专利名称：玉米bHLH类转录因子基因ZmMIT1及其编码蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种玉米bHLH类转录因子编码基因 ZmMITl及其编码蛋白的应用。
背景技术：
随着人口增长和工业化的发展，废渣废水的排放及矿山废弃地的增加，加之各种化学物质的广泛使用，重金属污染对人类健康和农作物生产造成的危害日益突出。锰作为一种分布极其广泛的重金属，是植物生长发育必需的微量元素，直接参与植物光合作用中电子传递系统的氧化还原过程，但过量的锰会污染土壤，对植物生长发育造成胁迫和毒害。 目前，锰毒已成为酸性土壤中作物产量和品质提高的主要限制因子。国内外学者对植物耐受锰毒机制进行了大量研究，归纳起来主要有以下三个方面第一，有机化合物螯合作用(Plant Soil，1996，180 :57-66)。根系分泌的有机酸等有机物通过螯合重金属或酸化根际来促进土壤重金属的溶解和根系的吸收。其中，有机物对金属的螯合作用一般通过两种方式实现，一种是外部解毒即有机化合物进入根际后能与金属形成稳定的复合体，阻止锰进入共质体，达到体外解除锰毒的目的；另一种属于内部解毒即有机物与金属在植物体内结合形成更为稳定的络合物，消除锰对植物的毒害。第二， 氧化、外排与积累(Plant Mol Biol, 1998,49 643-668 ；Plant Cell Environ, 1998,11 383-394)。植物在锰毒害时，有时通过将锰氧化成非有效态而限制过量锰的吸收和运输， 这在一些渍水条件下生长的植物上表现尤为明显。一些植物抗性品种的锰通常在体内均勻分布，并积累在非代谢区域如液泡中。液泡隔离一直是植物耐重金属毒性的重要机制之一。锰除了被积累外，还可能被转化成其他形态贮存在植物体内，通过衰老机制排出体外。 第三，金属转运蛋白和金属结合蛋白参与对锰毒害的解除作用。拟南芥ZIP(ZinCRegUlated Protein/Iron Regulated Protein, ZRT/IRT)基因家族中的IRTl编码金属转运蛋白，能够转运锰离子来增强对锰毒的耐性(Plant Mol Biol, 1999,40 37-44) 0在细胞膜上还存在一类与金属转运有关的Nramp基因家方矣(Natural resistance associated macrophage proteins)，其中SMFl能跨膜转运锰离子，从而减轻锰毒害。在液泡膜上也存在一类转运蛋白CDF(Cation diffuse facilitator)，通过将锰离子转运到液泡中积累来增强耐性 (Plant Cell,2003,15 :1131_1142)。另外，金属结合蛋白如金属硫蛋白和植物螯合肽在增强植物对重金属抗性方面发挥着重要作用。bHLH (basic helix-loop-helix, bHLH)类转录因子是一段具有螺旋-环-螺旋结构域的蛋白质。它由一个能与DNA结合的碱性区域(Basic region)和两个α螺旋组成的结构，在生物的生长发育及适应环境等过程中起着重要的调控作用(Proc Natl Acad Sci USA, 1997，94 :5172_5176)。目前已知拟南芥和水稻基因组中bHLH基因家族分别有147个和167个成员(Plant Cell，2003，15 1749-1770) 0已有的研究表明bHLH类转录因子能提高植物对低温、干旱、高盐和氧化胁迫的抗性及低铁胁迫的适应性。水稻OsbHLHl基因编码 bHLH类转录因子，受低温诱导表达。将OsbHLHl导入拟南芥，发现2_4度条件下处理2周后，虽然二者的生长发育较正常生长条件下均明显延缓，但是与对照相比，转基因植株抽苔时间较早、生长快，基叶衰老速度明显低于对照。这表明过量表达OsbHLHl能显著提高转基因植株的耐低温和抗氧化胁迫能力(高技术通讯，2004，14:35-38)。拟南芥FITl基因作为 bHLH类转录因子家族中的成员，参与了植物对铁吸收的调控。在缺铁条件下，AtFITl能与其它的bHLH蛋白相互作用，形成异源二聚体而启动下游功能基因三价铁还原酶AtFR02和高亲和力亚铁离子转运蛋白AtIRTl等的表达，提高植物的吸铁效率。玉米作为我国重要的粮食作物，有关bHLH类转录因子研究的报道并不多。最近Li 等(2011)在玉米中克隆了一个bHLH类转录因子基因ZmPTFl，过量表达该基因能提高玉米对低磷胁迫的耐受性(Planta，2011，233 1129-1143)。然而，目前玉米中尚未见受锰胁迫诱导表达的bHLH类转录因子基因的克隆与功能鉴定的报道。
发明内容
本发明提供一种受重金属锰胁迫诱导表达的玉米bHLH类转录因子编码基因 ZmMITl (Manganese-Induced Transcription Factor 1)及其编码蛋白的应用；该基因能提高植物对重金属锰胁迫的抗性，尤其是能够提高烟草抗锰毒的能力。玉米bHLH类转录因子基因ZmMITl，其由序列表SEQ ID NO 3的核苷酸序列定义。玉米bHLH类转录因子基因ZmMITl的编码蛋白，其由序列表SEQ ID NO: 12的氨基酸序列定义。所述的玉米bHLH类转录因子基因ZmMITl基因及其编码蛋白在培育抗重金属锰胁迫的转基因植株中的应用。本发明的有益效果为本发明中，MnC12处理的玉米幼苗叶片中，所述的转录因子基因ZmMITl被诱导表达。本发明所述的蛋白ZmMITl是属于bHLH类转录因子蛋白，是植物对逆境胁迫信号响应的上游关键调控因子，所以调控ZmMITl的表达能够调节植物对重金属锰毒的抗性。因此所述的编码锰诱导的转录因子ZmMITl的基因ZmMITl在植物抗重金属污染领域，特别是玉米抗土壤锰毒领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。
