自中间耶尔森菌的肌醇六磷酸酶而提出增强的变体，可以超越目前的限制。术语"增强的变体"指热稳定性和/或活性比来自中间耶尔森菌的原肌醇六磷酸酶高的变体，指它可用于工业过程和特别是用作食品添加剂。如在本文的其余部分和借助附图所描述的，本申请描述了序列是SEQ ID No. 1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代:P3、V4、A5、P8、T9、G10、V16、V17、L19、S20、R21、H22、G23、V24、R25、S26、P27、 T28、K29、Q30、T31、Q32、L33、M34、D36、P39、K41、W45、A49、G50、Y51、L52、T53、G56、A57、 V60、Y67、G75、A78、C81、D92、V93、D94、Q95、R96、T97、R98、L99、T100、G101、A103、V116、 V125、D126、F129、H130、P131、V132、D133、D140、T142、Q143+H145、A147、L152、P155、L156、 E158、E158+S160、F167、A177、C182、G189、D193、N196、F197、K201、K206、P207、T209、K210、 V211、S212、L213、L217、A218、L219、S220、S221、T222、L223、G224、E225、I226、F227、L228、 L229、Q230、N231、Q233、A234、P236、R242、1250、S251、L252、L253、L255、H256、N257、Q259、 F260、D261、M263、A264、Y268、K273、G274、P276、L277、Q292、G293、P297、P300、Q301、G308、 G309、H310、D311、T312、N313、I314、A315、N316、G322、A323、Q326、P331、D332、N333、T334、 P335、P336、G337、G338、G339、V341、E343、D349、Q352、R353、Y354、I355、A370、E371、K376、 P379、A380、G381、D388、E391、S393、G394 和P414，所述位置表示在SEQ ID No. 1 中。优选地，序列是SEQ ID No. 1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物包括至少一个选自以下的取代P3L、P3V、V4G、A5P、P8N、P8V、T9I、T9Q、T9S、T9Y、GlOA、GlOP、V16M、V17W、L19G、 S20C、R21F、H22A、H22S、H22Y、G23S、V24C、R25C、S26C、P27F、T28N、T28S、T28V、K29N、Q30C、 Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、 L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、Y67W、G75R、A78P、C81N、D92R、V93G、D94G、D94S、 Q95N、Q95V、R96A、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、V116C、V125N、D126Q、F129W、H130N、
H130Q,H130R、H130W、H130Y、P131S、V132W、D133G、D133P、D133R、D133V、D133W、D140E、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、T209C、K210C、K210E、K210N、K210S、K210T、K210V、K210Y、V211C、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、E225D、F227S、L229H、Q230N、Q230T、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S,I250T、S251N,L252M,L255T、H256A、H256E,H256P,N257I,Q259K、Q259S、Q259T、Q259Y、D261F,M263L,A264N、A264P,Y268C,Y268E,Y268N,K273N、G274C、G274S、P276L、Q292P,G293N,P297N,P297S,P300N、Q301L、G308S、H310N、H310R、D311A、D311E、D311G、T312D,T312N、T312P、T312V、N313F、N313R、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q,N333V、P335C、P335G、P335R、P335S、P335T、G339C、V341A,V341E,E343A,E343G,D349N,D349S,D349T,Q352S、Q352T、R353C、Y354N,I355W、A370D、A370T、E371S、E371T、
K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T 和 P414Q，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。优选地，序列是SEQ ID No. 1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物包括至少一个选自前述组的取代的取代组合。
SEQ ID No. 1是2005年10月20日提交的出现在NCBI数据库中的序列，登录号是 ZP_00832361，然而，在该蛋白质的5'端不含有23个氨基酸信号序列。SEQ ID No. 1因此对应于在上述登录号下出现的残基对-441。SEQ ID No. 1还含有编码NCBI数据库(base) 中前述蛋白序列的核酸序列，编号是NZ_AALF01000052。在该序列的基础上利用技术人员熟知的技术，例如通过待被修饰密码子的定向诱变，可容易地制备编码本发明变体的核酸，以获得期望的氨基酸取代。因此，本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的序列对应于包含所选一个或多个取代的SEQ ID No. 1。SEQ ID No. 2 只复制 SEQ ID No. 1 的蛋白序列。在具体的实施方式中，本发明增强的变体包括单个取代。在优选的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代I^9、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、FU9、H130、D140、 T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、1250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、 Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349 和 E391，所述位置表示在 SEQ ID No. 1 中。