专利名称：一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法
技术领域：
本发明涉及一种核桃苗木的培育方法，具体为一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法。
背景技术：
核桃(Juglans regis L.)为胡桃科(Juglandaceae )胡桃属，是经济、生态及社会效益名列前茅的广域经济林树种，与扁桃、腰果、榛子并称为世界四大干果。随着核桃的营养价值被广泛认知，核桃市场需求空间的剧增，以及果树生产、管理技术的发展和普及，核桃生产正从过去的粗放、半粗放经营状态向科学管理、集约化经营方向转变，随之而来的是对核桃优良品种及其苗木的大量需求，但是不完善的繁殖技术一直是制约核桃优良品种推广及规模化发展的巨大障碍。目前核桃种苗的繁殖方法主要有实生繁殖、嫁接繁殖、组织培养。前两种核桃繁殖技术属于传统育苗技术，在实际应用中存在以下缺点实生繁殖属于有性繁殖，其后代往往发生性状分离，不能保持母株的优良性状；嫁接繁殖属于无性繁殖，后代虽然能保持母株的优良性状，但存在繁殖系数低、速度慢、成苗时间长、成本高、成活率不稳定、受穗条数量限制等不利因素，尤其是当接穗插入砧苗接口后所形成的嫁接口未作适当处理，极易被污染， 难于愈合，造成自身营养成份的流失，从而大大影响了核桃苗木的嫁接成活率，这是造成传统核桃苗木繁殖系数低的一个关键问题。核桃组织培养技术是核桃种苗培育的新兴技术， 自20世纪80年代兴起以来，至今已经发展到了一定阶段，一些关键的技术问题正在科研人员的不断探索中得到解决，如外植体的选择和灭菌、抑制外植体褐化等方面。但核桃属于较难诱导不定根发生的经济树种，除了核桃杂交种奇异核桃的生根率较高外，其它种类的核桃组织培养生根率一直较低而且不稳定，从而导致难以实现核桃的工厂化育苗。
发明内容
本发明为了解决核桃实生繁殖易产生变异、嫁接繁殖因接口处易发生污染而导致成活率较低以及组织培养繁殖难以生根等制约核桃工厂化育苗的问题，提供一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法。本发明是采用如下技术方案实现的一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法，包括以下步骤
(1)组织培养茎段的获得
从母树上采下核桃嫩枝，用自来水冲洗干净，常规消毒；
(2)组织培养茎段的试管内处理
将消毒后的核桃嫩枝在盖膜的培养瓶中进行初代培养，初代培养基为DKW(Driver and Kuniyuki，1984)培养基，附加BA (苄基腺嘌呤)2. Omg/L，IBA (吲哚丁酸)0. 5mg/L，获得无菌组织培养茎段；
待无菌组织培养茎段的芽萌发并长至2cm时，转入增殖培养，增殖培养基为DKW培养基，附加BA 1. 2mg/L, IBA 0. 01mg/L，增殖系数为4，获得增殖的组织培养茎段；
当增殖的组织培养茎段在高度达到4. 0-5. 5cm、粗度达到0. 2-0. 3cm时，放在生根培养基中暗培养6天，生根培养基为MS (Murashige and Skoog medium，1962)培养基，其中大量元素减半，附加IBA 10mg/L，获得生根培养的组织培养茎段；
上述初代培养、增殖培养、生根培养的培养室温度为20-25°C，湿度为60% ；
(3)组织培养茎段的试管外扦插
首先是扦插基质的准备，将过筛干净的河沙在扦插苗床铺厚度为IOcm的扦插层，铺好后，用800倍的多菌灵药液喷透(以防止杂菌滋生)，利用和扦插组织培养茎段粗度相同的树枝在扦插苗床上按株距5cm、行距8cm、孔深2cm的标准进行插孔(可以保证组织培养茎段基部不磨损，从而可以防止基部褐化，影响根的正常生长)；
其次是经试管内处理后组织培养茎段的扦插，将步骤(2)中经试管内处理的组织培养茎段从培养瓶中取出，洗去基部的培养基，放入已插好孔的扦插基质中，待插满时，用喷壶均勻喷水，弥合所有插孔中的缝隙(防止组织培养嫩茎和扦插基质接触不紧密而使组织培养茎段失水)；
(4)组织培养茎段的扦插后管理和移栽
