专利名称：一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法。
背景技术：
纤维素是木材的主要组分，是地球上具重要经济价值的可再生资源，自然界每年可生产约1，800亿吨的纤维素。并且，由于木材包含木本植物光合作用产生的绝大部分生物量，因此林木是人类最主要的可再生资源，与国计民生息息相关，更是制浆造纸工业、建筑业、纺织业以及新兴的生物能源产业的重要原材料。木材为木本植物的次生木质部，其中次生细胞壁构成了木材的绝大部分生物量， 它的形成主要依赖于次生木质部的年度周期性生长和累加，即通常所说的植物次生生长。 次生细胞壁形成直接关系到纤维生物质的积累，这一过程主要包括纤维素和半纤维素、木质素等生物合成及组装。特别是纤维素的定向排列和木质素的沉积是次生细胞壁形成过程中的标志性事件。木材中通常纤维素含量约占45 %，半纤维素约占30 %和木质素约占25 %，通常称为木质纤维素生物质。它是制浆造纸工业的重要原料之一，也是高档纸品生产的主要原料， 生产中利用的主要成分为其中的纤维素。而木质素则需要在制浆过程中利用大量的化学品从原料中分离，留下的纤维素用于造纸。在生物能源产业中，利用木质纤维生物质材料生产乙醇已成为第二代生物基液体燃料研究的热点。目前已经市场化的生物燃料主要包括以粮食为加工原料的第一代生物乙醇和以植物油为加工原料的生物柴油，这两种生物燃料的发展都遭遇了生产原料不足的瓶颈问题。与之相比，第二代生物燃料纤维素乙醇的发展因原材料充足，显示出巨大的产业应用潜力。因此，我国《能源发展“十一五”规划》、《可再生能源中长期发展规划》等一系列政策法规中明确提出“积极发展以纤维素生物质为原料的生物液体燃料技术”。同时以法规的形式禁止玉米等粮食作物在生物乙醇生产中的应用。在燃料乙醇行业中起作用的主要是纤维素和半纤维素，木质素作为一种副产物，必须采取有效的预处理工艺进行脱除；目前由于五碳糖的发酵相对困难，燃料乙醇行业中利用的主要是纤维素。预处理后通过酸水解或酶水解等方法把木质纤维素生物质中纤维素分解成可用于乙醇发酵的葡萄糖，这个过程称为 “糖化”。经预处理和糖化过程获得的单糖，可直接用于微生物发酵，生产生物乙醇。总的来说，木质纤维素生产燃料乙醇包括预处理、糖化和发酵三个工艺过程。综上所述，纤维素的含量和存在形式直接影响制浆造纸过程中纸浆得率和生物发酵乙醇的产率。因此，通过定向育种手段，提高木材中纤维素的含量在产业上具有重要的经济价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁中纤维素含量提高的转基因植物。所述4-香豆酸CoA连接酶为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述4-香豆酸CoA连接酶的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列1第180位到1568位所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因；4)与1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因。所述降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达是通过将4-香豆酸 CoA连接酶编码基因的反义基因导入目的植物中实现的。所述4-香豆酸CoA连接酶编码基因的反义基因的核苷酸序列与序列表中序列1 第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补。所述降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达是通过将重组表达载体pAS4CLl导入目的植物中实现的；所述重组表达载体pAS4CLl是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和 MlI酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体PBI121的BamHI和 SacI位点间，替换载体PBI121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从)(bal至MlI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和MlI位点间，得到的重组载体 PAS4CL1。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为毛白杨(Populus tomentosa)0