在另一个优选的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括在选自以下氨基酸之一上的取代K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、 A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、 G308、N316、Q3 、D349和E391，所述位置表示在SEQ ID No.l中。优选地，在氨基酸K29、 Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、G189、 K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、 Q326、D349 和 E391 上的取代选自 K29N、Q30D、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52G、G75R、C81N、 V93G、Q95N、R98T、L99C、F129W、H130Y、D140F、D140N、T142N、P155N、P155T、F167N、A177N、 A177S、A177T、G189N、K201N、K210N、K210S、L219V、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、 M263L、Y268N、G274C、Q292P、G293N、P297N、G308S、N316C、Q326S、Q326T、D349S、D349T 和 E391N，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在又一个优选的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括在选自以下氨基酸之一上的取代:I^9、Q30、Y51、L52、G75、V93、R98、L99、FU9、H130、D140、T142、P155、 F167、A177、K201、K210、L219、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、G308、N316、
和E391，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。优选地，在上述氨基酸上的取代选自D9N、 Q30D、Y51G、Y51Q、Y51W、L52G、G75R、V93G、R98T、L99C、F129W、H130Y、D140F、T142N、P155T、 F167N、A177N、A177S、A177T、K201N、K210S、L219V、S251N、L252M、L255T、M263L、Y268N、 G274C、Q292P、G293N、G308S、N316C、Q326S、Q326T 和 E391N，所述位置表示在 SEQ ID No. 1 中。在另一个具体的实施方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括选自以下的取代组合G274C+N316C、T142N+A177T+Q326T、K210S+Y268E+Q292P、D140F+Y268E+Q292P、 F167N+Y268E+Q292P、T142N+A177T+K210S+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326 Τ、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T+G274C+N316C、L52C+L99C+T142N+A177T+K210 S+Y^8E+Q^2P+Q326T，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在该具体实施方式
的优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+K210S+Y^8E+G^92P+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在该实施方式的另一个特别优选的方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+K210S+Y^8E+G274C+G^92P +N316C+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在该具体实施方式
的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+K210S+Q326T 组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在该具体实施方式
的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由G274C+N316C组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在该具体实施方式
的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由T142N+A177T+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. 1 中。在该具体实施方式
的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由 K210S+Y^8E+Q^2P组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. 1中。在该具体实施方式
的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由D140F+Y^8E+Q^2P组成的取代组合。在该具体实施方式
的另一个优选方式中，本发明增强的变体或其功能衍生物包括由F167N+Y^8E+Q^2P组成的取代组合。本发明提供序列是SEQ ID No. 1的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其包括所选的一个或多个取代。本发明还提供编码根据本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的核酸、 包括本发明核酸的表达盒和包括本发明核酸或表达盒的载体。所述载体可以优选地选自质粒、噬菌体、噬菌粒和病毒载体。本发明还提供组合物，所述组合物包括序列是SEQ ID No. 1的至少一个增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物——其具有根据本发明的所选的一个或多个取代。它还提供包含一定百分比的至少一个本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的任意固体、液体或气体混合物。它还提供优选含有一个、两个、三个、四个、五个或十个根据本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的混合物。