控制扦插苗床的白天温度为23°C _25°C，夜间温度为18°C _20°C，空气湿度保持在90% 以上，扦插10天后，当扦插组织培养茎段基部切口愈合，将其转插至泥炭珍珠岩蛭石为 1 :1 1的营养基质中，当扦插组织培养茎段基部根发出Icrn左右时，逐渐减小空气湿度，加强光照，直至完全去掉保护措施，当苗高15cm时，将其移栽于大田，进行常规管理。本发明中所用的MS培养基是目前使用最普遍的培养基，具有较高的无机盐浓度， 能够保证组织生长所需的矿质营养；DKW培养基的成分以及比例也是本领域普通技术人员所熟知的，包括硝酸铵、硼酸、无水氯化钙等十几种成分，附加的BA和IBA也是本领域公知
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广 PFt ο特别注意的是，挑选健壮的组织培养茎段，即高度为4. 0-5. 5cm,粗度为 0. 2-0. 3cm的组织培养茎段，这是后续组织培养茎段生根、移栽成活率的基础；暗培养是核桃组织培养茎段生根的必要条件，并且暗培养必须有一定的天数才能使试管苗生根，但时间也不能太长，暗培养时间过长，一方面影响组织培养茎段上叶片的功能，另一方面也使生根受到了抑制。与现有的组织培养生根相比，本发明提供的核桃组织培养茎段试管内处理试管外扦插生根的方法，由于不定根直接从皮层长出，没有任何愈伤组织发生，且不定根的须根发达，根牢固长在组织培养茎段插入基质的部分，不易脱落，使组织培养茎段能够形成完整植株而正常生长，而组织培养生根通过愈伤组织诱导，根是从基部切口处愈伤组织中产生的， 这样在移栽过程中，愈伤组织容易变褐，根系与其上部之间的养分和水分不能互通，最后导致整个植株死亡，这是核桃组织培养难以实现工厂化育苗的瓶颈所在。本发明所述的方法将核桃组织培养茎段的生根从试管内转到试管外，成功使核桃组织培养茎段产生正常根系，形成完整植株。总之，本发明将核桃组织培养茎段试管内处理和试管外扦插相结合，解决了核桃工厂化繁育面临的瓶颈问题，该方法可以使组织培养茎段扦插生根率达到80%以上，移栽成活率达到75%以上。本发明所述的核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法具有节约成本、节约室内培养空间、缩短育苗周期、提高移栽成活率、可以周年生产、种苗整齐等特点，具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。
具体实施例方式一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法，包括以下步骤
(1)组织培养茎段的获得
从母树上采下核桃嫩枝，采摘的核桃嫩枝以春天新发出的嫩枝较好，可以减少接种污染率，提高初培萌发率，后用自来水冲洗干净，进行常规消毒，具体操作包括在超净工作台上先用70%酒精浸泡30秒，再用0. 1%的氯化汞消毒5分钟，然后在无菌水中震荡冲洗5次， 每次时间不少于5分钟；
(2)组织培养茎段的试管内处理
将消毒后的核桃嫩枝在盖膜的培养瓶中进行初代培养，初代培养基为DKW培养基，附加BA 2. Omg/L, IBAO. 5mg/L,获得无菌组织培养茎段；
待无菌组织培养茎段的芽萌发并长至2cm时，转入增殖培养，增殖培养基为DKW培养基，附加BA 1. 2mg/L, IBA 0. 01mg/L，增殖系数为4，获得增殖的组织培养茎段；
当增殖的组织培养茎段在高度达到4. 0-5. 5cm、粗度达到0. 2-0. 3cm时，放在生根培养基中暗培养6天，生根培养基为MS培养基，其中大量元素减半，附加IBA 10mg/L，获得生根培养的组织培养茎段；
上述初代培养、增殖培养、生根培养的培养室温度为20-25°C，湿度为60% ；
(3)组织培养茎段的试管外扦插
首先是扦插基质的准备，将过筛干净的河沙在扦插苗床铺厚度为IOcm的扦插层，铺好后，用800倍的多菌灵药液喷透，利用和扦插组织培养茎段粗度相同的树枝在扦插苗床上按株距5cm、行距8cm、孔深2cm的标准进行插孔；
其次是经试管内处理后组织培养茎段的扦插，将步骤(2)中经试管内处理的组织培养茎段从培养瓶中取出，洗去基部的培养基，放入已插好孔的扦插基质中，待插满时，用喷壶均勻喷水，弥合所有插孔中的缝隙；
(4)组织培养茎段的扦插后管理和移栽
