专利名称：冠菌酸在作为棉花脱叶剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及冠菌酸的一种新用途，具体是在作为棉花脱叶剂中的应用。
背景技术：
冠菌酸(coronafacic acid, CFA)是冠菌素(coronatine C0R)合成的一个前体聚酮化合物。CFA在抑制根下胚轴的生长、诱导马铃薯(Soianum tuberosum L. cv. Irish Cobbler)块茎形成、促进马铃薯块茎细胞扩充、抑制大豆(Glycine max L. cv. Acme)愈伤组织细胞分裂和促进燕麦(Avena sativa L. cv. Victory No. 1)叶片衰老等几个方面都具有生物活性。冠菌酸的分子结构式C12H1603。目前棉花的采收已机械化，但是机械采收前需对棉花施加脱叶剂。
发明内容
本发明的一个目的是提供冠菌酸的一种新用途。本发明所提供的新用途为冠菌酸在作为植物脱叶剂中的应用。上述应用中，所述植物为棉花。上述应用中，所述冠菌酸为浓度为50mg/L-400mg/L或100mg/L-400mg/L或IOOmg/ L-300mg/L 或 200mg/L-400mg/L 或 200mg/L_300mg/L 的冠菌酸水溶液。本发明的另一个目的是提供一种将冠菌酸作为棉花脱叶剂进行使用的方法。本发明所提供的将冠菌酸作为棉花脱叶剂进行使用的方法，包括如下步骤将冠菌酸水溶液喷洒棉花的茎叶。上述使用方法中，所述冠菌酸水溶液的浓度为50mg/L-400mg/L或IOOmg/ L-400mg/L 或 100mg/L-300mg/L 或 200mg/L-400mg/L 或 200mg/L-300mg/L。上述任一使用方法中，所述棉花为吐絮率40%以上或35%以上的棉花。上述任一使用方法中，所述棉花为吐絮率为35% -75%或40% -50%的棉花。上述新用途或使用方法中，所述棉花为国欣棉3号、国欣棉8号或鲁棉研观号。本发明利用冠菌酸进行脱叶，具有用量少、效果好、环境污染小的特性。本发明的冠菌酸来自于微生物发酵液，当其喷到棉株14天后脱叶率达到80%以上，棉铃吐絮率可达 75%以上。通过试验比较，处理后7天，200mg/L的CFA与300mg/L的目前广泛使用的脱叶剂噻苯隆(TDz)处理效果等同，300-400mg/L的CFA脱叶效果优于300mg/L的TDZ处理。处理后14天，200mg/L的CFA处理脱叶率可达80 %，较清水对照高45. 7 %，效果与300mg/L的 TDZ相近。同时，处理后7天，CFA处理的吐絮率呈增加趋势。处理后14天，CFA处理的吐絮率可达75%左右，较对照高17. 8-22.0%。
图1为冠菌酸的HPLC法测定标准曲线
图2为实施例1的HPLC测定冠菌酸标样(A)、冠菌酸粗提样品(B)及纯化后的冠菌酸样品(C)
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如下实施例1-3中使用的CFA均可按照现有方法制备得到，可如中国专利 200810119153. 2中所述。具体制备方法如下1、发酵挑取冷冻保存的丁香假单胞菌大豆致病变种CGMCC MW123 2533(记载在中国专利 200810119153. 2 中)于斜面培养基(配方为 2%蛋白胨，0. KH2PO4 0. 05% NaCl 0. 1% MgSO4 · 7H20,1. 3%的琼脂粉，溶剂为水；该培养基的pH 7. 0)上，28°C培养48_60h使其活化，然后挑取一环活化好的菌体，接入含有lOug/ml的卡那霉素和30ug/ml的链霉素的液体培养基(配方为2%蛋白胨，0. KH2PO4 0. 05% NaCl 0. 1 % MgSO4 · 7H20 ；溶剂为水; 该培养基的PH 7.0 ;121°C灭菌30min)中，28°C培养36_48h，到对数期时，取培养菌液按 5% (体积比)接种量接入发酵培养基(蔗糖15g，氯化铵1. Og, KH2PO4 4. lg，K2HPO4 3. 6g， MgSO4 ·7Η20 0. 2g, KNO3 0. 3g,2mM FeCl3 10ml，用蒸馏水定容至 1000ml。该培养基的 pH 7.0)中，在温度为18°C、转速为260rpm的条件下发酵3天。2、纯化取步骤1的发酵液5L在室温条件下5000g离心5分钟，收集上清液，调节pH值为 2。将50克HPD300大孔吸附树脂用乙醇充分浸泡24h，待树脂充分溶胀后用蒸馏水洗涤至无乙醇，装入吸附柱中，用3倍柱体积的3-5% (体积百分比)的盐酸溶液以IOL/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH = 7.0;用3-5% (体积质量百分比)的NaOH溶液以IOL/小时的速度通过柱子，并浸泡3h，用水平衡至pH = 7. O ；用蒸馏水浸泡树脂备用。将上述所得上清液5L加入吸附柱中吸附速率(吸附柱底部流出液的速度)为4 升/小时；吸附完毕后用蒸馏水冲洗吸附柱直到流出液澄清，然后用4倍柱体积的丙酮洗脱，洗脱速率为3升/小时(吸附柱底部流出液的速度)，收集第3-4个柱体积的洗脱液。 在室温下、真空度0. 07-0. 09MPA下减压浓缩该丙酮洗脱液得浸膏，在45°C干燥得冠菌酸产品。将该冠菌酸产品用色谱级甲醇进行溶解。