本发明还提供肌醇六磷酸酶制剂或组合物，其含有一定百分比的至少一个本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物和一个或多个具有有利特性的其它酶。本发明提供本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物在制备食品添加剂中的用途。利用本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物是工业过程所关注的，该工业过程可用于释放矿物质，特别是来自植物的磷酸酯，当在摄食之前利用本发明增强的肌醇六磷酸酶变体处理食物时体外释放，或通过在进食之前或进食时将所述变体直接给予动物而体内释放。本发明提供含有序列是SEQ ID No. 1的至少一个增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物——其具有本发明所选的一个或多个取代——的核酸、表达盒或编码载体转化或转染宿主细胞的用途。它还提供宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的核酸、表达盒或载体。本发明还提供所述核酸、所述表达盒、所述载体或所述宿主细胞生产本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的用途。它还提供本发明增强的肌醇六磷酸酶变体的生产方法，包括用本发明的核酸、表达盒或载体转化或转染宿主细胞，培养转化或转染的宿主细胞和收获由宿主细胞产生的增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物。宿主细胞可以是原核或真核的。因此，宿主细胞可以是微生物， 优选细菌、酵母或真菌。宿主细胞还可以是哺乳动物细胞，如C0S7或CHO细胞。术语"功能衍生物"指源自本发明肌醇六磷酸酶变体的任何酶，其包含结构修饰同时保持肌醇六磷酸酶活性。这样的修饰可以例如包括通过加入新结构域而延伸所述酶， 或结构域的部分或全部取代，如用来自可以提供其他功能/特性的其它酶的氨基酸替换氨
10基酸片段(stretch)。术语"功能衍生物"还包括本发明酶的变体的二聚化形式，其可以是同源或异源二聚体，或甚至多聚体，例如由于结构域倍增而具有增强的特性，如热稳定性。 术语"功能衍生物"还包括本发明肌醇六磷酸酶变体的嵌合形式，其与感兴趣的另一蛋白 /酶融合或与所述感兴趣的酶的一个或多个结构域融合。术语"功能衍生物"还包括本发明肌醇六磷酸酶变体的功能片段，其保留肌醇六磷酸酶活性。所述活性可以利用实施例4 和5中描述的方案之一进行测量。该片段可以包括本发明肌醇六磷酸酶的250、275、300、 325、350、375、380、385、390、395、400、405、410或415个连续氨基酸。所述功能片段还可以被二聚化或多聚化和/或与感兴趣的另一蛋白/酶融合或与其一个或多个结构域融合。术语"变体"或"突变体"指与参考核苷酸序列相比具有突变的核苷酸序列。由于遗传密码的简并性，所述突变可以是沉默的；那么由该变体编码的蛋白与由参考核苷酸序列编码的蛋白具有同一性。所述突变还可以引起与参考核苷酸序列编码的蛋白相比变体编码的蛋白质中氨基酸的取代。术语"变体"包括含有通过定向诱变而获得的突变的序列。表达"变体"涉及呈现所述突变的核苷酸序列以及由所述核苷酸序列编码的蛋白序列。本发明增强的肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物可以包含在选自以下氨基酸之一上的取代P3、V4、A5、P8、T9、G10、V16、V17、L19、S20、R21、H22、G23、V24、R25、S26、P27、 T28、K29、Q30、T31、Q32、L33、M34、D36、P39、K41、W45、A49、G50、Y51、L52、T53、G56、A57、V60、 Y67、G75、A78、C81、D92、V93、D94、Q95、R96、T97、R98、L99、T100、G101、A103、V116、V125、 D126、F129、H130、P131、V132、D133、D140、T142、Q143+H145、A147、L152、P155、L156、E158、 E158+S160、F167、A177、C182、G189、D193、N196、F197、K201、K206、P207、T209、K210、V211、 S212、L213、L217、A218、L219、S220、S221、T222、L223、G224、E225、1226、F227、L228、L229、 Q230、N231、Q233、A234、P236、R242、I250、S251、L252、L253、L255、H256、N257、Q259、F260、 D261、M263、A264、Y268、K273、G274、P276、L277、Q292、G293、P297、P300、Q301、G308、G309、 H310、D311、T312、N313、I314、A315、N316、G322、A323、Q326、P331、D332、N333、T334、P335、 P336、G337、G338、G339、V341、E343、D349、Q352、R353、Y354、I355、A370、E371、K376、P379、 A380、G381、D388、E391、S393、G394 和 P414，其未在 P3L、P3V、V4G、A5P、P8N、P8V、T9I、T9Q、 T9S、T9Y、G10A、GlOP、V16M、V17W、L19G、S20C、R21F、H22A、H22S、H22Y、G23S、V24C、R25C、 S26C、P27F、T28N、T28S、T28V、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、 W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、Y67W、 G75R、A78P、C81N、D92R、V93G、D94G、D94S、Q95N、Q95V、R96A、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、
A103C、V116C、V125N、D126Q,F129W、H130N、H130Q,H130R、H130W、H130Y、P131S、V132W、D133G、D133P、D133R、D133V、D133W、D140E、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、T209C、K210C、K210E、K210N、K210S、K210T、K210V、K210Y、V211C、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、E225D、F227S、L229H、Q230N、Q230T、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S,I250T、S251N,L252M,L255T、H256A、H256E,H256P,N257I,Q259K、Q259S、Q259T、Q259Y、D261F,M263L,A264N、A264P,Y268C,Y268E,Y268N,K273N、G274C、G274S、P276L、Q292P,G293N,P297N,P297S,P300N、Q301L、G308S、H310N、H310R、D311A、D311E、D311G、T312D、T312N、T312P、T312V、N313F、N313R、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、 Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、N333V、P335C、P335G、P335R、P335S、 P335T、G339C、V341A、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、R353C、 Y354N、I355W、A370D、A370T、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、 G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T 和 P414Q 中被描述，所述位置表示在 SEQ ID No. 1 中，或如上所述源自所述组的取代组合。作为例子，所述取代可以是称作"保守的"取代， 即在具有相似或相当特性的氨基酸组，如根据下面表具有低空间位阻的氨基酸，或酸性、碱性、极性、疏水性和芳香氨基酸内的取代
权利要求
1.具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代P3、V4、A5、P8、T9、G10、V16、V17、L19、S20、 R21、H22、G23、V24、R25、S26、P27、T28、K29、Q30、T31、Q32、L33、M34、D36、P39、K41、W45、 A49、G50、Y51、L52、T53、G56、A57、V60、Y67、G75、A78、C81、D92、V93、D94、Q95、R96、T97、 R98、L99、T100、G101、A103、V116、V125、D126、F129、H130、P131、V132、D133、D140、T142、 Q143+H145、A147、L152、P155、L156、E158、E158+S160、F167、A177、C182、G189、D193、N196、 F197、K201、K206、P207、T209、K210、V211、S212、L213、L217、A218、L219、S220、S221、T222、 L223、G224、E225、I226、F227、L228、L229、Q230、N231、Q233、A234、P236、R242、I250、S251、 L252、L253、L255、H256、N257、Q259、F260、D261、M263、A264、Y268、K273、G274、P276、L277、 Q292、G293、P297、P300、Q301、G308、G309、H310、D311、T312、N313、I314、A315、N316、G322、 A323、Q326、P331、D332、N333、T334、P335、P336、G337、G338、G339、V341、E343、D349、Q352、 R353、Y354、1355、A370、E371、K376、P379、A380、G381、D388、E391、S393、G394 和 P414，所述位置表示在SEQ ID No. I中。
2.根据权利要求I的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括至少一个选自以下的取代P3L、P3V、V4G、A5P、P8N、P8V、T9I、T9Q、 T9S、T9Y、G10A、GlOP、V16M、V17W、L19G、S20C、R21F、H22A、H22S、H22Y、G23S、V24C、R25C、 S26C、P27F、T28N、T28S、T28V、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、D36N、P39N、K41G、 W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、A57C、V60I、Y67F、Y67W、 G75R、A78P、C81N、D92R、V93G、D94G、D94S、Q95N、Q95V、R96A、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、V116C、V125N、D126Q、F129W、H130N、H130Q、H130R、H130W、H130Y、P131S、V132W、D133G、D133P、D133R、D133V、D133W、D140E、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、T209C、K210C、K210E、K210N、K210S、K210T、K210V、K210Y、V211C、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、E225D、F227S、L229H、Q230N、Q230T、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、H256A、H256E、H256P、N257I、Q259K、Q259S、Q259T、Q259Y、D261F、M263L、A264N、A264P、Y268C、Y268E、Y268N、K273N、G274C、G274S、P276L、Q292P、G293N、P297N、P297S、P300N、Q301L、G308S、H310N、H310R、D311A、D311E、D311G、T312D、T312N、T312P、T312V、N313F、N313R、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、N333V、P335C、P335G、P335R、P335S、P335T、G339C、V341A、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、R353C、Y354N、I355W、A370D、A370T、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T 和 P414Q，所述位置表示在 SEQ ID No. I 中。