控制扦插苗床的白天温度为23°C _25°C，夜间温度为18°C _20°C，空气湿度保持在90% 以上，扦插10天后，当扦插组织培养茎段基部切口愈合，将其转插至泥炭珍珠岩蛭石为 1 1 1的营养基质中，当扦插组织培养茎段基部根发出Icrn左右时，通过揭膜，逐渐减小空气湿度，加强光照，直至完全去掉保护措施，当苗高15cm时，将其移栽于大田，进行常规管理。具体实施时，在组织培养茎段的试管外扦插时，将过筛干净的河沙放在5X10的穴盘中，利用和扦插组织培养茎段粗度相同的树枝在穴盘中按孔深2cm的标准进行插孔。 穴盘移栽时可以不动根系，有利于移栽成活。
权利要求
1.一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法，其特征在于包括以下步骤(1)组织培养茎段的获得从母树上采下核桃嫩枝，用自来水冲洗干净，常规消毒；(2)组织培养茎段的试管内处理将消毒后的核桃嫩枝在盖膜的培养瓶中进行初代培养，初代培养基为DKW培养基，附加BA2. Omg/L, IBAO. 5mg/L,获得无菌组织培养茎段；待无菌组织培养茎段的芽萌发并长至2cm时，转入增殖培养，增殖培养基为DKW培养基，附加BA 1. 2mg/L, IBA 0. 01mg/L，增殖系数为4，获得增殖的组织培养茎段；当增殖的组织培养茎段在高度达到4. 0-5. 5cm、粗度达到0. 2-0. 3cm时，放在生根培养基中暗培养6天，生根培养基为MS培养基，其中大量元素减半，附加IBA 10mg/L，获得生根培养的组织培养茎段；上述初代培养、增殖培养、生根培养的培养室温度为20-25°C，湿度为60% ；(3)组织培养茎段的试管外扦插首先是扦插基质的准备，将过筛干净的河沙在扦插苗床铺厚度为IOcm的扦插层，铺好后，用800倍的多菌灵药液喷透，利用和扦插组织培养茎段粗度相同的树枝在扦插苗床上按株距5cm、行距8cm、孔深2cm的标准进行插孔；其次是经试管内处理后组织培养茎段的扦插，将步骤(2)中经试管内处理的组织培养茎段从培养瓶中取出，洗去基部的培养基，放入已插好孔的扦插基质中，待插满时，用喷壶均勻喷水，弥合所有插孔中的缝隙；(4)组织培养茎段的扦插后管理和移栽控制扦插苗床的白天温度为23°C _25°C，夜间温度为18°C _20°C，空气湿度保持在90% 以上，扦插10天后，当扦插组织培养茎段基部切口愈合，将其转插至泥炭珍珠岩蛭石为 1 :1 1的营养基质中，当扦插组织培养茎段基部根发出Icrn左右时，逐渐减小空气湿度，加强光照，直至完全去掉保护措施，当苗高15cm时，将其移栽于大田，进行常规管理。
2.根据权利要求1所述的核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法，其特征在于所述的核桃嫩枝为春天新发出的嫩枝。
3.根据权利要求1或2所述的核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法，其特征在于在组织培养茎段的试管外扦插时，将过筛干净的河沙放在5X10的穴盘中，利用和扦插组织培养茎段粗度相同的树枝在穴盘中按孔深2cm的标准进行插孔。
全文摘要
本发明涉及一种核桃苗木的培育方法，具体为一种核桃组织培养茎段试管内处理试管外生根的方法。解决核桃实生繁殖易产生变异、嫁接繁殖因接口处易发生污染而导致成活率较低以及组织培养繁殖难以生根等制约核桃工厂化育苗的问题。具体步骤如下1)获取核桃组织培养茎段；2)组织培养茎段的试管内处理；3)组织培养茎段的试管外扦插；4)组织培养茎段的扦插后管理管理和移栽。该方法将核桃组织培养、组织培养茎段试管内处理和试管外扦插生根相结合，建立了一种高效的核桃组织培养茎段扦插生根育苗技术，扦插生根率达到80%以上，移栽成活率达到75%以上。该技术具有节约成本、缩短育苗周期、提高移栽成活率、周年生产、种苗整齐等特点，极具推广价值。
文档编号A01H4/00GK102217538SQ201110125919
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者张拥兵, 李春燕, 王国平, 田歌, 肖蓉, 陈秋芳 申请人:山西省农业科学院果树研究所