专利名称：一种葛根的快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物克隆技术领域，更具体涉及一种葛根的快速繁殖方法，此方法适 用于葛根的脱毒快繁育苗，也可被借鉴到其他同类植物的快繁育苗。
背景技术：
野葛(/^eraria A^aia)为豆科葛属，多年生藤本植物。葛根是药食两用植物，其 根、茎、叶、花都可入药，现代医学表明葛根中的有效成分为异黄酮类(isoflavones)物质， 其中葛根素(puerarin)含量最高。这些异黄酮类化合物具有治疗急性心肌梗塞、不稳定性 心绞痛、高粘血症、急性脑梗塞、颈椎病等疾病，对东莨菪碱和乙醇引起的记忆障碍具有对 抗作用；其食用部分主要是块根，人们提取其淀粉加工成葛粉丝、葛糕、葛饮料、葛冻、葛酒、 葛饼干等系列产品。同时葛根的茎叶又是良好的动物饲料，而且由于葛根顽强的适应性和 生命力，又是世界各国极为重视的水土保持植物，被誉为“大地良医“。所以葛根的种植业 近几年发展得很快，但葛根的种子很难得到且发芽率又不高，而传统的扦插繁殖又使得病 毒积累严重，病毒病已成为粉葛种性退化、产量下降、品质变劣的重要原因。因此近几年，葛 根的组织培养技术得到迅速发展，主要集中在利用葛根的茎、叶来诱导形成愈伤组织，前人 研究表明以葛根的根、茎、叶、子叶为外植体，都可以产生愈伤组织，且每种组织愈伤组织生 长周期不一样，分化率也不一样，普遍认为茎杆的诱导分化率不高且容易褐化，部分学者认 为葛根的成熟叶片为诱导愈伤组织的最适宜外植体。另外，前人还研究了不同激素以及不 同激素组合对葛根各部分诱导分化的影响，结果发现诱导及芽分化率都极低。由于幼茎分 生组织代谢活性很高，不易受微生物的侵染，且茎尖分生组织带有叶原基，较易诱导愈伤组 织的形成，因此，部分学者采用茎尖脱毒技术，研究了茎尖分生组织诱导愈伤组织，并且对 组织培养的最适培养基进行了研究。他们剥去茎尖外面的芽鳞和幼叶，切取大小0.4 - 0.6 mm带有叶原基的分生组织为外植体，通过诱导、继代、分化和生根培养，得到了生有少量侧 根的组培苗，同时他们也对不同浓度的激素组合的影响作了研究，得到了最佳的激素组合 浓度，但对此，不同学者之间的研究结果差别很大，而且利用此种方法，需要100多天才能 得到生有侧根的小苗，在生产上应用很受限制。除此之外，部分学者还尝试借鉴兰花的组培 经验，利用带有幼芽的茎段为外植体，来进行葛根无菌庙的扩繁试验，但葛根的幼芽分化率 不是很高，因而此方法也受到限制。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种葛根的快速繁殖方法，方法易行，操作简便，不受 季节限制，从获取外植体到成苗所需时间短，大大缩短了葛根无菌苗的组培周期，减少了实 验成本，采用了特定外源激素的萌动和分化诱导大大提高了分化诱导率，且幼苗的素质高， 成活率高，效率可到90%左右，可满足生产和实验的需求。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施 一种葛根的快速繁殖方法，其步骤是A、以葛根的整个幼芽(带有鳞片和分化幼叶的茎节)为外植体；
B、用网纱将葛根幼芽包起放在自来水下冲洗1-2小时，用70%(体积比，以下相同)的 酒精灭菌8-12秒，无菌水冲洗2-4次，再用10% (体积比，以下相同)双氧水灭菌10-14分 钟，无菌水冲洗4-6次；
C、用消毒镊子接种到MS+0. 4-0. 5mg/L2, 4_D的培养基上萌动4_5天后转接到 "MS+0. 1-0. 2mg/L 6-BA+0. 05-0. lmg/L NAA”分化培养基上培养，在萌动后可见幼叶欲出， 接到分化培养基上4-5天后，就有幼叶抽出，茎节拉长，这时用消毒剪刀按茎节剪断接入上 述分化培养基上进行扩繁；
D、9-11天后转接一次进行继代培养，依然用分化培养基，在观-32天就可以得到无 根的无菌扩繁苗；
E、转接到1/2MS+0. 1-0. 2mg/LNAA的生根培养基上，9_11天就可看到不定根生出， 18-22天后不定根能长到2-3厘米长，上部叶片有4或5片时就可揭开瓶盖在温室中炼苗 了 ；