3.根据权利要求2的具有序列SEQ ID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括至少一个选自以下的取代P8N、P8V、T9I、T9S、G10A、GlOP, V16M、 V17W、S20C、G23S、V24C、S26C、P27F、T28N、T28S、K29N、Q30C、Q30D、Q30R、Q32R、L33R、M34C、 D36N、P39N、K41G、W45C、G50D、G50E、Y51G、Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、T53C、G56C、 A57C、V60I、Y67F、G75R、A78P、C81N、V93G、Q95N、T97N、R98N、R98T、L99C、G101C、A103C、 V116C、F129W、H130N、H130Q、H130R、H130Y、P131S、V132W、D133G、D140F、D140N、T142N、Q143N+H145T、A147C、L152N、L152P、P155N、P155T、L156N、E158N、E158N+S160T、F167N、A177N、A177S、A177S+Q326S、A177S+Q326T、A177T、C182N、G189N、D193C、N196C、F197V、K201N、K206A、P207N、P207S、P207T、K210N、K210S、K210T、K210Y、V211G、S212N、L217N、A218N、L219V、S220N、L223S、L229H、Q230N、N231K、Q233S、Q233T、A234K、P236N、R242N、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、H256E、N257I、Q259S、Q259T、M263L、A264N、A264P、Y268C、Y268E、Y268N、G274C、Q292P、G293N、P297N、P297S、P300N、Q301L、G308S、H310N、T312D、T312N、I314E、I314M、N316C、G322C、A323E、Q326S、Q326T、P331R、D332A、D332L、D332N、D332Q、P335C、P335S、P335T、G339C、V341E、E343A、E343G、D349N、D349S、D349T、Q352S、Q352T、A370D、E371S、E371T、K376S、P379L、P379S、P379T、A380S、A380T、G381S、D388C、E391N、S393G、G394S、G394T 和 P414Q，所述位置表示在 SEQ ID No. I中。
4.根据权利要求I的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括在选自以下氨基酸之一上的至少一个取代K29、Q30、Υ51、L52、G75、 C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、 I250、S251、L252、L255、M263、Y268、G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349 和 E391, 所述位置表示在SEQ ID No. I中。
5.根据权利要求4的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于在氨基酸 K29、Q30、Y51、L52、G75、C81、V93、Q95、R98、L99、F129、H130、D140、 D140N、T142、P155、F167、A177、G189、K201、K210、L219、I250、S251、L252、L255、M263、Y268、 G274、Q292、G293、P297、G308、N316、Q326、D349 和 E391 上的取代选自 K29N、Q30D、Y51G、 Y51N、Y51Q、Y51W、L52C、L52G、G75R、C81N、V93G、Q95N、R98T、L99C、F129W、H130Y、D140F、 D140N、T142N、P155N、P155T、F167N、A177N、A177S、A177T、G189N、K201N、K210N、K210S、 L219V、I250S、I250T、S251N、L252M、L255T、M263L、Y268E、Y268N、G274C、Q292P、G293N、 P297N、G308S、N316C、Q326S、Q326T、D349S、D349T 和 E391N，所述位置表示在 SEQ ID No. I 中。
6.根据权利要求I至5中任一项的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括选自以下的取代组合G274C+N316C、 T142N+A177T+Q326T、K210S+Y268E+Q292P、D140F+Y268E+Q292P、F167N+Y268E+Q292P、 T142N+A177T+K210S+Q326T、T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T、T142N+A177T+K210S +Y268E+Q292P+Q326T+G274C+N316C 和 L52C+L99C+T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326 T，所述位置表示在SEQ ID No. I中。
7.根据权利要求I至6中任一项的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括由 T142N+A177T+K210S+Y268E+G274C+Q292P+N316C+Q326 T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. I中。
8.根据权利要求I至7中任一项的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它包括由T142N+A177T+K210S+Y268E+Q292P+Q326T组成的取代组合，所述位置表示在SEQ ID No. I中。
9.根据权利要求I至8中任一项的具有序列SEQID No. I的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物，其特征在于它的序列是具有所选一个或多个取代的SEQ ID No. I。
10.编码根据权利要求I至9中任一项的增强肌醇六磷酸酶变体的核酸。
11.根据权利要求10的核酸的表达盒或表达载体。
12.宿主细胞，其包含根据权利要求10的核酸或根据权利要求11的表达载体。
13.组合物，其包含具有所选一个或多个取代的根据权利要求1至9中任一项具有序列 SEQ ID No. 1的至少一个增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物。
14.具有所选一个或多个取代的根据权利要求1至9中任一项具有序列SEQID No. 1 的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物用于制备食品添加剂的用途。
15.根据权利要求10的核酸、根据权利要求11的表达盒或根据权利要求12的细胞生产具有所选一个或多个取代的根据权利要求1至9中任一项具有序列SEQ ID No. 1的增强肌醇六磷酸酶变体或其功能衍生物的用途。
全文摘要
本发明涉及增强蛋白质的领域，特别涉及通过分子改变增强的蛋白质领域。本发明涉及所谓的增强的肌醇六磷酸酶变体，其特征在于所述肌醇六磷酸酶变体具有比原肌醇六磷酸酶好的热稳定性和/或活性。本发明还涉及编码所述变体的核酸、含有所述变体的表达盒或表达载体、表达所述变体的宿主细胞、包含所述变体的组合物以及其主要在制备食品添加剂和动物饲料中的用途。
文档编号A23K1/16GK102597227SQ201080029857
公开日2012年7月18日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月1日
发明者B·文特尔, H·查尔德, L·麦斯塔, M·戴尔库特, S·布莱萨 申请人:百奥麦瑟迪斯