冠菌酸标准品的制备和检测按照如下文献中的方法进行Jones WT, Harvey D, Mitchell RE, Ryan GB, Bender CL, ReynoldsPHS(1997) Competitive ELISA employing monoclonal antibodies specific for coronafacoyl amino acid conjugates. Food Agric Immunol 9:67—76。根据标样浓度及峰面积建立冠菌酸检测线性曲线。如图1。冠菌酸的纯度则由分析型高效液相色谱仪(流速每分钟1毫升)给出。其中，分析型高效液相色谱仪的型号岛津CBM-10A VP PULS，所采用的色谱柱的型号 Agela4. 6*250mm C18。色谱操作条件洗脱液是80%色谱甲醇溶液，时间10分钟。根据纯化后冠菌酸含量浓度与纯化前样品中冠菌酸浓度的比值计算冠菌酸收率。 其中，用于上样检测的纯化前样品中冠菌酸的上样液按照如下方法制备取ImL步骤1的发酵液到离心管内，5000rpm离心3min，取0. 5mL上清液到新的离心管内，每支离心管内加30uL 3M HC1，用等体积乙酸乙酯萃取3遍，收集有机相55°C水浴吹干所得物或自然风干。 甲醇溶解高效液相色谱检测冠菌酸含量。根据纯化后冠菌酸含量浓度与纯化前样品中冠菌酸浓度的比值计算冠菌酸收率为82%，根据冠菌酸峰面积所占全部样品总峰面积的比例，计算冠菌酸纯度为90% (见图 2)。图2为标准品(A)、冠菌酸粗提样品(B)和本实施例提取得到的冠菌酸纯度为 90%产品的HPLC图谱。冠菌酸在该色谱条件下的保留时间是7分钟。图2的横坐标为保留时间(分钟)。如下实施例1-3中，脱叶率统计方法脱叶率(％)=(施药前叶片数-施药后7天或14天的叶片数)/施药前叶片数 X 100%如下实施例1-3中，吐絮率统计方法施药前吐絮率(％ )=施药前吐絮数/总铃数X 100%施药后吐絮率(％ )=施药后7天或14天吐絮数/总铃数X 100%国欣棉3号购自河北省国欣种业公司。国欣棉8号购自河北省国欣种业公司。鲁棉研28号由山东棉花研究中心提供。实施例1、田间实验试验于2010年9月在河北省河间市国欣农研会试验田进行。以国欣棉3号为材料，将CFA用水配成浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L的溶液，以 300mg/L的噻苯隆(TDZ)和清水为对照。采用随机区组实验设计，设7个处理，重复3次， 每小区面积为6mX4m = 24m2。施药当天晴，试验期间无大风。采用微型喷雾器对吐絮率达 45 %的棉株进行茎叶喷施处理，每小区喷药液量为0. 8L。每小区选取6株挂牌，在施药前调查各小区叶片数、总铃数和吐絮数，在施药后7天和施药后14天分别调查各小区叶片数和吐絮数，以计算各处理叶片脱落率和棉铃吐絮率。 7天后统计脱叶率和吐絮率，结果表明，200 400mg/L的CFA脱叶效果优于 300mg/L的TDZ处理，较清水对照高71. 0 76. 2 %。14天后，200mg/L的CFA处理脱叶率可达80%以上，较清水对照高45. 7%，效果与300mg/L的TDZ相近。同时，处理后14天， 200 400mg/L CFA处理的吐絮率较清水对照高10. 1 16. 2%。
实施例1结果单位(％ )
权利要求
1.冠菌酸在作为植物脱叶剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述植物为棉花。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述冠菌酸为浓度为50mg/L-400mg/ L 或 100mg/L-400mg/L 或 100mg/L_300mg/L 或 200mg/L_400mg/L 或 200mg/L_300mg/L 的冠菌酸水溶液。
4.一种将冠菌酸作为棉花脱叶剂进行使用的方法，包括如下步骤将冠菌酸水溶液喷洒棉花的茎叶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述冠菌酸水溶液的浓度为50mg/ L-400mg/L 或 100mg/L-400mg/L 或 100mg/L_300mg/L 或 200mg/L_400mg/L 或 200mg/ L-300mg/Lo
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述棉花为吐絮率40%以上或35% 以上的棉花。
7.根据权利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述棉花为吐絮率为35%-75% 或40% -50%的棉花。
全文摘要
本发明公开了冠菌酸的一种新用途。该新用途为冠菌酸在作为植物脱叶剂中的应用。实验证明，将冠菌酸作为脱叶剂，脱叶效果好。本发明脱叶剂具有用量少、效果好、环境污染小的特性。本发明的冠菌酸来自于微生物发酵液，当200mg/L冠菌酸喷到棉株14天后脱叶率达到80％以上，与300mg/L噻苯隆处理效果等同。
文档编号A01P21/00GK102273453SQ20111015108
公开日2011年12月14日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者任晓明, 吴慧玲, 岳跃森, 张明才, 李召虎, 杜明伟, 段留生, 田晓莉, 谭伟明 申请人:中国农业大学