本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体。本发明所提供的重组表达载体，是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和 MlI酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体PBI121的BamHI和 SacI位点间，替换载体PBI121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从)(bal至MlI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和MlI位点间，即得到的所述重组表达载体。所述重组表达载体在提高植物细胞壁中纤维素含量中的应用也属于本发明的保护范围。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为毛白杨(Populus tomentosa)0本发明通过转基因技术和反义RNA技术结合，获得4CL基因表达受到抑制的转基因杨树，转基因杨树成熟木材的细胞壁中纤维素含量显著增加，转基因植株较野生型对照
4植株细胞壁中纤维素含量增加了 3% -7%。
图1为毛白杨茎次生木质部的总RNA快速电泳示意图。。图2为4CL特异性RT-PCR扩增产物电泳图。图3为中间载体pBI121-M示意图。图4为植物双元表达载体pAS4CLl示意图。图5为表达反义4CL基因的转基因毛白杨RT-PCR检测结果。图6为表达反义4CL基因的转基因毛白杨Wfestern blot检测结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、细胞壁合成相关基因克隆木材即是植物的次生细胞壁，主要由纤维素、木质素和半纤维素三种成分组成，也就是我们通常所说的纤维生物质。利用基因工程方法，改变细胞壁组分，有望提高能源植物生物质在燃料乙醇生产中的利用效率。选择木质素单体合成途径的早期酶促反应的关键酶基因，即4-香豆酸CoA连接酶(4CL，coumarate =CoA ligase)基因，进行表达调控，在改变细胞壁中纤维素、木质素组分的基础上，提高木材原材料的产业应用效率。毛白杨(Populus tomentosa)4CL基因全长cDNA序列是通过反转录PCR(RT-PCR) 方法获得的。首先以毛白杨次生木质部总RNA为模板，通过反转录，合成cDNA第一链；再以 cDNA第一链为模板，通过PCR扩增克隆出全长基因。具体方法如下一、总RNA的分离提取选取田间生长一年以上的毛白杨(Populus tomentosa)(购自宁夏莱州市兴林园艺场)，剥掉树干的树皮后，用手术刀片刮取茎杆外部一层白色组织，作为次生木质部材料用于总RNA的提取。取材过程中所用剪刀、手术刀片均经高温烘烤后使用。刮取的次生木质部材料置于没有RNA酶污染的离心管中，立刻投入液氮中保存。使用TRIzol (购自Invitrogen)提取毛白杨次生木质部的RNA。取IOOmg毛白杨次生木质部材料，液氮研磨后，转移到1. 5ml离心管中，迅速加入Iml TRIzol试剂，25°C下温育5min ；4°C下12000rpm离心IOmin ；取上清水相，转移到一新的离心管中，加0. 2ml氯仿，剧烈震荡；25°C下温育:3min ；4°C下12000rpm离心15min ；取上清水相，转移到一新的离心管中；加等体积5M LiCl，混勻；-20°C下静止lhr，沉淀RNA ； 12000rpm离心45min，4°C ； 弃上清，加Iml 75%乙醇，7500rpm离心5min，2-8°C;重复3次；弃乙醇，超镜台中空气干燥 IOmin ；加50 μ 1 DEPC处理的双蒸水溶解lOmin，55_60°C。毛白杨茎干次生木质部的总RNA 快速电泳如图1所示。二、RT-PCR方法扩增4CL基因使用Thermc^cript RT-PCR试剂盒(购自Invitrogen)，按照说明书的说明合成 00嫩第一链。以01丨80((11020为引物，421保温1虹，之后加入1口1 RNase H(2U/μ 1), 37°C保温10分钟。以1 μ 1 cDNA第一链反应混合物为模板，聚合酶链式反应(PCR)扩增4CL cDNA片段，上游引物为 4CLf 1:5' -CGCCACAATGAATCCACA，下游引物为4CLrl :5' -ATGGTGCCTTGGGAATAGC。反应体系为25μ 1，其中包含2· 5μ 1 10XPCR Buffer、1. 5 μ 1 MgC12(25mM)、 0· 5 μ IdNTP mix (IOmM each)、各 1 μ 1 的上游引物 4CLfl 和下游引物 4CLrl (10 μ Μ)、 1 μ IcDNA 第一链反应混合物、0. 15 μ 1 Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1)和 17. 35 μ 1 Η20。