图1 重组质粒pGEM-T-ZmMITl的酶切验证电泳图；图2 玉米幼苗叶片中ZmMITl基因响应不同重金属胁迫的表达模式柱状图；图3 =ZmMITl基因植物表达载体构建示意图；图4 转ZmMITl基因的烟草株系表达水平柱状图；图5 转ZmMITl基因的烟草幼苗对锰胁迫处理的生长表型照片；图6 转ZmMITl基因的烟草幼苗对锰胁迫处理的生长表现柱状图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1 材料处理 玉米(Zea mays L.)自交系郑58 ；购自河南省农业科学院作物所。
玉米材料处理 消毒挑选饱满的玉米种子，经蒸馏水浸泡24h后，用0. 1 %的升汞消毒5分钟并用灭蒸水冲洗5遍。A，发芽将所述的充分吸水的种子在28°C，黑暗条件下发芽；具体操作为将所述的充分吸水的种子播在铺有一层吸水棉的瓷盘中，上面覆盖两层湿的吸水纱布，黑暗条件下吸水3天。B，不同重金属离子的胁迫处理将发芽的种子移至含蒸馏水的培养皿中，在温度为24-26°C、湿度为60%、光暗交替周期为12h/12h的光照培养室中培养。待幼苗长至二叶一心(约10天)时，倒掉蒸馏水，进行Mn2+、Cu2+、Fe3+和Zn2+溶液胁迫处理实验。MnCl2溶液的浓度为10mM，CuCl2溶液的浓度为0. 3mM, FeCl3溶液的浓度为ImM和ZnCl2溶液的浓度为0. 6mM ；处理的时间分别为1、3、6、12、24、48小时；胁迫处理后的玉米作为实验者，未做胁迫处理的玉米幼苗作为对照组。实施例2 =ZmMITl基因的克隆A.玉米叶片总RNA的分离和纯化1.总RNA的提取(1)液氮研磨叶片至粉末状，取适量加入2ml离心管中，同时加入Iml TRIZOL裂解液，震荡混勻，室温静置5min。(2) 4°C，12，OOOrpm离心15min，取上清于新的离心管中。(3)加入200 μ 1氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3分钟。(4) 4°C，12，OOOrpm 离心 15min。(5)吸取上层水相400-600 μ 1，于新的离心管中。(6)加入和上步吸取液等体积的异丙醇，轻柔混勻，室温静置5-lOmin。(7) 4°C，12，OOOrpm离心lOmin，弃上清，RNA此时沉于管底。(8)加入Iml 75%乙醇，轻柔振荡离心管，悬浮沉淀，室温静置5min。(9)4°C,8, OOOrpm 离心 5min，尽量弃净上清。(10)重复步骤⑶，(9) 一次。(11)室温晾干或真空干燥5-lOmin。(12)加入40 60 μ 1 DEPC处理并高压灭菌过的H2O或TE buffer溶解RNA样品。2. RNA的纯化(以总RNA为50 μ 1为例)(1)纯化体系
RNA50 μ
DNase (RNase Free, lu/μ )6.25 μ
RNase Inhibitor0.5 μ
10 xDNaseBuffer7.5 μ
DEPC-H2O加至总体系100 μ (2) 37°C温浴 30min，去除 RNA 中的 DNA。(3)力口 DEPC-H20 至 300 μ 1。
(4)加入300 μ 1的酚/氯仿(1:1)，摇勻静置5min。(5) 4°C，12，OOOrpm 离心 15min，吸上清。(6)加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀l_2h。(7)重复 3. 2. 2. 1 中(7)至(11)步骤。(8)加入30 40 μ 1用DEPC处理并高压灭菌过的H2O或TE buffer溶解RNA样
权利要求
1.玉米bHLH类转录因子基因ZmMITl，其特征在于，其由序列表SEQID NO :3的核苷酸序列定义。
2.玉米bHLH类转录因子基因ZmMITl的编码蛋白，其特征在于，其由序列表SEQID NO 12的氨基酸序列定义。
3.根据权利要求1或2所述的玉米bHLH类转录因子基因ZmMITl基因及其编码蛋白在培育抗重金属锰胁迫的转基因植株中的应用。
全文摘要
本发明提供一种受重金属锰胁迫诱导表达的玉米bHLH类转录因子编码基因ZmMIT1(Manganese-Induced Transcription Factor 1)及其编码蛋白的应用；该基因能提高植物对重金属锰胁迫的抗性，尤其是能够提高烟草抗锰毒的能力。ZmMIT1在玉米抗重金属污染领域具有广阔的应用前景。
文档编号A01H5/00GK102229937SQ20111015037
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者丁俊强, 吴建宇, 夏宗良, 孙凯乐, 李志敏, 苏新宏 申请人:河南农业大学