F、炼苗2-3天后可取出幼苗，洗去培养基，栽入土中。注1) M S培养基为植物组培培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细 胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含 量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。方法中的各培养基是自己 配制的新鲜培养基。2) mg/L为浓度单位，是毫克每升，即每升培养基中含有此激素的量。3)实验中用到的萘乙酸(NAA)，6苄基腺嘌呤(6_BA)和2，4_ 二氯苯氧醋酸 (2，4-D)为植物组培中常用外源激素，从试剂公司购买到。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1. 采用葛根的整个幼芽(带有鳞片和分化幼叶的茎节)为外植体，不用经过愈伤组织 的诱导以及由愈伤再分化出幼芽的步骤，而是由幼芽外植体直接形成无菌扩繁苗，这样大 大缩短了葛根无菌苗的组培周期，减少了实验成本。2.幼芽在 MS+0. 4-0. 5mg/L2, 4-D 的培养基上萌动 4-5 天后转接 MS+0. 1-0. 2mg/ L6-BA+0. 05-0. lmg/LNAA的分化培养基上培养，大大提高分化诱导率，效率可到90%左右。3. 幼芽接到分化培养基上4-5天后，就有幼叶抽出，茎节拉长，这时用消毒剪刀 按茎节剪断接入分化培养基上进行扩繁；10天后转接一次进行继代培养，但依然用分化培 养基，在一个月左右就可以得到无根的无菌扩繁苗；因此幼苗的素质高，成活率高。
具体实施例方式实施例1:
一种葛根的快速繁殖方法，其步骤是
1、以葛根的整个幼芽(带有鳞片和分化幼叶的茎节)为外植体；
2、用网纱将葛根幼芽包起放在自来水下冲洗1或2小时，用70%(体积比)的酒精灭 菌10秒，无菌水冲洗4次，再用10% (体积比)双氧水灭菌10分钟，无菌水冲洗5次；
3、用消毒镊子接种到MS+0. 4-0. 5mg/L2, 4-D的培养基上萌动4或5天后转接到"MS+0. 1-0. 2mg/L6-BA+0. 05-0. lmg/LNAA”分化培养基上培养，在萌动后可见幼叶欲出，接 到分化培养基上4或5天后，就有幼叶抽出，茎节拉长，这时用消毒剪刀按茎节剪断接入分 化培养基上进行扩繁；
4、10天后转接一次进行继代培养，依然用分化培养基，在30天就可以得到无根的无 菌扩繁苗；
5、转接到1/2MS+0.1-0. 2mg/LNAA的生根培养基上，9或10或11天就可看到不定根 生出，20天后不定根能长到2-3厘米长，上部叶片有4，5片时就可揭开瓶盖在温室中炼苗 了 ；
6、炼苗2-3天后可取出幼苗，洗去培养基，栽入土中。
权利要求
1. 一种葛根的快速繁殖方法，其步骤是A、以葛根的整个幼芽为外植体；B、用网纱将葛根幼芽包起放在自来水下冲洗1-2小时，用70%体积比的酒精灭菌8-12 秒，无菌水冲洗2-4次，再用10%体积比双氧水灭菌10-14分钟，无菌水冲洗4-6次；C、用消毒镊子接种到MS+0.4-0. 5mg/L2, 4_D的培养基上萌动4_5天后转接到 MS+0. 1-0. 2mg/L6-BA+0. 05-0. lmg/LNAA分化培养基上培养，在萌动后见幼叶欲出，接到分 化培养基上4-5天后，有幼叶抽出，茎节拉长，用消毒剪刀按茎节剪断接入分化培养基上进 行扩繁；D、9-ll天后转接一次进行继代培养，用分化培养基，在观-32天得到无根的无菌扩繁苗；E、转接到1/2MS+0.1-0. 2mg/LNAA的生根培养基上，9_11天看到不定根生出，18-22天 后不定根能长到2-3厘米长，上部叶片有4，5片时就揭开瓶盖在温室中炼苗了 ；炼苗2-3天 后取出幼苗，洗去培养基，栽入土中。
全文摘要
本发明公开了一种葛根的快速繁殖方法，以葛根的整个幼芽为外植体，其步骤是A、用网纱将葛根幼芽包起放在自来水下冲洗，再用酒精灭菌，无菌水冲洗，再用双氧水灭菌，无菌水冲洗；B、用消毒镊子接种到配制好的培养基上萌动后转接到配制好的分化培养基上培养，见有幼叶抽出，茎节拉长，剪断接入上述配制好的分化培养基上进行扩繁；C、用分化培养基进行转接继代培养，得到无根的无菌扩繁苗；D、转接到配制好的生根培养基上，上部叶片有4-5片时就揭开瓶盖在温室中炼苗了；E、炼苗后取出幼苗，洗去培养基，栽入土中。方法易行，操作简便，缩短了葛根无菌苗的组培周期，减少了成本，提高了分化诱导率，幼苗的素质高，成活率高。效率可到90%。
文档编号A01H4/00GK102144555SQ201110029788
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者李长福, 章焰生 申请人:中国科学院武汉植物园