PCR 反应程序如下95°C，5min ；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，50s, 30cycles ；72°C，IOmin0 反应结束后，取20 μ 1 PCR产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳检测，结果如图2所示，其中M为marker，泳道1为4CL cDNA扩增片段，约为1. 61Λ。三、DNA片段的电泳纯化回收采用Vitagene-DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，纯化4CL片段电泳完毕在紫外灯下切下目的条带，放在1. 5ml EP管中；加入3倍体积的凝胶熔化剂，混合后75°C温浴8分钟，期间间断混合，使凝胶彻底熔化；加0. 5倍凝胶熔化剂体积的高离液序列溶液，混合均勻；取一新的离心吸附柱，置于2ml离心管中，将上一步所得的溶液加入离心吸附柱中， 3600rpm，离心lmin，弃滤液；将离心吸附柱置回离心管中，加0. 5ml洗涤液Wl，3600rpm， 离心30s，弃滤液；将离心吸附柱置回离心管中，加0. 7ml洗涤液W2，3600rpm，离心30s，弃滤液，重复上步操作一次；将离心吸附柱置回离心管中，12000rpm离心lmin，尽量除去漂洗液；将离心吸附柱置于洁净的1. 5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25 μ 1水，室温静置 lmin, 12000rpm离心Imin洗脱DNA，得到纯化的4CL片段。四、4CL克隆及测序使用pGEM-T Easy (购自promega)载体克隆4CL片段，具体方法如下取4 μ 1纯化的4CL片段，依次加入5 μ 1 2ΧΤ4连接酶缓冲液，0. 5 μ 1 pGEM-T Easy vector (50ng/ μ 1)，0. 5 μ 1 T4DNA 连接酶(3U/ μ 1)，4°C温浴过夜。获得 4CL cDNA 片段与 pGEM-T Easy 载体的连接产物。在超净台内，将连接产物加入到50μ 1大肠杆菌DH5ci感受态细胞(购自 invitrogen,产品目录号为18265017)中，混勻，置冰上30分钟；42°C，热激90s ；冰浴 2min ；250 μ 1 LB液体培养基，37°C培养Ihr ；将150 μ 1细胞悬液混勻涂布在含100 μ g/ml Amp、X-gal (40mg/L)，IPTG(40mg/L)的LB固体培养基上，37°C避光倒置培养过夜。挑取LB平板上的白色克隆，置于:3ml LB培养基中，37°C震荡培养过夜；随后的质粒DNA提取和EcoRI限制性内切酶反应参照《分子克隆》(Cold Spring Harbor Laboratory Press, edition 1，1989)进行。电泳检测酶切片段的大小。含重组克隆的质粒经双氧法测序，获得的4CL cDNA片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，它含有完整的开放阅读框， 编码含有520个氨基酸的蛋白质(其氨基酸序列如序列表中序列幻，将其命名为4CL。将含序列表中序列1所示核苷酸序列的质粒载体命名为T-Pt4CLl。实施例2、获得表达反义4CL的转基因毛白杨一、基因工程表达载体的构建在植物双元表达载体pBI121(购自美国Clontech公司，产品目录号为6018-1)上引入SpeI和MlI限制性酶切位点，构建中间载体PBI121-M。具体地说，首先在⑶S基因片段的5'和3'端分别引入8￡ 11!11/^^1和&^1/5￡111位点，得到^5'基因片段。所用的引物为GUSf2 5' -AACTTGGATCCACTAGTTCTACACCACGCCGAACACCT-3' (BamHI/Spel)，GUSr2 5' -GCACCGAGCTCGTCGACCAGCAGCAGTTTCATCAATCACC-3' (Sacl/Sall),PCR扩增模板为双元表达载体pBI121。PCR扩增产物经BamHI和^icI双酶切后， 克隆到植物双元表达载体PBI121的BamHI和McI位点间，由GUS'基因片段替换原载体的 ⑶S全长基因，同时在⑶S'基因片段的两侧分别引入了 SpeI和MlI限制性酶切位点。中间载体PBI121-M示意图见图3。将4CL基因经McI和^CbaI反向克隆到中间载体pB1121-M上，替换原载体的⑶S ‘ 基因片段，构建好的表达载体命名为PAS4CL1。具体方法如下首先通过PCR方法在4CL基因的5'和3'端分别引入McI和^CbaI位点，所用的引物为4CLf2 5' ACTGAGCTCCAGCAAGAAGAGTTGCTTCT(SacI),4CLr2 5' TACTCTAGAATGGTGCCTTGGGAATA(XbaI)。PCR扩增模板为质粒T_Pt4CLl。PCR扩增产物经^icI和)(baI双酶切后，反向克隆到中间载体PBI121-M的^CbaI和Mel位点间，替换中间载体pBI 121-M上的⑶S‘基因片段， 得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明，序列表中序列1第180位到1568 位所示的4CL基因片段反向插入到中间重组载体pBI121-M的)(baI和McI位点间(即与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从^CbaI至 SalI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和MlI位点间)，证明质粒构建正确，将重组载体命名为植物双元表达载体PAS4CL1。植物双元表达载体PAS4CL1的示意图见图4。二、获得表达反义4CL1基因的转基因毛白杨1、植物双元表达载体pAS4CLl转化毛白杨(1)制备农杆菌感受态细胞挑取农杆菌C58(公众可从北京市农林科学院获得，记载过该材料的非专利文献是:K. -H. Han, R. Meilan，C. Ma, S. H. Strauss, An Agrobacterium tumefaciens transformation protocol effective on a variety of cottonwood hybrids(genus Populus). Plant Cell Reports,2000,19 :315-320, p316 immaterial and method”)单菌落，接种在:3ml LB培养基(含终浓度为5mg/L的四环素， 终浓度为50mg/L的利福平)中震荡培养过夜；取Iml培养物接种在100ml LB培养基中，28°C震荡培养至0D600为0. 5(约5_ ir)；用50ml聚丙烯管收集菌液，4000rpm离心 10min，4°C;弃上清液，用15ml预冷纯水(18 Ω )悬浮细胞沉淀，4000rpm离心10min，4°C;重复上步一次；弃上清液，用IOml预冷的10%甘油(18 Ω纯水配制)悬浮细胞沉淀，4000rpm 离心10min，4°C ；弃上清液，用0. 75ml (每100ml菌液)预冷的10%甘油悬浮细胞沉淀；分装在1. 5ml EP管中，每管40 μ 1，液氮冷冻后，于-80°C冰箱内保存。(2)植物双元表达载体PAS4CL1电击，转入农杆菌C58中，具体方法如下自冰箱中取出农杆菌C58电击用感受态细胞，置冰上缓慢融化；将2 μ 1质粒pAS4CLl的DNA加入到感受态细胞中，混勻，置冰上；将感受态细胞和质粒PAS4CL1的DNA混合物加入到预冷的电击杯中；2. 5kv，400 Ω，25 μ F条件下电击；迅速向电击杯加入Iml LB培养基；将电击杯中的全部溶液转移到1. 5ml EP管中，28°C温育Ihr ；4000rpm离心2分钟，弃800 μ 1上清，余 200 μ 1 ；重悬细胞，将细胞悬液混勻涂布在含5mg/L四环素、50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上；待液体完全吸收后，28°C避光倒置培养，3天可见菌落。经PCR检测阳性农杆菌转化子，获得含有植物表达载体PAS4CL1的农杆菌菌株。PCR检测所用的引物序列如下5' -CAGCAAGAAGAGTTGCTTCT 和 5 ‘ -ATGGTGCCTTGGGAATA。PCR 检测获得 1389bp 的扩增产物即为阳性农杆菌转化子。(3)毛白杨的遗传转化挑取一个新鲜的含有植物表达载体PAS4CL1的农杆菌单菌落，接种到LB液体培养基中(含终浓度为5mg/L四环素，终浓度为50mg/L利福平，终浓度为50mg/L卡那霉素)，振荡培养过夜。取Iml菌液加入新鲜40ml的LB液体培养基活化培养，280C 220rpm 振荡培养 2_3h (0D600 = 0. 4-0. 8)，待用。取当年毛白杨(Populus tomentosa)(购自宁夏莱州市兴林园艺场)的健壮无菌苗茎段切成0. 5-lcm,作为培养外植体，在预培养基(1/2MS+6-BA 0. 25mg/L+ZT0. 25mg/ L+IBA 0. 25mg/L,蔗糖20g/L)上于25 °C暗培养1_2天。然后在活化的菌液中侵染10-20分钟。取出外植体，用无菌滤纸吸干后，转入覆有一层无菌滤纸的共培养基 (1/2MS+6-BA0. 25mg/L+ZT 0. 25mg/L+IBA 0. 25mg/L，蔗糖 20g/L)中于 25°C暗培养 2-3 天， 在无菌水中洗3次，在250mg/L的头孢霉素的水溶液中洗一次，放入含卡那霉素50mg/L筛选培养基(1/2MS+6-BA 0. 25mg/L+ZT 0. 25mg/L+IBA 0. 125mg/L+抗生素，蔗糖 20g/L)中于 25°C，光照每日16小时的条件下培养。每2周继代培养一次；分化出的小芽长至1. 5-2. Ocm 后，剪取小芽置于含50mg/L筛选生根培养基(1/2MS+IBA0. 25mg/L+VB110mg/L+抗生素，蔗糖15g/L)中培养。大约一个月后，获得批量转化株系。表1 MS培养基的组成
权利要求
1.一种培育转基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁中纤维素含量提高的转基因植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸CoA连接酶为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸CoA连接酶的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因1)序列表中序列1第180位到1568位所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或幻所示的DNA分子杂交且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因；4)与1)或幻或幻的基因具有90%以上的同源性且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达是通过将4-香豆酸CoA连接酶编码基因的反义基因片段导入目的植物中实现的。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述4-香豆酸CoA连接酶编码基因的反义基因的核苷酸序列与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述降低目的植物中4-香豆酸=CoA连接酶编码基因的表达是通过将重组表达载体PAS4CL1导入目的植物中实现的；所述重组表达载体PAS4CL1是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和Mil 酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体ρΒΙ121的BamHI和McI 位点间，替换载体ΡΒΙ121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从^CbaI至McI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和McI位点间，得到的重组载体 PAS4CL1。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物为毛白杨(Populus tomentosa)。
8.一种重组表达载体，是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和Mil 酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体ρΒΙ121的BamHI和McI 位点间，替换载体ΡΒΙ121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1第180位到1568位所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从^CbaI至McI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和McI位点间，即得到的所述重组表达载体。
9.权利要求8所述的重组表达载体在提高植物细胞壁中纤维素含量中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用。其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物； 所述双子叶植物为毛白杨(Populus tomentosa)。
全文摘要
本发明公开了一种提高植物细胞壁中纤维素含量的方法。本发明提供了一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中4-香豆酸CoA连接酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁中纤维素含量提高的转基因植物。本发明通过转基因技术和反义RNA技术结合，获得4CL基因表达受到抑制的转基因杨树，转基因杨树成熟木材的细胞壁中纤维素含量显著增加，转基因植株较野生型对照植株细胞壁中纤维素含量增加了3％-7％。
文档编号A01H5/00GK102373236SQ201110359369
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月14日 优先权日2011年11月14日
发明者张中保, 张杰伟, 李云伏, 李瑞芬, 王宏芝, 陈亚娟, 魏建华 申请人:北京市农林科学院